Multiplicação in vitro de clones híbridos de Eucalyptus globulus

In vitro multiplication of hybrid clones of Eucalyptus globulus

Multiplicação in vitro de clones híbridos de Eucalyptus globulus

In vitro multiplication of hybrid clones of Eucalyptus globulus

Silvano Rodrigues Borges^I; Aloisio Xavier^II; Leandro Silva de Oliveira^III; Aline Pontes Lopes^IV; Wagner Campos Otoni^V

^IDoutorando do Programa de Pós-Graduação em Solos e Nutrição de Plantas, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. E-mail: <[e-mail]>

^IIDepartamento de Engenharia Florestal, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. E-mail: <[e-mail]>

^IIIMestrando do Programa de Pós-Graduação em Ciência Florestal, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. E-mail: <[e-mail]>

^IVGraduando em Engenharia Florestal, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. E-mail: <[e-mail]>

^VDepartamento de Biologia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. E-mail: <[e-mail]>

RESUMO

O presente estudo teve como objetivos avaliar a resposta de clones híbridos de Eucalyptus globulus nos meios de cultura MS e JADS durante a fase de multiplicação in vitro. Os explantes foram provenientes da fase de estabelecimento in vitro de 21 clones de Eucalyptus urophylla x E. globulus, sendo 11 clones com três introduções in vitro, e de seis clones de Eucalyptus grandis x E. globulus, sendo dois clones com três introduções. Os clones foram subcultivados mensalmente nos meios de cultura MS e JADS, com 0,5 mg L^-1 de BAP (6-benzilaminopurina) e 0,01 mg L^-1 de ANA (ácido naftalenoacético). Concluiu-se que: houve tendência de maiores taxas de multiplicação no meio MS; a maioria dos clones se estabeleceu na fase de multiplicação in vitro, enquanto alguns clones se mostraram recalcitrantes nesta fase da micropropagação; a taxa de multiplicação apresentou tendência de aumento nos primeiros subcultivos e posterior queda para a maioria dos clones.

Palavras-chave: Meio de cultura, Propagação in vitro e Micropropagação.

ABSTRACT

The present study aimed to evaluate the response of hybrid Eucalyptus globulus clones in MS and JADS culture media during the in vitro multiplication phase. The explants were originated from the in vitro establishment phase of 21 Eucalyptus urophylla x E. globulus clones, being 11 clones with three in vitro introductions, and of six Eucalyptus grandis x E. globulus clones, being two clones with three introductions. The clones were subcultivated monthly in MS and JADS culture media, with 0.5 mg L-1 of BAP (6-benzylaminopurine) and 0.01 mg L-1 of NAA (naphthaleneacetic acid). It was concluded that: the MS culture medium was superior in terms of the multiplication rate; most of the clones were established in the in vitro multiplication phase, whereas some clones appeared recalcitrant in this phase of the micropropagation; the multiplication rate presented a tendency to increase in the first subcultures with a subsequent fall for most of the clones.

Keywords: Culture medium, In vitro propagation and Micropropagation.

1. INTRODUÇÃO

Recentemente tem crescido o interesse da indústria de papel e celulose pelo Eucalyptus globulus, sobretudo pelos significativos ganhos em qualidade da madeira (CARDOSO, 2002; XAVIER et al., 2007; ASSIS e MAFIA, 2007). Os plantios da espécie têm-se restringido a regiões de clima temperado devido às suas exigências edafoclimáticas (ELDRIDGE et al., 1993). Nas regiões tropicais, a hibridação com outras espécies do gênero tem sido a alternativa encontrada para melhorar a adaptação ambiental da espécie e aproveitar as características tecnológicas da madeira, além de maior facilidade de propagação vegetativa, entre outras vantagens (ALFENAS et al., 2004).

O Eucalyptus globulus é reconhecidamente recalcitrante ao enraizamento de estacas, especialmente no que envolve material adulto, dificultando o aproveitamento dos benefícios da clonagem (ALFENAS et al., 2004; ASSIS e MAFIA, 2007). Dessa forma, técnicas alternativas como a propagação in vitro, visando ao rejuvenescimento clonal, podem viabilizar a propagação vegetativa da espécie e seus híbridos.

