Germinação in vitro de eixos embrionários zigóticos de imbuia (ocotea porosa (NEES EX MARTIUS) Liberato Barroso)

In vitro germination of zygotic embryonic axes of imbuia (Ocotea porosa (NEES EX MARTIUS) liberato barroso

Luciana Luiza Pelegrini^I; Luciana Lopes Fortes Ribas^II; Flávio Zanette^III; Henrique Soares Koelher^III

^IUniversidade Tecnológica Federal do Paraná, UTFPR, Campus Pato Branco, Brasil. E-mail:<[e-mail]>

^IIDepartamento de Botânica, Universidade Federal do Paraná, UFPR, Brasil. E-mail:<[e-mail]>

^IIIDepartamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, Universidade Federal do Paraná, UFPR, Brasil. E-mail: e <[e-mail]><[e-mail]>

RESUMO

A imbuia apresenta sementes recalcitrantes, com forte dormência tegumentar, irregularidade e baixa germinação, dificultando sua propagação natural. O objetivo deste trabalho foi avaliar a germinação in vitro de eixos embrionários de imbuia, testando o efeito de diferentes concentrações de sacarose, de carvão ativado e de formulações salinas para acelerar a produção de mudas. Eixos embrionários zigóticos foram inoculados em meio de cultura MS/2 contendo diferentes concentrações de sacarose (15, 30, 60 ou 90 g L^-1), de carvão ativado (0, 1, 2 ou 3 g L^-1) e diferentes formulações salinas (MS, WPM, MS/2 ou WPM/2). Os resultados indicaram que a adição de 15 g L^-1 de sacarose foi insuficiente para promover a germinação dos eixos embrionários e as demais concentrações promoveram entre 45,5 e 59,4% de germinação. Com relação às formulações salinas, os melhores resultados foram obtidos com os meios de cultura MS e MS/2 obtendo-se 67,7 e 74,2% de germinação, respectivamente. A adição de carvão ativado favoreceu a germinação in vitro dos eixos embrionários, enquanto que na ausência de carvão ativado não ocorreu germinação e houve elevada porcentagem de oxidação. A germinação in vitro de imbuia é viável e pode ser obtida com eixos embrionários zigóticos maduros com a formulação salina MS/2, suplementada com 30 g L^-1 de sacarose e 1g L^-1 de carvão ativado.

Palavras-chave: Sacarose, Meio de cultura, Carvão ativado.

ABSTRACT

Imbuia has recalcitrant seeds with strong tegumental dormancy, irregular and low germination, which impair natural propagation. The objective of this study was to evaluate the in vitro germination of imbuia embryonic axes by testing the effect of different concentrations of sucrose, activated charcoal and salt formulations in order to accelerate the production of plants. Zygotic embryonic axes were inoculated in MS/2 culture medium with different concentrations of sucrose (15, 30, 60 or 90 g L^-1), of activated charcoal (0, 1, 2 or 3 gL^-1) and in different salt formulations (MS, WPM, MS/2 or WPM/2). The results indicated that the addition of 15 g L^-1 sucrose was not enough to promote germination of embryonic axes and the other concentrations promoted between 45.5 and 59.4% germination. The best results were observed with MS and MS/2 salt formulations obtained 67.7 and 74.2% of germination respectively. The addition of activated charcoal to the media favored the in vitro germination of zygotic embryonic axes, while oxidation of the embryo tissues occurred in media without activated charcoal and germination did not happen. The in vitro germination of imbuia can be achieved with the MS/2 salt formulation supplemented with 30 g L^-1 sucrose and 1 g L^-1 of activated charcoal.

Keywords: Sucrose, Culture medium, Activated charcoal.

