Crescimento e teor de proteínas em sementes de soja sob influência de hormônios vegetais

Growth and protein content in soybean seeds affected by phytohormones

Crescimento e teor de proteínas em sementes de soja sob influência de hormônios vegetais

Growth and protein content in soybean seeds affected by phytohormones

Ronaldo do Nascimento^I,1; Paulo R. Mosquim^II

^IUniversidade Federal de Pelotas, Instituto de Biologia, Departamento de Botânica, Campus Universitário, 96910900 Pelotas, RS, Brasil

^IIUniversidade Federal de Viçosa, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento de Biologia Vegetal, Campus Universitário, 36571-000 Viçosa, MG, Brasil

RESUMO

Os prováveis hormônios vegetais envolvidos no crescimento e acúmulo de proteínas de reserva em sementes de soja foram avaliados por meio do cultivo artificial dos frutos. Explantes de frutos de soja apresentando o pericarpo completamente expandido e sementes com aproximadamente 100 mg de massa fresca foram cultivados in vitro com várias concentrações de ácido naftaleno-acético (ANA), ácido giberélico (GA₃), benziladenina (BA) e ácido abscísico (ABA). Esses fitorreguladores foram utilizados inicialmente isolados nas concentrações de 10^-7, 10^-6, 10^-5 e 10^-4 mol.L^-1 cada um. Em seguida, foram combinados dois a dois, sendo as concentrações determinadas em função dos maiores incrementos na massa seca das sementes observados nos experimentos iniciais. O ANA foi ineficiente para o crescimento das sementes, que foi estimulado por GA₃ e BA, porém apenas nas concentrações mais elevadas. O ABA inibiu o crescimento das sementes. Quando combinou-se o ANA com GA₃ ou BA, houve aumento na massa seca das sementes, sugerindo que pode ocorrer interações entre hormônios vegetais. O ANA e a BA foram os fitorreguladores mais eficientes no acúmulo de proteínas, tanto isolados como combinados. O ABA, por sua vez, inibiu a síntese de proteínas de reserva nas sementes. O sistema artificial de cultivo utilizado nesse experimento mostrou-se eficiente para o estudo do crescimento e de teores protéicos em sementes de soja.

Palavras-chave: ácido giberélico, explantes, fitoreguladores

ABSTRACT

The phytohormones likely to be envolved in growth and protein reserve accumulation in soybean seeds were studied by artificial cultivation of fruits. Explants from soybean fruits with pericarp fully expanded and seeds with 100 mg of fresh mass were cultivated in vitro with naphthalene acetic acid (NAA), gibberelic acid (GA₃), benzylad enine (BA) and abscisic acid (ABA) initially alone at 10^-7, 10^-6, 10^-5 and 10⁴ mol.L^-1 rates. Phytoregulators combinations were determined as a function of greater increments in seeds dry weight. On the basis of previous observations of. GA₃ and BA promoted seed development only in high concentrations, while NAA was ineffective and ABA inhibited seed growth. When applied concurrently with GA₃ or BA, the NAA stimulated seed growth, suggesting that interactions may occur among them. NAA and BA alone or combined induced increase in seed protein content but ABA inhibited the protein accumulation. The artificial cultivation system employed in this assay has been shown to be suitable for studies of growth and protein accumulation in soybean seeds.

Key words: explants, gibberelic acid, phytoregulators

Introdução

Dentre as várias leguminosas tropicais e subtropicais cultivadas no Brasil, a soja destaca-se como uma das principais, econômica e nutricionalmente, em função do alto teor protéico das sementes (Schrader & Thomas 1981), que para se desenvolverem dependem de um suprimento de minerais e hormônios vegetais fornecidos pela planta. No entanto, complexas interações que ocorrem entre as sementes em formação e a planta-mãe tornam difícil a identificação de quais hormônios vegetais estão envolvidos no crescimento das sementes e no acúmulo de proteínas. Segundo Obendorf et al. (1983), uma maneira de diminuir essa dificuldade é isolar os frutos em formação e cultivá-los em meio artificial adequado.

Das técnicas utilizadas para o cultivo artificial de frutos de soja, têm-se a do tegumento vazio, desenvolvida por Thorne (1981), a da cultura de cotilédones imaturos, desenvolvida por Thompson et al. (1977), e a do cultivo de explantes de frutos, desenvolvida por Mosquim & Sodek (1991). Dentre elas, a que melhor reproduz as condições da planta é o cultivo de explantes de frutos, uma vez que os nutrientes alcançam as sementes via fluxo xilemático. A utilização dessa técnica foi útil para verificação de vários aspectos bioquímicos nas sementes de soja, como o transporte e metabolismo de substâncias nitrogenadas (Mosquim & Sodek 1991), a distribuição de carboidratos e atividade de invertases (Nascimento et al. 1998) e a atividade das enzimas sintetase da glutamina e sintase do glutamato nos frutos sob diferentes fontes de nitrogênio (Junghans & Mosquim 1995).

