ESTUDO COMPARATIVO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DE ALGUMAS ÁRVORES NATIVAS

COMPARATIVE STUDY ON ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF SOME NATIVE TREE EXTRACTS

RESUMO

Este estudo avaliou as atividades antimicrobianas (AA) de extratos hidro-alcoólicos, obtidos de 17 espécies de árvores nativas do Brasil. Para os ensaios de antibiose foi utilizado o método da difusão em ágar, frente a 10 diferentes microrganismos, isolados de inóculos obtidos de focos de infecções clínicas. Dos 170 testes realizados, 25% mostraram alta AA, destacando-se extratos de Bixaorellana, Psidiumguajava e Anacardium occidentale. Excepcional AA foi observada em Mimosa tenuiflora contra Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus e Staphylococcus spp. coagulase-negativa, e os extratos de Stryphnodendron adstringens e Eugenia uniflora contra Escherichia coli, Providencia spp., Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus e Staphylococcus spp. coagulase-negativa. Ensaios de antibiose com antibióticos comerciais foram realizados contra estas bactérias, com a finalidade de se comparar o potencial de AA de extratos destas árvores.

PALAVRAS-CHAVE
Atividade antimicrobiana; plantas medicinais; antibiose

ABSTRACT

This study evaluated the antimicrobial activities (AA) of hydroalcoholic extracts obtained from 17 species of native Brazilian trees. The agar diffusion method was used against 10 different microorganisms isolated from inoculi obtained from clinically infected spots, for antibiosis assay purposes. Of the 170 tested carried out, 25% exhibited high AA, with Bixa orellana, Psidium guajava and Anacardium occidentale showing the most outstanding extract qualities. Exceptional AA was observed for Mimosa tenuiflora against Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp. and Stryphnodendron adstringens, and for Eugenia uniflora extracts against Escherichia coli, Providencia spp., Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp. Antibiosis essays with commercially available antibiotics were simultaneously conducted against the above-mentioned bacteria to compare with the AA potential of the trees extracts studied.

KEY WORDS
Antimicrobial activity; medicinal plants; antibiosis

INTRODUÇÃO

O uso de extratos vegetais e fitoquímicos com fins medicinais é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. A Organização Mundial de Saúde (WHO, 1998) estima que 65-80% da população dos países em desenvolvimento dependem das plantas medicinais como única forma de acesso aos cuidados básicos de saúde.

Graças a sua atividade metabólica secundária, os vegetais superiores são capazes de produzir substâncias antibióticas, utilizadas como mecanismo de defesa contra predação por microrganismos, insetos e herbívoros (GOTLIEB, 1981). Alguns pesquisadores preferem dar a essas substâncias inibidoras, de origem vegetal, a denominação de fintocidas ou de substâncias semelhantes a antibióticos "Antibiotic Like-Substances" (GEISMANN, 1963).

Os principais grupos de compostos com propriedades antimicrobianas, extraídos de plantas incluem: terpenóides e óleos essenciais (TORSSEL, 1989); alcalóides (FESSENDEN, 1982); lectinas e polipeptídios (TERRAS et al., 1993; ZHANG & LEWIS, 1997) e substâncias fenólicas e polifenóis, que são: fenóis simples, ácidos fenólicos, quinonas (STERN et al., 1996), flavonas, flavonóis e flavonóides (FESSENDEN, 1982), tanino (SCALBERT, 1991) e cumarinas (O’KENNEDY & THORNES, 1997).

Os compostos isolados de plantas são substâncias cuja estrutura química, com raras exceções, apresentam grandes diferenças estruturais em relação aos antibióticos derivados de microrganismos. Estes agentes antimicrobianos isolados de plantas superiores podem agir como reguladores do metabolismo intermediário, ativando ou bloqueando reações enzimáticas, afetando diretamente uma síntese enzimática seja em nível nuclear ou ribossomal, ou mesmo alterando estruturas de membranas (SINGH & SHUKLA, 1984).

Entretanto, a grande maioria das plantas, normalmente empregadas como fitoterápicos populares, não tiveram suas potencialidades terapêuticas efetivamente comprovadas. Uma parcela significante destes estudos foi realizada frente a microrganismos referência sem a utilização de ensaios paralelos, utilizando-se antibióticos comerciais que pudessem fornecer parâmetros mais precisos quanto ao real potencial antimicrobiano destes extratos.