1. INTRODUÇÃO

Ocotea porosa (Nees ex Martius) Liberato Barroso é uma espécie florestal da família Lauraceae, conhecida como imbuia, de ocorrência na Floresta Ombrófila Mista (FOM) (Floresta com Araucária). Possui madeira de excelente qualidade mundialmente apreciada, sendo exportada em grande quantidade para fabricação de mobiliário de luxo, construção civil, marcenaria, carpintaria (CARVALHO, 2003). A FOM foi alvo de intensa exploração pela indústria madeireira de duas espécies a Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze e Ocotea porosa (Nees ex Martius) Liberato Barroso, levando à quase exaustão dos recursos naturais (CALDATO et al., 1999). Além disso, outro fator que contribuiu para a redução da FOM foi o desmatamento para a expansão da agricultura (RONDON NETO et al., 2002). Como consequência disso, essa espécie sofreu acelerada erosão genética na área de ocorrência natural, sendo incluída na lista de espécies ameaçadas de extinção (CARVALHO, 2003).

A propagação natural da imbuia é difícil, pelo fato de suas sementes serem recalcitrantes e apresentarem forte dormência tegumentar, irregularidade na germinação e baixa viabilidade (CARVALHO, 2003). Outro fator limitante é a propagação via estacas. Inoue e Putton (2007) relataram que a imbuia possui pouca resposta no enraizamento de estacas (4%). Dessa forma, estudos relacionados com a germinação in vitro dessa espécie são importantes para maximizar a taxa de germinação superando as dificuldades naturais de propagação, bem como para obter plântulas com qualidade genética e fitossanitária adequadas.

Na literatura não há trabalhos relatando a germinação in vitro da imbuia. Porém, com outras espécies da família Lauraceae já foram realizados estudos com a germinação in vitro de embriões zigóticos maduros de pau-rosa (Aniba roseadora Ducke) (HANDA et al., 2005; LIMA et al., 2008) e imaturos de canela-sassafrás (Ocotea odorifera Mez) (SANTA-CATARINA et al., 2001), diminuindo com isso o tempo para obtenção de mudas quando comparado com o processo natural. Assim, devido aos problemas encontrados na propagação natural de imbuia e também pela sua importância econômica e ecológica, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes concentrações de sacarose e formulações salinas, bem como a adição de carvão ativado na germinação in vitro de eixos embrionários de imbuia.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados frutos maduros (coloração violácea escura a preta) e imaturos (coloração verde), coletados na primeira semana de abril de 2006, na localidade de Colombo, PR, medindo entre 1,2 e 1,7 cm de diâmetro. Os frutos foram despolpados manualmente, as sementes foram lavadas e colocadas em local com insolação direta por cerca de 2 h para romper o tegumento (escarificação solar). Em câmara de fluxo laminar, as sementes foram submetidas à desinfestação com solução de etanol 70% por 5 min, seguida de imersão em solução de 1,5 ou 2,0% de hipoclorito de sódio (NaOCl), acrescido de 0,1% de Tween^® 20, por 20 min, em agitação. Em seguida, as sementes foram lavadas seis vezes em água destilada e esterilizada.

Efeito da sacarose - os eixos embrionários imaturos foram inoculados em meio de cultura MS/2 (MS com os sais reduzidos pela metade) (MURASHIGE; SKOOG, 1962), suplementado com quatro concentrações de sacarose (15, 30, 60 e 90 g L^-1), carvão ativado (1 g L^-1) e ágar Micromed^® (6 g L^-1). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro tratamentos, quatro repetições e três frascos por parcela, possuindo quatro explantes cada frasco.

Efeito das formulações de sais - Os eixos embrionários maduros foram inoculados em diferentes formulações de sais de meio de cultura MS, Woody Plant Medium (WPM LLOYD; MCCOWN, 1980), MS/2 e WPM/2 (MS e WPM com os sais reduzidos pela metade), suplementados com sacarose (30 g L^-1), carvão ativado (2 g L^-1) e ágar BBL^® (5,5 g L^-1). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro tratamentos, cinco repetições e cinco frascos por parcela, e cada frasco possuía quatro explantes.