As técnicas de propagação in vitro têm sido largamente difundidas e com aplicações comprovadas na área florestal (XAVIER et al., 2009), onde grande parte dos estudos sobre Eucalyptus tem sido direcionada para a otimização da clonagem de árvores adultas (DEL PONTE et al., 2001). Especialmente em Eucalyptus, a micropropagação mediante proliferação de gemas axilares tem sido a mais utilizada, sendo mais simples do que os sistemas de micropropagação por embriogênese somática e organogênese, por se basear na proliferação de gemas pré-formadas (GOMES e CANHOTO, 2003; XAVIER et al., 2009).

O estado fisiológico da planta-matriz tem grande influência na morfogênese, no crescimento e nas taxas de multiplicação in vitro, o que pode ser melhorado com adequado pré-tratamento ambiental das plantas-matrizes, particularmente quanto à nutrição e ao controle fitossanitário. Da mesma forma, o tipo de explante e a época de coleta podem ser determinantes na resposta in vitro (HARTMANN, 2002; GEORGE e DEBERGH, 2008).

Os meios de cultura utilizados na micropropagação fornecem as substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro (CALDAS et al., 1998). Na micropropagação de Eucalyptus, o meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) tem sido o mais utilizado (BENNETT et al., 1994; YANG et al., 1995; SHARMA e RAMAMURTHY, 2000; GRAÇA et al., 2001; NUGENT et al., 2001; SOBROSA e CORDER, 2003; WATT et al., 2003; BILLARD et al., 2005; GLOCKE, et al., 2006; BRONDANI et al., 2009). O meio JADS (CORREIA, 1993) também tem sido testado com sucesso em alguns trabalhos de micropropagação com as espécies do gênero (LIMA e GONÇALVES, 1998; SANTOS et al., 2004; ANDRADE et al., 2006; QUISEN, 2007; BRAVO et al., 2008).

A resposta de explantes em sistema de cultivo in vitro também depende do genótipo do material colocado em cultura (SOBROSA e CORDER, 2003; GEORGE e DEBERGH, 2008). Normalmente se observa variabilidade clonal no comportamento in vitro, com genótipos que se adaptam facilmente à condição in vitro, respondendo bem a vários meios de cultura, e clones que necessitam de ajustes específicos no meio de cultura (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).

Nesse contexto, este trabalho teve como objetivos avaliar o efeito dos meios de cultura MS e JADS na resposta de clones de Eucalyptus urophylla x E. globulus e Eucalyptus grandis x E. globulus durante a fase de multiplicação in vitro, através da técnica de micropropagação pela proliferação de gemas axilares, visando ao rejuvenescimento clonal.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Material experimental

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos do Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária BIOAGRO, da Universidade Federal de Viçosa UFV, localizado no Município de Viçosa, Minas Gerais.

Os explantes utilizados na multiplicação in vitro foram provenientes da fase de estabelecimento in vitro de 21 clones de Eucalyptus urophylla x E. globulus e seis de Eucalyptus grandis x E. globulus, oriundos da empresa CENIBRA S.A., localizada no Município de Belo Oriente, Minas Gerais. Os clones utilizados nos experimentos resultaram do programa de melhoramento genético da CENIBRA S.A. e foram gerados a partir de cruzamentos utilizando pólens de Eucalyptus globulus, provenientes do Instituto Raiz, de Portugal. Como genitores femininos foram usadas matrizes superiores de Eucalyptus grandis ou Eucalyptus urophylla da própria empresa (Tabela 1).

Os clones foram selecionados em testes de progênie híbrida, avaliando-se as características silviculturais (DAP, altura, forma e outras) aos 3 anos de idade. Nessa idade foram produzidas mudas pelo processo de estaquia convencional para multiplicação do material vegetativo, as quais foram conduzidas como minicepas em minijardim clonal, sob sistema semi-hidropônico de canaletão de areia, no Viveiro de Pesquisas Florestais do Departamento de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Viçosa, de onde se coletaram os explantes para o estabelecimento in vitro.