RODRIGUES (1996) cita diversas árvores nativas conhecidas pela etnofarmacologia por terem propriedades antimicrobianas e que ao mesmo tempo, podem preencher critérios de preservação ambiental e manejo auto-sustentável tais como: Anacardium occidentale (cajueiro), Pterodon emarginatus (sucupira), Copaifera langsdorffii (copaíba), Anadenanthera colubrina (angico), Myroxylon peruiferum (bálsamo-do-peru), Stryphnodendron adstringens (barbatimão), Bixa orellana (urucum), Eugenia uniflora (pitanga), Psidium guajava (goiabeira), Mimosa tenuiflora (tepezcuite), Ilex paraguariensis (erva-mate), Ocotea odorifera (sassafrás), Hymenaea courbaril (jatobá), Schinus terebinthifolia (aroeira), Genipa americana (jenipapo), Tabebuia avellanedae (ipê-roxo) e Casearia sylvestris (guaçatonga). O objetivo deste trabalho foi o de testar a AA de extratos de 17 árvores nativas do Brasil, contra microrganismos isolados de infecções clínicas. Também foram realizados ensaios de antibiose com diferentes antibióticos comerciais, visando a obtenção de parâmetros para uma avaliação mais precisa desta atividade antimicrobiana.

MATERIAIS E MÉTODOS

Plantas

Os órgãos das plantas utilizadas foram coletados em diferentes viveiros, nas vizinhanças de Iracemápolis, Limeira e Rio Claro, SP, Brasil, sendo confirmada a identificação no Departamento de Botânica do IB da Unesp-Rio Claro, SP. As 17 espécies vegetais, distribuídas em famílias, nome local e órgãos testados, estão tabuladas na Tabela 1.

Tabela 1
Espécie da planta, família, nome local e parte testada.

Espécie vegetal	Família	Nome local	Órgão testado
Anacardium occidentale L	Anacardiaceae	Cajueiro	Castanha de caju
Pterodon emarginatus Vogel	Fabaceae	Sucupira	Fruto-sâmara
Copaifera langsdorffii Desf.	Caesalpiniaceae	Copaíba	Casca do tronco
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan	Mimosoideae	Angico	Casca do tronco
Myroxylon peruiferum L. F.	Fabaceae	Bálsamo-do-peru	Casca do tronco
Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville	Mimosoideae	Barbatimão	Casca do tronco
Bixa orellana L.	Bixaceae	Urucum	Sementes
Eugenia uniflora L.	Myrtaceae	Pitangueira	Fruto
Psidium guajava L.	Myrtaceae	Goiabeira	Folhas
Mimosa tenuiflora Willd.	Leguminosae	Tepezcuite	Casca do tronco
Ilex paraguariensis A. St.-Hil.	Aquifoliaceae	Erva-mate	Folhas
Ocotea odorífera (Vell.) Rohwer	Lauraceae	Sassafrás	Casca do tronco
Hymenaea courbaril L.	Caesalpiniaceae	Jatobá	Casca do tronco
Schinus terebinthifolia Raddi	Anacardiaceae	Aroeira	Casca do tronco
Genipa americana L.	Rubiaceae	Genipapo	Fruto
Tabebuia avellanedae Lor. ex. Griseb	Bignoniaceae	Ipê-roxo	Casca do tronco
Casearia sylvestris Sw.	Flacourtiaceae	Guaçatonga	Folhas

Preparo dos Extratos

Para o preparo dos extratos hidro-alcoólicos seguiuse a orientação do processo A da farmacopéia brasileira (DIAS DA SILVA, 1929), adaptado por YOUNES et al. (2000), onde a secagem do material vegetal foi inicialmente realizada à temperatura ambiente e completada em estufa a 50° C até obter-se um teor-padrão de umidade de 20%. O material foi moído em moinho de grãos e misturou-se o pó resultante com solução hidro-alcoólica (etanol 70%), na proporção de 10% (m.v^-1). Estocou-se essa solução à temperatura ambiente, protegida da luz, por um período de 25 dias, procedendo-se em seguida a filtragem do material. A partir da solução filtrada, produziu-se o extrato, com auxílio de roto-evaporador a 50° C retirando-se todo o solvente. O evaporado final recebeu o nome de "extrato hidro-alcoólico" do órgão da planta estudada a 10% e foi testado.