Efeito do carvão ativado os eixos embrionários maduros foram inoculados em meio de cultura MS/2 (MS com a concentração de sais reduzida pela metade), suplementado com sacarose (30 g L^-1), carvão ativado (0, 1, 2 e 3 g L^-1) e ágar BBL^® (5,5 g L^-1). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro tratamentos, cinco repetições e cinco frascos por parcela, e cada frasco possuía quatro explantes.

A avaliação da porcentagem de germinação e de eixos embrionários oxidados foi realizada após 60 dias de cultivo. Os eixos embrionários contaminados por fungos ou bactérias foram descartados. Foram considerados germinados os eixos embrionários que apresentaram emissão da radícula (0,2 a 0,4 cm de comprimento).

Condições de cultivo - O pH dos meios de cultura foi ajustado para 5,8 com NaOH 0,1 N ou HCl 0,1 N, antes da autoclavagem. Os meios de cultura foram autoclavados a 121 ºC, durante 20 min. Foram utilizados frascos com 7 cm de diâmetro e 15 cm de altura contendo 40 mL de meio de cultura e fechados com tampas de polipropileno. As culturas foram mantidas em sala de crescimento na ausência de luz por sete dias e, posteriormente, transferidas para sala de crescimento com temperatura de 25±2 °C (dia) e 18±2 °C (noite) com fotoperíodo de 16 h e intensidade luminosa de 40 µmol m^-2 s^-1.

A análise estatística foi realizada com os dados originais, uma vez que atingiram os pressupostos de homogeneidade de variâncias. Os dados foram submetidos ao teste de Bartlett, seguido de análise de variância (ANOVA), e a comparação das médias foi feita pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa estatístico MSTATC.

3. RESULTADOS

As maiores porcentagens de germinação foram obtidas em meio de cultura contendo 30, 60 e 90 g L^-1 de sacarose, obtendo-se 45,5; 56,3; e 59,4% dos eixos embrionários germinados, respectivamente. Quando o meio de cultura foi acrescido de 15 g L^-1 de sacarose, apenas 10,4% dos eixos embrionários germinaram, o qual diferiu da maior concentração de sacarose (90 g L^-1) (Figura 1). Não se constatou oxidação dos eixos embrionários na maioria dos explantes, porém quando ocorreu ela foi muito baixa (5,7%) e apenas na concentração de 30 g L^-1 de sacarose (dados não apresentados).

Figura 1
- Efeito de diferentes concentrações de sacarose na germinação in vitro de eixos embrionários de imbuia (Ocotea porosa (Nees ex Martius) Liberato Barroso), após 60 dias de cultivo. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

Figure 1 - Effect of different concentrations of sucrose on in vitro germination of embryonic axes of Imbuia ( Ocotea porosa (Nees ex Martius) Liberato Barroso), after 60 days of cultivation. Means followed by the same letter do not differ among each other by the Tukey test at 5% probability.

As formulações salinas dos meios de cultura MS e MS/2 proporcionaram as maiores porcentagens de eixos embrionários germinados (67,7 e 74,2%, respectivamente), os quais foram superiores (p>0,05) às formulações dos meios de cultura WPM e WPM/2, na germinação in vitro dessa espécie (Figura 2).

Figura 2
- Efeito de diferentes formulações salinas na germinação in vitro de eixos embrionários de imbuia (Ocotea porosa (Nees ex Martius) Liberato Barroso), após 60 dias de cultivo. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

Figure 2 - Effect of different salt formulations in in vitro germination of embryonic axes of Imbuia ( Ocotea porosa (Nees ex Martius) Liberato Barroso), after 60 days of cultivation. Means followed by the same letter do not differ from each other by the Tukey test at 5% probability.