Entretanto, os efeitos de hormônios vegetais sobre o crescimento das sementes de soja são pouco conhecidos, embora já exista alguma informação com frutos de ervilha (Ozga et al. 1992, Van Huizen et al. 1996, Van Huizen et al. 1997). Observou-se que sementes imaturas de ervilha contêm quantidades elevadas de auxinas e giberelinas, as quais estão envolvidas com seu crescimento. Além de influenciar o crescimento das sementes, os hormônios vegetais podem induzir a síntese protéica, conforme verificado por Van Huizen et al. (1996). Esses autores observaram que a síntese de proteínas em sementes de ervilha foi detectada dentro de seis horas após a aplicação de auxinas e giberelinas.

O presente trabalho teve por objetivos verificar, por meio do cultivo in vitro de explantes de frutos de soja, o efeito de fitorreguladores no crescimento das sementes, bem como avaliar a influência dessas substâncias sobre o acúmulo de proteínas de reserva nos cotilédones.

Material e métodos

Sementes de soja [Glycine max (L.) Merril cv. UFV 16] foram semeadas em vasos de polietileno, com capacidade para 3 L, contendo areia lavada como substrato e mantidas em casa de vegetação em condições naturais de luz, temperatura e umidade relativa de outubro de 1997 a dezembro de 1998.

Após germinação, quando as plântulas apresentaram o primeiro trifólio completamente expandido, foi feito um desbaste, deixando-se apenas duas plântulas por vaso. Estas foram irrigadas sempre que necessário com água e, três vezes por semana, foram aplicados 250 mL da solução nutritiva completa de Hoagland (Hoagland & Arnon 1938). As plantas permaneceram naquelas condições até que os frutos apresentassem o pericarpo completamente expandido e as sementes com cerca de 100 mg de massa fresca, quando foram transferidas ao laboratório para a montagem dos experimentos.

Para o cultivo de explantes de frutos de soja, utilizou-se a metodologia descrita por Mosquim & Sodek (1991). A fonte de carboidratos foi a sacarose e a de nitrogênio, a glutamina, na concentração de 50 mg.mL^-1 e de 1,2 mg.mL^-1 de N no meio de cultivo, respectivamente.

Para avaliar a influência de cada fitorregulador sobre o crescimento das sementes, foi adicionado, separadamente ao meio de cultivo, ácido naftaleno-acético (ANA), ácido giberélico (GA₃), benziladenina (BA) e ácido abscísico (ABA), todos nas concentrações de 10^-7, 10^-6, 10^-5 e 10^-4 mol.L^-1. Cada fitorregulador correspondeu a um experimento. Após conhecer a concentração de cada fitorregulador que proporcionou o maior incremento na massa seca das sementes, estas foram fixadas, variando-se, então, a concentração dos outros fitorreguladores, de 10^-7 a 10^-4 mol.L^-1. O pH de todos os meios de cultivo foi ajustado para 5,0. Utilizaram-se 6,5 mL de cada meio de cultivo. A cada 48 horas, os caules dos explantes foram cortados em sua base em cerca de dois mm para desobstruir algum vaso que poderia estar bloqueado e, no quarto dia, os meios de cultivo foram trocados para evitar exaustão de minerais ou substâncias orgânicas. O período de cultivo para os quatro experimentos iniciais foi de 10 dias e, para os experimentos subseqüentes, foi de 8 dias. Frutos foram coletados e suas sementes analisadas nos dias da montagem (controle in situ, dia 0) e desmontagem (controles in situ, dia 8 ou 10) dos experimentos. O sistema de cultivo in vitro foi então colocado sob iluminação contínua de aproximadamente 80 µmol.m^-2.s^-1 e temperatura de 25 ± 2 ºC.

A massa fresca total das sementes foi determinada em balança analítica. Após pesagem, retiraram-se os integumentos das sementes, obtendo-se quatro cotilédones. Destes, dois (um de cada semente) foram pesados e mergulhados em nitrogênio líquido, para posterior determinação dos teores protéicos. Para obtenção da massa seca, os outros dois cotilédones e os integumentos foram pesados e transferidos para estufa com ventilação forçada, por aproximadamente 48 horas, a 75 ºC, até atingir massa constante.