Padronização do Inóculo e Semeadura

Os inóculos foram obtidos de infecções clínicas, sendo coletados com swab de algodão estéril. Dez diferentes microrganismos foram isolados de diferentes focos infecciosos: Escherichia coli (infecção intrabdominal), Enterobacter aerogenes (ferida na região do osso ilíaco), Streptococcus pyogenes (infecção de orofaringe), Klebsiella pneumoniae (secreção pulmonar), Providencia spp. (ferida em MMII), Proteus mirabilis (infecção intrabdominal), Pseudomonas aeruginosa (ferida em MMII), Shigella sonnei (fezes), Staphylococcus aureus (infecção de MMII) e Staphylococcus spp. coagulase – (secreção de conjuntivite), sendo inoculados em nutriente ágar para serem desenvolvidas por 24h à temperatura de 35° C. Após este período foram ressuspensas em solução fisiológica 0,9% (p/v) até obter-se uma turvação equivalente ao padrão 0,5 da escala de Mac Farland, o que corresponde aproximadamente a 1,5 x 10⁶ UFC/mL. Uma alíquota de 100mL dessa suspensão foi semeada em placas de Petri contendo 15 mL do meio Mueller-Hinton ágar, com uma espessura de aproximadamente 4 mm (SHADOMY & SPNEL-INGROF, 1980).

Ensaios de Antibiose

Para a avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos hidro-alcoólicos foi empregado o método da difusão em ágar, baseado na técnica descrita por BAUER et al. (1966), utilizando discos de papel de filtro Framex 389 faixa preta estéreis com 6 mm de diâmetro. Os discos receberam 100 mL dos extratos hidro-alcoólicos de cada planta, foram mantidos em estufa à temperatura de 35° C por 24h para a secagem e posteriormente foram acondicionados em recipientes estéreis, devidamente identificados e armazenados em geladeira a 5,4° C. Após as semeaduras dos microrganismos nas placas de Petri, os discos com os extratos hidro-alcoólicos e os discos com os antibióticos comerciais (variável de acordo com a espécie bacteriana) foram distribuídos e pressionados sobre o ágar. Foi mantida uma distância de 40 mm entre os discos para evitar interferências entre os possíveis halos de inibição. Após este procedimento, as placas foram fechadas com tampa, invertidas e incubadas a 35° C. Após 24h de incubação foi realizada a leitura dos resultados, que consistiu na medição do diâmetro dos halos de inibição, incluindo o próprio disco de 6 mm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 2 estão sumarizados os resultados dos ensaios de antibiose e na Tabela 3 os resultados dos testes de controle de antibióticos comerciais com relação a cada microrganismo.

Tabela 2
Resultados da AA de 17 extratos de árvores nativas do Brasil, frente a 10 diferentes microrganismos.

Espécie vegetal	Ec	Ea	Sp	Kp	Ps	Pm	Pa	Ss	Sa	St-
A. occidentale	R	R	R	R	R	S18	R	S18	S24	S12
P. emarginatus	R	R	R	R	R	S26	R	R	R	R
C. langsdorffii	R	R	R	R	R	S9	R	S14	R	R
A. colubrina	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R
M. peruiferum	R	R	S9	R	R	R	R	S12	R	S9
S. adstringens	S9	R	S28	R	S11	S30	R	S30	S20	S16
B. orellana	R	R	S16	R	R	S22	R	R	S22	R
E. uniflora	S14	R	S28	R	S12	S32	R	S34	S24	S14
P. guajava	R	R	S16	R	R	S28	R	R	S21	R
M. tenuiflora	R	R	S24	R	R	S33	R	S20	S23	S12
I. paraguariensis	R	R	R	R	R	R	R	S14	S24	S10
O. odorifera	R	R	R	R	R	R	R	R	S22	R
H. courbaril	R	R	R	R	R	S28	R	R	S23	R
S. terebinthifolia	R	R	R	R	R	R	R	R	S24	R
G. americana	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R
T. avellanedae	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R
C. sylvestris	R	R	R	R	R	R	R	R	R	R

• Ec=Escherichia coli, Ea=Enterobacter aerogenes, Sp=Streptococcus pyogenes, Kp=Klebsiella pneumoniae, Ps=Providencia spp., Pm=Proteus mirabilis, Pa=Pseudomonas aeruginosa, Ss=Shigella sonnei, Sa=Staphylococcus aureus, St-=Staphylococcus spp. coagulase -, R=resistente (não houve desenvolvimento do halo de inibição), S=sensível (houve desenvolvimento do halo de inibição) em mm, incluindo o próprio disco de 6 mm.