As minicepas foram conduzidas em casa de vegetação com as laterais abertas e cobertas com plástico transparente de polietileno. As plantas receberam solução nutritiva por gotejamento, aplicada quatro vezes ao dia, numa vazão total diária de 4 L m^-2. A solução foi composta de nitrato de cálcio (0,920 g L^-1), cloreto de potássio (0,240 g L^-1), nitrato de potássio (0,140 g L^-1), monoamônio fosfato (96,000 mg L^-1), sulfato de magnésio (0,364 g L^-1), hidroferro (40,000 mg L^-1), ácido bórico (2,800 mg L^-1), sulfato de zinco (0,480 mg L^-1), sulfato de manganês (1,120 mg L^-1), sulfato de cobre (0,100 mg L^-1) e molibdato de sódio (0,040 mg L^-1). A condutividade elétrica da solução nutritiva foi mantida em torno de 2,0 mS m^-2.

No estabelecimento in vitro, utilizaram-se como explantes segmentos nodais medindo de 3 a 4 cm de comprimento, que foram coletados e desinfestados com lavagem em água corrente, seguido de imersão em solução fungicida contendo 2,4 g L^-1 de Orthocide 500^® (Captan 50% como p. a.), durante 15 min. Posteriormente, foram imersos em solução de álcool 70% (v/v) por 30 seg com agitação constante, dentro da câmara de fluxo laminar horizontal. Em seguida, foram imersos em solução de NaOCl 1% (v/v) Clarix^®, acrescida de Tween 20 (3 gotas/100 mL de solução) durante 15 min. Finalmente, os segmentos nodais foram lavados em água desionizada autoclavada, cinco vezes, e os explantes preparados e inoculados verticalmente, sob condições assépticas, em tubos de ensaio de 15 cm x 2,5 cm, contendo 10 mL de meio de cultura. Utilizou-se o meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), adicionado de 0,5 mg L^-1 de BAP (Sigma Co.), 0,1 mg L^-1 de ANA (Sigma Co.), 100 mg L^-1 de mioinositol (Sigma Co.), 800 mg L^-1 de PVP30 (Polivinilpirrolidona Synth Ltda.), 30 g L^-1 de sacarose (Synth Ltda.) e 7 g L^-1 de ágar (Merck S.A.). Os meios de cultura foram preparados utilizando água deionizada e o pH, ajustado para 5,8 ± 0,05 com NaOH (0,1 mol/L) e HCl (0,1 mol/L), antes da autoclavagem e da adição do ágar. O meio de cultura foi autoclavado na temperatura de 121 ºC e pressão de aproximadamente 1 kgf cm^-2, durante 15 min.

Após a inoculação, os explantes foram mantidos durante sete dias no escuro, visando reduzir o processo de oxidação, em sala de cultura a 25 ± 2 ºC, e, posteriormente, mantidos por 23 dias em fotoperíodo de 16 h de luz e irradiância de 80 µmol m^-2 s^-1, fornecidas por tubos fluorescentes branco-frios.

Em 11 clones de Eucalyptus urophylla x E. globulus e dois clones de Eucalyptus grandis x E. globulus, foram usadas brotações provenientes de três introduções in vitro (realizadas aos 30, 90 e 150 dias após a primeira poda das minicepas em condições de viveiro). Nos demais clones, 10 de Eucalyptus urophylla x E. globulus e quatro de Eucalyptus grandis x E. globulus, utilizaram-se brotações provenientes de apenas uma introdução in vitro.

2.2. Multiplicação in vitro

Para a iniciação da fase de multiplicação, as brotações produzidas na fase de estabelecimento in vitro foram preparadas e inoculadas, sob condições assépticas, em tubos de ensaio de 15 cm x 2,5 cm contendo 10 mL do meio de cultura. Foram usados os meios de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) e JADS (CORREIA, 1993) adicionados de 0,5 mg L^-1 de BAP, 0,01 mg L^-1 de ANA, 100 mg L^-1 de mioinositol, 800 mg L^-1 de PVP30, 30 g L^-1 de sacarose e 7 g L^-1 de ágar. Quanto ao ajuste de pH e à autoclavagem, esses foram realizados conforme descrito para a fase de estabelecimento in vitro.

A cada 30 dias, procedeu-se o subcultivo dos explantes para novo meio de cultura de igual composição, isolando tufos de brotações padronizados com duas a três brotações maiores do que 2 mm e com bom vigor vegetativo.

Após a inoculação, os explantes foram mantidos em sala de cultura a 25 ± 2 ºC e fotoperíodo de 16 h de luz e irradiância de 80 µmol m^-2 s^-1, fornecidas por tubos fluorescentes branco-frios.