Para extração das proteínas, os cotilédones foram homogeneizados em almofariz e pistilo, com 10 mL de NaOH 0,1 mol.L^-1. O extrato, assim obtido, foi centrifugado a 2.500 g, por um período de cinco minutos. Em seguida, uma alíqüota de 100 µL foi tomada para a determinação de proteínas pelo método "dye-binding" de Bradford (1976), utilizando soroalbumina bovina (BSA) como padrão.

Em todos os experimentos, as unidades experimentais foram constituídas por um frasco contendo um explante. Os tratamentos, repetidos seis vezes, foram dispostos inteiramente ao acaso e os seus efeitos foram analisados pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Resultados e Discussão

O ácido naftaleno-acético (ANA) e o ácido giberélico (GA₃) não afetaram a massa seca das sementes, que foi estimulada pela benziladenina (BA) e inibida pelo ácido abscísico (ABA) apenas nas concentrações mais elevadas (tabela 1). Isso indica que as sementes de soja, no estádio utilizado, podem conter auxinas e giberelinas em quantidade suficiente para seu crescimento e que citocininas podem estimular o transporte de assimilados às sementes, além de causar expansão celular, o que estaria associada ao aumento na extensibilidade da parede celular (Taiz & Zeiger 2002). Cho et al. (2002) avaliaram o efeito da aplicação de benzilaminopurina (BAP) sobre o crescimento de sementes de soja e observaram que 1 mmol.L^-1 de BAP aumentou a massa seca das sementes. Resultados semelhantes aos obtidos com soja são encontrados na literatura para outra leguminosa, a ervilha. Barrat (1986) e Sponsel (1982) avaliaram as relações existentes entre o crescimento de sementes de ervilha, medido com base no acúmulo de massa seca, e a quantidade de ANA presente nesses órgãos. Verificaram que a auxina, isoladamente, não alterou a quantidade de massa seca acumulada pelas sementes.

A giberelina, por sua vez, parece estar mais envolvida com o crescimento do pericarpo de vagens, pois, segundo observado por Barrat (1986), o GA₃ estimulou o acúmulo de massa seca de pericarpo de frutos de ervilha, aumentando a força desse dreno ou mantendo-o como um dreno preferencial em detrimento das sementes.

O efeito estimulatório da BA sobre a massa seca das sementes ocorreu sempre nas concentrações acima de 10^-6 mol.L^-1 (tabela 1). Possivelmente a citocinina atue estimulando a atividade de dreno das sementes, no entanto isso parece depender da quantidade de BA presente nos órgãos, como também foi observado por Barrat (1986) em ervilha. Esse autor verificou, em um sistema artificial de cultivo, que 10^-4 mol.L^-1 de BA foi a concentração que proporcionou o maior crescimento das sementes.

Dentre os quatro fitorreguladores utilizados isoladamente, o ABA foi o único que causou inibição no crescimento das sementes (tabela 1). O efeito inibitório ocorreu nas concentrações de 10^-5 e 10^-4 mol.L^-1. Ao que parece, o ABA, ao contrário da BA, atuou inibindo a atividade de dreno das sementes, no estádio de desenvolvimento utilizado, conseqüentemente, o fluxo de nutrientes aos frutos diminuiu e o crescimento foi inibido. Essa idéia pode ser reforçada pelos resultados de Eeuwens & Schwabe (1975), também com ervilha. Analisando o crescimento desses frutos submetidos a diferentes concentrações de ABA, os autores verificaram uma correlação entre o declínio na taxa de crescimento das sementes e o aumento acentuado nos teores de ABA nesses tecidos. Resultados semelhantes foram obtidos por Schussler et al. (1984), os quais observaram que o ABA causou diminuição no crescimento de sementes de soja in vitro e que os níveis de ABA nas sementes tenderam a decrescer durante o desenvolvimento, na medida em que essas estruturas acumulavam massa seca. Devido aos resultados obtidos com o ABA, optou-se por não utilizá-lo em combinação com os outros fitorreguladores.

Após avaliação do efeito isolado dos fitorreguladores sobre o crescimento das sementes, foi feita a combinação dos mesmos, exceto o ABA, dois a dois, fixando a concentração de um deles e variando a do outro. Apenas a combinação entre ANA e BA proporcionou aumento na massa seca das sementes (tabela 3), ao contrário do que ocorreu com a combinação entre GA₃ e ANA, que inibiu o crescimento das sementes (tabela 3). Todas as outras combinações, ou sejam, ANA com GA₃, GA₃ com BA, BA com ANA e BA com GA₃ (dados não mostrados) não influenciaram o teor de massa seca das sementes de soja no estádio de desenvolvimento utilizado no experimento. Ao que parece, os hormônios vegetais atuam sobre o crescimento das sementes, entretanto seus efeitos dependem, além das quantidades presentes nos tecidos, de interações que podem ocorrer entre eles.