Tabela 3
Resultados dos testes de controle de antibióticos comerciais com relação a cada microrganismo.

Microorganismo	Controle Resistente	Controle Sensível*
Ec Escherichia coli	AMP, CFL.	ATM, IPM, CIP.
Ea Enterobacter aerogenes	CFL, AMP, CFO.	IPM, GEN, CRO.
Sp Streptococcus pyogenes	ERI, SFT.	VAN, LVX, CRO.
Kp Klebsiella pneumoniae	AMP, SFT, TET.	GEN, CIP, LVX.
Ps Providencia spp.	TET, CFL.	CIP, CRO, GEN.
Pm Proteus mirabilis	AMP, CFL, TET.	AMI, IPM, GEN.
Pa Pseudomonas aeruginosa	AMP, CLO, SFT.	CAZ, IPM, RIF.
Ss Shigella sonnei	AMP.	LVX, CIP, CRO
Sa Staphylococcus aureus	ERI, SFT.	VAN, RIF, TET.
St- Staphylococcus spp. coagulase-	PEN, SFT.	CIP, LVX, VAN.

• AMP=(ampicilina 10 g), CFO=(cefoxitina 30 g), CFL=(cefalotina 30 g), TET=(tetraciclina 30 g), CLO=(cloranfenicol 30 g), SFT=(sulfazotrim 25 g), CIP=(ciprofloxacina 5 g), ERI=(eritromicina 15 g), PEN=(penicilina G 10 g), IPM=(imipinem 10 g), GEN=(gentamicina 10 g), CRO=(ceftriaxona 30 g), AMI=(amicacina 30 g), ATM=(aztreonam 30 g), CAZ=(ceftazidima 30 g), RIF=(rifampicina 5 g), VAN=(vancomicina 30 g), LVX=(levofloxacina 5 g). Controle Resistente (não houve desenvolvimento do halo de inibição), Controle Sensível (houve desenvolvimento do halo de inibição), variável de acordo com o antibiótico utilizado. *Medidas padrões em mm dos halos de inibição de antibióticos comerciais no teste de controle sensível ATM(20), IPM(15), CIP(18), GEN(15), CRO(20), VAN(17), LVX(16), AMI(17), CAZ(18), RIF(30), TET(18).

Apesar dos relatos na literatura consultada indicarem uma evidente atividade antimicrobiana (AA) de extratos hidro-alcoólicos das espécies Anadenanthera colubrina (MORS et al., 2000), Genipa americana (GARNACCIA, 1972), Tabebuia avellanedae (OLIVEIRA et al., 1990) e Casearia sylvestris (BASILE, 1990), nos resultados aqui obtidos (Tabela 2), não foi observada ação antibacteriana dos extratos destas plantas. Todos os microrganismos utilizados neste estudo apresentaram resistência a alguns antibióticos comerciais (Tabela 3), sugerindo que sejam também resistentes aos extratos destas plantas. As linhagens de bactérias, empregadas nos estudos encontrados na literatura não tiveram suas resistências testadas contra antibióticos comerciais, o que dificulta uma comparação mais acurada entre estes resultados discrepantes.

O extrato de Pterodon emarginatus apresentou AA somente contra Proteus mirabilis, e os de Ocotea odorifera e Schinus terebinthifolia apresentaram AA somente contra Staphylococcus aureus. Os extratos destas plantas são conhecidos por apresentarem atividade antimicrobiana também contra Pseudomonas (BANDEIRA & WANICK, 1974), o que não foi confirmado nos resultados da Tabela 2.