2.3. Condução e avaliações experimentais

O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado, utilizando 20 repetições compostas de um explante (tufo de brotação) por repetição. Nos clones com três introduções in vitro, testaram-se dois meios de cultura (MS e JADS) ao longo de nove, sete e cinco subcultivos para a primeira, segunda e terceira introduções in vitro, respectivamente. Nos clones com apenas uma introdução in vitro, foram testados dois meios de cultura (MS e JADS) ao longo de cinco subcultivos.

Após 30 dias em cultura, foi avaliada a taxa de multiplicação (número de tufos de brotações produzidos por explante) em cada subcultivo, sendo os dados analisados por meio das médias e do erro-padrão.

3. RESULTADOS

Com base nos resultados, observaram-se respostas diferenciadas na maioria dos clones à taxa de multiplicação ao longo dos subcultivos, bem como pequenas diferenças entre meios de cultura e entre introduções in vitro em alguns clones (Tabelas 2, 3 e 4). Esses resultados também foram observados nos clones com apenas uma introdução in vitro (Tabela 5).

Devido à produção insuficiente de brotações na fase de estabelecimento in vitro, os clones C15 na primeira introdução in vitro, os clones C12 e C29 na segunda introdução e C01, C04 e C16 no meio de cultura JADS na terceira introdução não foram estabelecidos na fase de multiplicação in vitro. No entanto, nas introduções em que houve produção suficiente de brotações na fase de estabelecimento esses clones foram avaliados na fase de multiplicação.

O clone C29 foi o que apresentou as maiores taxas de multiplicação, tanto no meio de cultura JADS quanto no meio MS (5,3 e 4,9, respectivamente). Entretanto, esse clone não se estabeleceu na segunda introdução in vitro, devido ao baixo vigor e número de brotações produzidas na fase de estabelecimento nessa introdução.

Alguns clones se mostraram recalcitrantes em relação aos demais durante a fase de multiplicação em pelo menos uma das introduções in vitro, sendo descartados após alguns subcultivos (clones C11, C12, C15, C20 e C24). Ressalta-se que o clone C20 não se estabeleceu no meio de cultura MS e o clone C24 em nenhum dos dois meios. Esses clones apresentavam-se sem vigor e necróticos, o que limitou seu cultivo.

De modo geral, no meio de cultura MS foi observado que as brotações apresentavam-se mais alongadas e com folhas maiores do que no meio JADS. Também foi observada no meio MS a ocorrência, em baixa frequência, de alguns explantes hiper-hídricos em certos clones, não sendo verificado esse comportamento no meio JADS.

No meio JADS, foi observada tendência de escurecimento do meio na maioria dos clones, evidenciando a oxidação de compostos fenólicos liberados pelo explante no meio de cultura, principalmente após 20 dias em cultura. No meio MS, esse escurecimento foi baixo, ocorrendo somente em alguns explantes.

Foi observado, visualmente, que nos 12 primeiros dias após a inoculação, em cada subcultivo, os explantes apresentavam crescimento lento, iniciando o processo de proliferação das gemas axilares a partir desse período. A proliferação era rápida até o 20º dia em cultura, quando, então, o crescimento se estabilizava.

4. DISCUSSÃO

Ao comparar as três introduções in vitro, observou-se tendência de melhores resultados na taxa de multiplicação na terceira introdução na maioria dos clones, principalmente no meio de cultura MS. Segundo Grattapaglia e Machado (1998), a planta-matriz tem grande influência no posterior comportamento das culturas in vitro. Assim, essa tendência observada nos resultados pode estar relacionada à qualidade fisiológica das minicepas no momento da coleta dos explantes.

Os meios de cultura MS e JADS, em média, tiveram efeitos aproximados, com tendência de melhores resultados no meio MS, principalmente na segunda e terceira introduções in vitro.

Em explantes juvenis de Eucalyptus grandis, Andrade et al. (2006) observaram, aos 21 dias, a produção média de sete brotações por explante em meio JADS com a exposição dos explantes por 1 h em 200 mg L^-1 de BAP, antes da inoculação no meio. Correia (1993) obteve alta produção de brotações na multiplicação de Eucalyptus grandis em meio JADS, sendo os resultados superiores aos encontrados neste estudo para o mesmo meio de cultura, demonstrando que ajustes devem ser feitos para aumentar as taxas de multiplicação.