Verificou-se que ANA, nas concentrações de 10^-7, 10^-6 e 10^-5 mol.L^-1, não alterou os teores protéicos das sementes. Entretanto, quando essas foram cultivadas em 10^-4 mol.L^-1 de ANA, observou-se aumento no teor protéico, proporcionando produções significativamente superiores àquelas do tratamento controle (tabela 2). Isso permite sugerir que auxinas podem estimular a síntese de proteínas em sementes de soja, no entanto, este processo parece depender da quantidade endógena desse fitohormônio. Veluthambi & Poovaiah (1984) observaram o mesmo efeito do ANA em frutos de morango. De acordo com Van Huizen et al. (1996), o ácido cloroindol-3-acético, auxina endógena em frutos de ervilha, induz a síntese de proteínas, o que está de acordo com os presentes resultados com frutos de soja.

Os resultados apresentados na tabela 2 mostram que o GA₃, aplicado exogenamente e nas doses utilizadas, não alterou a produção de proteínas nas sementes. Isso pode ter ocorrido em função dos níveis endógenos de giberelinas que, possivelmente, são elevados nas sementes de soja em desenvolvimento. Segundo Ozga et al. (1992) e Van Huizen et al. (1996), giberelinas são constituintes naturais de sementes de ervilha em desenvolvimento, as quais apresentam altos níveis do fitormônio. O metabolismo das giberelinas é regulado endogenamente de forma a manter o nível de giberelinas ativas praticamente constante. Quando giberelinas são fornecidas às plantas, uma proporção torna-se glicosilada, conseqüentemente inativa (Schneider & Schmidt 1990). Isso pode, pelo menos em parte, explicar os resultados obtidos no experimento, que foram semelhantes aos obtidos por Groot et al. (1987) em sementes de tomate.

A benziladenina proporcionou incremento no teor protéico dos cotilédones, nas quatro concentrações utilizadas (tabela 2), indicando que citocinina é, possivelmente, um fitohormônio que influencia a produção de proteínas em frutos de soja. Segundo D´Agostino et al. (2000), aumento na expressão de genes é um dos efeitos primários das citocininas. De modo oposto, o ABA foi o único, de todos os fitorreguladores utilizados isoladamente, a causar decréscimo acentuado nos teores de proteínas dos cotilédones de soja (tabela 2), levando a supor que, ao contrário do que ocorre com auxinas e citocininas, o ABA inibe a produção de proteínas de reserva em frutos imaturos de soja.

As adições simultâneas de ANA a 10^-5 mol.L^-1 e de GA₃ a 10^-7, 10^-6 ou 10^-5 mol.L^-1, promoveram aumento no teor protéico cotiledonar, relativamente àquele verificado com apenas ANA a 10^-5 mol.L^-1. Porém, o aumento da concentração de GA₃ para 10^-4 mol.L^-1 resultou em um teor de proteínas da mesma grandeza que o observado com ANA a 10^-5 mol.L^-1 (tabela 4). Ao que parece, concentrações elevadas de GA₃, pelo menos a partir de 10^-4 mol.L^-1, podem ter efeito inibitório sobre a produção de proteínas em sementes imaturas de soja, visto que com o aumento da concentração isolada de GA₃ obteve-se decréscimo do teor de proteínas (tabela 2). O contrário ocorreu com a aplicação de ANA, ou seja, sob as maiores concentrações desta auxina, verificaram-se os maiores teores de proteínas (tabela 2). Resultados semelhantes ocorreram com a combinação do ANA, sob a mesma concentração, com a BA, nas concentrações de 10^-7, 10^-6, 10^-5 e 10^-4 mol.L^-1 (tabela 4), sugerindo que a citocinina, isoladamente, induz a síntese de proteínas de reserva em sementes de soja (tabela 2). Quando combinada com ANA (tabela 4), BA promoveu aumento no nível protéico apenas sob 10^-7, 10^-6 e 10^-5 mol.L^-1 e diminuiu sob 10^-4 mol.L^-1. Isso indica que, quando combinados, os hormônios vegetais influenciam diferentemente o acúmulo de proteínas em sementes de soja, pois pode ocorrer interações entre eles que determinam efeitos aditivos ou antagônicos, dependendo de suas concentrações.