A germinação in vitro dos eixos embrionários de imbuia foi favorecida pela adição de carvão ativado no meio de cultura (1, 2 ou 3 g L^-1), no entanto não houve diferença (p>0,05) entre as porcentagens de germinação. No meio de cultura sem carvão ativado (controle) não houve germinação após 60 dias (Figura 3); além disso, foi constado que 45% dos eixos embrionários oxidaram (dados não apresentados).

Figura 3
- Efeito de diferentes concentrações de carvão ativado na germinação in vitro de eixos embrionários de imbuia (Ocotea porosa (Nees ex Martius) Liberato Barroso), após 60 dias de cultivo. Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

Figure 3 - Effect of different concentrations of activated charcoal on in vitro germination of embryonic axes of Imbuia ( Ocotea porosa (Nees ex Martius) Liberato Barroso), after 60 days of cultivation. Means followed by the same letter do not differ from each other by the Tukey test at 5% probability.

4. DISCUSSÃO

Neste trabalho, provavelmente a baixa porcentagem de germinação obtida com 15 g L^-1 de sacarose tenha se devido ao fato de os eixos embrionários estarem imaturos, necessitando de concentrações mais elevadas de carboidratos no meio de cultura para favorecer a germinação (Figura 1). Essa necessidade de concentrações mais elevadas de sacarose para promover a germinação dos eixos embrionários está de acordo com o proposto por Hu e Ferreira (1998). Esses autores relataram que os embriões imaturos, por serem heterotróficos, requerem entre 8 e 12% de sacarose no meio de cultura, ao passo que embriões maduros podem germinar e crescer em meio de cultura com concentrações inferiores de sacarose (2 a 3%).

Concentrações mais elevadas de sacarose (30 a 90 g L^-1) promoveram maiores porcentagens de germinação de imbuia (45,5; 56,3; e 59,4%). Handa et al. (2005) relataram para o pau-rosa (A. roseadora Ducke), também da família Lauraceae, que com a adição de concentração mais elevada de sacarose no meio de cultura (50 g L^-1) proporcionou maior porcentagem de germinação (53%).

A baixa porcentagem de embriões oxidados (5,7%) se deveu, provavelmente, à adição do carvão ativado no meio de cultura, por estar associado à adsorção de substâncias fenólicas liberadas pelo explante ou compostos do meio de cultura, as quais provocam a oxidação dos embriões, conforme citado por George et al. (2008).

No experimento em que foram testadas diferentes formulações de sais, os meios de cultura MS e MS/2 foram os mais efetivos na germinação dos eixos embrionários de imbuia, com média de 70% de germinação, após 60 dias. Resultado inferior (48% de germinação) foi obtido de sementes de mogno (Swietenia macrophylla King), também cultivado em meio MS (COUTO et al., 2004). Provavelmente, a maior germinação deve-se ao fato de a formulação de sais do meio de cultura MS conter altas concentrações de amônio e nitrato (20 mM de NH₄⁺ e 40 mM de NO₃^-) (GEORGE, 1996), enquanto a formulação do meio de cultura WPM é mais diluída e apresenta menor concentração de nitrogênio, potássio e menor força iônica total, além de conter 25% das concentrações de íons nitrato e amônio do meio de cultura MS (HARRY; THORPE, 1994). Essas diferenças nas concentrações de sais entre MS e WPM foram fundamentais, pois a germinação in vitro dos eixos embrionários dessa espécie foi melhor quando se utilizaram os meios de cultura MS e MS/2. Segundo Stein et al. (2007), estudos com meios de cultura que favoreçam a germinação in vitro de espécies recalcitrantes são importantes, tanto para maximizar a taxa de germinação quanto para obter plântulas uniformes com qualidade genética e fitossanitária adequada. A germinação in vitro da imbuia também pode diminuir a irregularidade da germinação, ocasionada pela dormência e recalcitrância das sementes, uma vez que se obteve, após 60 dias de cultivo, uma porcentagem média de 74,2% em meio de cultura MS/2. Estudos realizados com a germinação ex vitro de imbuia evidenciaram que a porcentagem de sementes germinadas foi de 71% (KALIL-FILHO et al., 2004) e de 92,5% (TONIN; PEREZ, 2006), porém o tempo de ocorrência da germinação foi de 200 e 270 dias, respectivamente, após a semeadura. Dessa forma, esses resultados, quando comparados aos obtidos neste trabalho, indicaram que a germinação in vitro pode ser boa alternativa para acelerar a produção de mudas dessa espécie.