Em Eucalyptus tereticornis, Sharma e Ramamurthy (2000) verificaram bons resultados de proliferação de gemas em meio MS. Da mesma forma, Joshi et al. (2003) obtiveram de 20 a 25 gemas por explante, aos 150 dias em meio MS, em Eucalyptus tereticornis x E. grandis. Brondani et al. (2009), trabalhando com a multiplicação in vitro de clones de Eucalyptus benthamii x E. dunii em meio MS, obtiveram estimativas médias de até 13 gemas por explante.

De modo geral, cada clone respondeu de forma específica ao meio de cultura, observando-se diferenças no "ranking" dos clones do meio MS para o meio JADS, exceto no clone C16, que foi superior aos demais, tanto no meio MS quanto no meio JADS, nas três introduções. Nos clones com apenas uma introdução in vitro, essa mudança no "ranking" também ocorreu, exceto no clone C03 de Eucalyptus urophylla x E. globulus, assim como nos clones C26 e C27 de Eucalyptus grandis x E. globulus.

Variações entre genótipos também têm sido obtidas em alguns trabalhos quanto às taxas de multiplicação in vitro de Eucalyptus (CORREIA, 1993; BENNETT et al., 1994; SOBROSA e CORDER, 2003; BRONDANI et al., 2009), demonstrando ser esse fator que exerce grande influência na resposta in vitro.

Assim como neste estudo, Brondani et al. (2009) também observaram recalcitrância na fase de multiplicação in vitro de um clone de Eucalyptus benthamii x E. dunii. Isso evidencia a necessidade de ajustes nos protocolos de multiplicação in vitro para determinados genótipos que não se adaptaram às condições de cultivo.

Segundo Whitehouse et al. (2002), a hiper-hidricidade é frequentemente relatada na micropropagação de espécies lenhosas, podendo reduzir as taxas de multiplicação e a qualidade das brotações e levar a necrose dos tecidos. No entanto, neste estudo, a hiper-hidricidade não afetou decisivamente a taxa de multiplicação dos clones, exceto o C29, a partir do sexto subcultivo na primeira introdução in vitro, onde a hiper-hidricidade ocorreu com maior frequência.

A taxa de multiplicação mostrou tendência de aumento com os sucessivos subcultivos, porém decaindo, posteriormente, na maioria dos clones nas três introduções in vitro, assim como nos clones com apenas uma introdução. Bennet et al. (1994) observaram que clones de Eucalyptus globulus apresentaram bom crescimento inicial em meio de cultura contendo BAP, mas esse crescimento declinou após o terceiro ou quarto subcultivo. Quando aqueles autores usaram BAP e cinetina no meio de cultura, em subcultivos alternados, houve melhoria na taxa de multiplicação in vitro dos clones. Neste estudo, os subcultivos contínuos na mesma composição do meio de cultura podem ter sido uma das causas do declínio na taxa de multiplicação devido à falta de ajuste dos meios em alguns clones. Assim, a alternância dos subcultivos em meio de cultura com diferentes tipos ou doses de reguladores ou, mesmo, a alternância entre meios com diferentes composições salinas (JADS e MS) poderiam melhorar ou manter as taxas de multiplicação dos clones, sendo esse ponto merecedor de maiores estudos para ajustes na micropropagação dos híbridos de Eucalyptus globulus.

5. CONCLUSÕES

Os meios de cultura MS e JADS apresentaram-se adequados à multiplicação in vitro dos clones de Eucalyptus urophylla x E. globulus e Eucalyptus grandis x E. globulus, com tendência de melhores resultados do meio MS na segunda e terceira introduções in vitro.

A taxa de multiplicação variou entre subcultivos, apresentando tendência de aumento inicial e posterior queda da maioria dos clones e introduções in vitro.

A resposta à multiplicação in vitro variou entre genótipos, com clones que se adaptaram às condições de cultivo e outros que se mostraram recalcitrantes nessa fase da micropropagação.

6. AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão de bolsas de estudo; e à empresa Celulose Nipo-Brasileira S.A. (CENIBRA), pelo apoio financeiro e pela disponibilização de material genético (clones).

7. REFERÊNCIAS

Recebido em 31.08.2009 e aceito para publicação em 16.12.2010.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Maio 2011
• Data do Fascículo
  Abr 2011

Histórico

• Aceito
  16 Dez 2010
• Recebido
  31 Ago 2009