A benziladenina a 10^-4 mol.L^-1, combinada com o GA₃ em diferentes concentrações (tabela 4), levou à queda no acúmulo de proteínas em cotilédones de soja nas concentrações mais elevadas de GA₃, ou sejam, 10^-5 e 10^-4 mol.L^-1. Comparando os teores de proteínas na ausência de BA (82 µg.gMF^-1) com BA a 10^-4 mol.L^-1 (91 µg.gMF^-1), observa-se um incremento, estatisticamente diferente, de 11% (tabela 2). Uma vez que não se obteve diferença entre as várias concentrações de giberelina, supõe-se que o aumento na concentração desta tenha sido responsável pelo decréscimo no teor de proteínas quando combinada com BA (tabela 4).

O GA₃ em concentrações mais elevadas (10^-5 e 10^-4 mol.L^-1) reverteu o efeito positivo causado pela BA, tendo em vista que houve queda de 20% no teor protéico das sementes, comparando o controle sem fitoregulador (T0) com a combinação de BA 10^-4 com GA₃ 10^-4 mol.L^-1 (T4) (tabela 4). Os resultados indicam que, possivelmente, ocorreu uma interação negativa entre GA e BA a qual foi responsável pelo efeito inibitório sobre a produção de proteínas. Isso é reforçado pelos resultados de Cao & Shannon (1997). Estes autores mostraram que o efeito do GA₃ sobre a produção de proteínas em sementes jovens de milho depende da concentração utilizada; em baixas concentrações de GA₃ (5 e 30 µmol.L^-1) houve aumento no teor de proteínas nas sementes, enquanto que a 50 µmol.L^-1 não houve efeito sobre a síntese protéica. Segundo os autores, 50 µmol.L^-1 de GA₃ pode ter sido uma concentração muito elevada, levando aos resultados obtidos. Isso pode também ter ocorrido no presente experimento, uma vez que com o aumento do GA₃ houve decréscimo no teor de proteínas das sementes.

Na tabela 4 observam-se os resultados das adições simultâneas de BA a 10^-4 mol.L^-1 e ANA em diversas concentrações (10^-7, 10^-6, 10^-5 e 10^-4 mol.L^-1). Verificouse que as diversas concentrações de ANA diferiram do controle sem BA, porém não entre si, indicando que o aumento de ANA, quando combinado com BA a 10^-4 mol.L^-1, não influenciou no acúmulo de proteínas em sementes imaturas de soja.

A tabela 4 mostra os resultados promovidos pelas combinações entre GA₃ e ANA e entre GA₃ e BA. Nessas combinações, a concentração da giberelina foi fixada em 10^-7 mol.L^-1 e as concentrações de ANA e BA variaram (10^-7, 10^-6, 10^-5 e 10^-4 mol.L^-1). Verificouse que o resultado de ambas as misturas foi semelhante, ocorrendo uma tendência de decréscimo no teor de proteínas nos cotilédones à medida em que se aumentaram as concentrações da auxina (tabela 4) e da citocinina (tabela 4). Resultados semelhantes foram obtidos quando se combinou os mesmos fitorreguladores, porém com GA₃ em diferentes concentrações (10^-7, 10^-6, 10^-5 e 10^-4 mol.L^-1) e auxina (tabela 4) e citocinina (tabela 4) em uma única concentração. Verificou-se, portanto, que houve efeito antagônico nas combinações e nas concentrações utilizadas. Isso demonstra que, quando combinados, os fitorreguladores atuam de maneira diferente da observada quando são utilizados isoladamente, podendo ocorrer efeito de interação, positiva ou negativa, dependendo da combinação e concentrações utilizadas.

Portanto, em sementes de soja, no estádio de desenvolvimento utilizado no presente trabalho, o teor de proteínas foi afetado tanto pelo tipo de fitorregulador como pela concentração e combinações utilizadas, como verificado por Van Huizen et al. (1996), em frutos de ervilha. Assim, embora freqüentemente se discuta a ação isolada dos hormônios vegetais, deve-se sempre atentar para as possíveis inter-relações entre os mesmos. O mecanismo de ação dos hormônios vegetais, em nível de alteração na síntese protéica via expressão genética, depende da interação entre estes e de suas concentrações no tecido, o que é influenciado pelos níveis endógenos e exógenos.

(recebido: 30 de outubro de 2002; aceito: 20 de maio de 2004)

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Mar 2005
• Data do Fascículo
  Set 2004

Histórico

• Recebido
  30 Out 2002
• Aceito
  20 Maio 2004