Dois extratos apresentaram AA contra dois microrganismos, o de Hymenaea courbaril apresentou AA contra Proteus mirabilis e Staphylococcus aureus e o de Copaifera langsdorffii apresentou AA contra Proteus mirabilis, e Shigella sonnei. Hymenaea courbaril é conhecida por conter terpenos e compostos fenólicos com comprovada propriedade antimicrobiana (MARSAIOLI, 1975). O segundo extrato, o de Copaifera langsdorffii, é referido na literatura como tendo ação também contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus (EL NUNZIO, 1985), o que não se confirmou nos resultados da Tabela 2, onde estes dois últimos microrganismos mostraram-se resistentes.

Alguns extratos apresentaram maior amplitude de AA, como é o caso de Myroxylon peruiferum que apresentou atividade contra Streptococcus pyogenes, Shigella sonnei e Staphylococcus aureus ; e o extrato de Ilex paraguariensis que inibiu os microrganismos Shigella sonnei, Staphylococcus aureus e Staphylococcus spp. coagulase; Estas atividades não estão descritas em nenhuma das referências consultadas.

O extrato de Bixa orellana apresentou AA contra Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis e Staphylococcus aureus, embora recentes dados da literatura não tenham constatado AA deste extrato contra estas bactérias (ALMEID’A ALVES et al., 2000). Já a atividade do extrato de Psidium guajava, citado como sensível para Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans (HOLETZ et al., 2002; GNAN & DEMELLO, 1999), apresentou nos resultados da Tabela 2, sensibilidade frente a Streptococcus pyogenes, Proteus mirabilis e Staphylococcus aureus, não sendo constatado ação contra a Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.

A AA do extrato de Anacardium occidentale confirmou plenamente os dados obtidos na literatura (LORENZI, 1992), inibindo o crescimento de Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus e Staphylococcus spp. coagulase.

Alta AA foi obtida com o extrato de Mimosa tenuiflora. Citado na literatura por apresentar atividade contra Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. (HEINRICH et al., 1992), além da confirmação destes resultados (Tabela 2), também apresentou AA contra Proteus mirabilis e Shigella sonnei.

Comparativamente aos demais extratos, dois mostraram maior AA, o extrato de Stryphnodendron adistringens, que na literatura consultada é referido por apresentar atividade contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa (ALMEIDA ALVES et al., 2000), teve os resultados confirmados contra Escherichia coli, bem como contra Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp. coagulase, Streptococcus pyogenes, Providencia spp., Proteus mirabilis e Shigella sonnei, porém, não inibiu o crescimento de Pseudomonas aeruginosa. Outro extrato que apresentou alta AA foi o de Eugenia uniflora, que também é citado na literatura como tendo atividade contra Streptococcus, Escherichia coli, e Bacillus cereus e resistência a Pseudomonas aeruginosa (ALMEIDA ALVES et al., 2000). Nos dados da Tabela 2 estão confirmados nos resultados com atividade contra Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Providencia spp., Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus e Staphylococcus spp. coagulase, confirmando também a ausência de inibição de Pseudomonas aeruginosa. Em um outro estudo mais recente foi demonstrado a atividade da Eugenia uniflora contra Staphylococcus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Candida albicans e inclusive, contra Pseudomonas aeruginosa (HOLETZ et al., 2002).

De todos os microrganismos utilizados neste trabalho, três mostraram total resistência aos extratos das 17 espécies de plantas estudadas: Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa.

CONCLUSÃO

Neste estudo preliminar de AA, obteve-se relevante número de plantas com comprovada AA. Certamente os resultados obtidos com os extratos de algumas destas árvores corroboram os seus usos como antimicrobianos em terapêutica popular. Entretanto, é possível também constatar que alguns microrganismos são resistentes a todos estes extratos, o que torna inócua a utilização destas plantas frente a uma infecção por estes microrganismos resistentes. A continuidade deste estudo, que está sendo realizado com o emprego de extratos de demais árvores nativas e com microrganismos oriundos de um leque mais amplo de infecções, deverá fornecer resultados que indiquem de maneira mais precisa, a real aplicabilidade destes extratos.

O melhor conhecimento da atividade antimicrobiana destas plantas, certamente propiciaria um impulso, tanto direto como indireto, para a melhora nas condições de vida de populações de países em desenvolvimento, considerando-se a importância das plantas medicinais, não apenas como recurso terapêutico, mas também como fonte de recursos econômicos (DI STASI et al., 1996).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Abr 2022
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2005

Histórico

• Recebido
  10 Set 2005
• Aceito
  29 Set 2005