FLAVONOIDES DE Piper glandulosissimum Yuncker (Piperaceae)

FLAVONOIDS FROM Piper glandulosissimum Yuncker (Piperaceae)

Resumo

Three flavanones, two chalcones and one dihydrochalcone were isolated from the branches of Piper glandulosissimum. All isolated compounds were characterized based on IR, UV, ¹H and ¹³C NMR, including 2D NMR analyses (HMQC, HMBC, COSY and NOESY) and comparison with the literature. The compound 7-hydroxy-5,8-dimethoxyflavanone displayed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Trichophyton mentagrophytes and Microsporum canis.

INTRODUÇÃO

O gênero Piper pertence à família Piperaceae e é composto por 1000 espécies. Compreende ervas, arbustos e pequenas árvores distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do globo.¹ Várias espécies de Piper são utilizadas na medicina popular como analgésicas, anti-inflamatórias e para o tratamento de picadas de cobra.² Uma variedade de compostos tem sido isolada de espécies de Piper, incluindo amidas, lignanas, neolignanas, hidroquinonas, alcaloides, terpenos, derivados do ácido benzóico e aristolactamas. Frequentemente observa-se o isolamento de flavonoides, representados por flavonas, di-hidrochalconas, chalconas e flavanonas.^3-5

Piper glandulosissimum Yuncker (Piperaceae) é um arbusto nativo do Norte do Brasil,⁶ utilizado na medicina tradicional como anti-inflamatório. Testes realizados com o seu extrato hidroalcóolico revelaram uma elevada atividade antioxidante devido à presença de polifenóis.⁷ Foram realizados também testes de atividade antimicrobiana do seu extrato aquoso, contudo, não foi evidenciada nenhuma atividade.⁸ Existem poucos estudos fitoquímicos relacionados à espécie, podendo ser enfatizados a obtenção de óleos essenciais⁹ e a identificação de flavonóis, flavanóis e ácido hidroxicinâmico por CLAE.⁸

Durante os nossos estudos de espécies de Piperaceae do Norte e Nordeste brasileiro foram isolados alguns compostos químicos, tais como: flavonoides,¹⁰ amidas¹¹ e aristolactamas.¹² Neste trabalho descrevemos o isolamento e a identificação estrutural de 2',4'-di-hidroxi-3',6'-dimetoxichalcona (1), 2',4'-di-hidroxi-6'-metoxichalcona (2), 2',4'-di-hidroxi-6'-metoxidi-hidrochalcona (3), 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4), 5,8-di-hidroxi-7-metoxiflavanona (5) e 5,7,8-trimetoxiflavanona (6). As estruturas dos compostos foram determinadas pelas análises dos espectros de UV, IV e RMN de ¹H e ¹³C, incluindo técnicas de RMN bidimensionais, além de comparações com dados descritos da literatura.

PARTE EXPERIMENTAL

Métodos gerais

Nas colunas cromatográficas foi utilizada como fase fixa Sephadex LH-20 (Merck) e gel de sílica 60 (MERCK - 0,063-0,200 mm e 0,2-0,5 mm), que também foi usada para a confecção de placas cromatográficas em camada delgada analítica e preparativa. Os compostos foram visualizados usando luz UV (λ_max 254 e 366 nm). Espectros no IV foram obtidos em aparelho Perkin-Elmer (FT-IR-1750) utilizando pastilha de KBr. A análise espectroscópica na região do ultravioleta (UV) foi realizada em aparelho Vankel, modelo Vankel-50 UV-Vis, utilizando-se CH₃OH e os seguintes reagentes de deslocamento: acetato de sódio (NaOAc) anidro P.A., solução de cloreto de alumínio (AlCl₃) anidro P.A. em metanol e solução de ácido clorídrico (HCl) P.A. em água destilada (50% V:V).¹³ Os espectros uni e bidimensionais de RMN foram registrados em espectrômetros da Varian mod. MERCURY operando a 200 e 500 MHz (¹H) e 50 MHz e 125 MHz (¹³C) e Bruker mod. AC operando a 300 (¹H) e 75 MHz (¹³C). Os deslocamentos químicos foram relatados em ppm tendo como referência interna o TMS. Foram empregados os seguintes solventes: acetona-d₆, CDCl₃, CD₃OD e DMSO-d₆.

As reações de acetilação foram realizadas com o uso de anidrido acético e piridina, obedecendo a proporção de 0,5 mL de anidrido acético e 1 mL de piridina para cada 100 mg de composto a reagir. O progresso das reações foi monitorado por CCDA. Após o término da reação, a mistura foi tratada com água destilada gelada até a formação de um precipitado, que foi filtrado e lavado com água destilada, dissolvido em CHCl₃ e seco com Na₂SO₄. O solvente remanescente foi evaporado em evaporador rotativo.¹⁴

Material vegetal

As partes aéreas de Piper glandulosissimum Yuncker foram coletadas em maio de 2002 juntamente com a exsicata (número MG 165.227, Herbário João Murça Pires do Museu Paraense Emílio Goeldi - MPEG, Belém, PA) e identificada pela Dra. Elsie Guimarães.