A adição de carvão ativado estimulou a germinação de eixos embrionários de imbuia, pois na sua ausência não ocorreu germinação. Santa-Catarina et al. (2001) também obtiveram resultados positivos na germinação de embriões zigóticos de canela-sassáfras (O. odorifera Mez), obtendo 78,5% de germinação em meio de cultura contendo 1,5 g L^-1 de carvão ativado. Com a mangabeira (Hancornia speciosa Gomez), a adição de 2 g L^-1 de carvão ativado também foi eficiente na germinação in vitro, proporcionando 100% de germinação (LÉDO et al., 2007).

Como a imbuia é uma espécie lenhosa, a liberação dos compostos fenólicos pelos eixos embrionários no meio de cultura, sem a adição de carvão ativado, causou a oxidação desses, o que pode ter inibido a germinação e crescimento in vitro. Assim, pode-se considerar que a adição de carvão ativado no meio de cultura é essencial para promover a germinação dos eixos embrionários por prevenir a oxidação dos compostos fenólicos e, consequentemente, a sua necrose e morte.

Segundo Pan e Van-Staden (1998), o carvão ativado adsorve os exsudatos liberados pelos explantes, evitando a oxidação fenólica. Um período na ausência de luz tem sido considerado fator que pode contribuir para a prevenção da oxidação fenólica, como foi constatado por Marks e Simpson (1990). A adição de antioxidantes no meio de cultura e a redução da concentração de sais também podem minimizar os efeitos da oxidação dos explantes causados pela liberação de compostos fenólicos (CALDAS et al., 1998). No entanto, nesse experimento os eixos embrionários foram mantidos por sete dias na ausência de luz, os sais do meio de cultura foram reduzidos pela metade (MS/2) e, mesmo assim, não foi suficiente para evitar a oxidação da imbuia, salientando mais uma vez a eficiência do carvão ativado no meio de cultura, para germinação in vitro de eixos embrionários zigóticos de imbuia.

De forma geral, a germinação in vitro permite acelerar a produção de mudas dessa espécie e superar as dificuldades de germinação natural devido à dormência tegumentar que as sementes apresentam. Embora a cultura de embriões in vitro seja técnica já bem estabelecida, ela possibilita a obtenção de maior número de plantas em menor tempo, em comparação com a germinação natural, pois, além da dormência e recalcitrância das sementes dessa espécie, a germinação é irregular. As mudas obtidas por meio da germinação in vitro podem ser utilizadas como fontes de explantes para o desenvolvimento de protocolo de micropropagação dessa espécie.

5. CONCLUSÃO

A germinação in vitro de eixos embrionários maduros de imbuia pode ser obtida em meio de cultura MS/2 suplementado com 30 g L^-1 de sacarose e 1 g L^-1 de carvão ativado.

6. AGRADECIMENTOS

À Professora Dra. Marguerite Quoirin, pelas sugestões na redação do manuscrito; e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela concessão da bolsa de mestrado.

7. REFERÊNCIAS

Recebido em 02.02.2011

Aceito para publicação em 05.04.2013.

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Germinação in vitro de eixos embrionários zigóticos de imbuia (ocotea porosa (NEES EX MARTIUS) Liberato Barroso)

In vitro germination of zygotic embryonic axes of imbuia (Ocotea porosa (NEES EX MARTIUS) liberato barroso

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Jun 2013
• Data do Fascículo
  Abr 2013

Histórico

• Recebido
  02 Fev 2011
• Aceito
  05 Abr 2013