Obtenção do extrato e isolamento dos compostos químicos

O material vegetal foi triturado em moinho com lâminas cortantes e o pó resultante (1.880 kg) foi exaustivamente extraído com etanol (6 x 2,5 L). Após a remoção do solvente em evaporador rotativo obteve-se o extrato etanólico bruto (180 g). Uma parte deste extrato (90 g) foi dissolvida em uma solução de CH₃OH:H₂O (7:3) na proporção de 1:5 e particionado em solventes de polaridade crescente fornecendo as fases hexânica (4,5 g), clorofórmica (26 g), acetato de etila (30 g) e CH₃OH:H₂O (6 g). Alíquota de 1,4 g da fase hexânica foi submetida à cromatografia em coluna com gel de sílica utilizando-se como fase móvel hexano e clorofórmio em misturas binárias e gradiente crescente de polaridade, fornecendo 26 frações. As frações 18-21 (0,145 g) foram reunidas e submetidas a coluna com Sephadex LH-20 utilizando como fase móvel CHCl₃: CH₃OH (1:1), obtendo-se, após recristalização em acetona, o composto 3 (0,015 g). Alíquota de 15 g da fase clorofórmica foi submetida à cromatografia em coluna usando gel de sílica e os solventes hexano, AcOEt e CH₃OH em gradiente crescente de polaridade, fornecendo 130 frações. As frações 10-11 (0,085 g), após recristalização em tetracloreto de carbono, forneceram 1 (0,020 g), que foi acetilado para a obtenção de 1a. A CCDP da fração 14 (0,067g), usando-se como eluente CHCl₃, resultou no isolamento de 2 (0,015 g). Da fração 76 (1,5 g), após recristalização com benzeno, obteve-se 70 mg de 4, acetilado para a obtenção de 4a. As frações 80-82 (0,195 g), após eluídas em coluna utilizando como fase móvel clorofórmio e acetato de etila em grau crescente de polaridade, forneceram 3 frações (80-82A, 80-82B, 80-82C). Cromatoplacas preparativas das frações 80-82B (0,035 g) e 80-82C (0,017 g) resultaram no isolamento de 5 (0,006 g) e de 6 (0,004 g), respectivamente.

2',4'-di-hidroxi-3',6'-dimetoxichalcona (1) cristais avermelhados, P.F.=144-146 ºC (lit. 124-125 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (300 e 75 MHz, acetona-d₆), (Tabela 1).

Tabela 1
Dados de RMN de ¹H e ¹³C de 1 (δ, 300 e 75 MHz, acetona-d₆) e 1a (CDCl₃)

H/C	1					1a
	δH	δC	2 J	3 J		δH	δC
1’	-	106,69	-	-		-	121,67
2’	-	160,89	-	-		-	142,52
3’	-	130,07	-	-		-	138,37
4’	-	158,14	-	-		-	145,39
5’	6,13 (s, 1H)	91,79	C-4’, C-6’	C-3’, C-1’		6,62 (s, 1H)	104,50
6’	-	159,84	-	-		-	152,73
1	-	136,49	-	-		-	134,42
2	7,74-7,70 (m, 2H)	129,32	-	-		7,75-7,70 (m, 2H)	128,59
3	7,49-7,42 (m, 3H)	129,92	-	C-5, C-1		7,38-7,35 (m, 3H)	128,91
4	7,49-7,42 (m, 3H)	131,11	-	-		7,38-7,35 (m, 3H)	130,71
5	7,49-7,42 (m, 3H)	129,92	-	C-3, C-1		7,38-7,35 (m, 3H)	128,91
6	7,74-7,70 (m, 2H)	129,32	-	-		7,75-7,70 (m, 2H)	128,59
β	8,03 (d, J=15,6 Hz, 1H)	128,51	C-1, C- α	-		7,43 (d, J=16,0 Hz, 1H)	127,31
α	7,78 (d, J=15,6 Hz, 1H)	142,96	-	-		6,92 (d, J=16,0 Hz, 1H)	146,16
β’	-	193,79	-	-		-	191,49
OH-2’	14,40 (s, 1H)	-	C-2’	C-3’, C-1’		-	-
OH-4’	9,17 (sl, 1H)	-	-			-	-
OCH3-3’	3,76 (s, 3H)	60,69	-	C-3’		3,75 (s, 3H)	61,20
OCH3-6’	3,98 (s, 3H)	56,58	-	C-6’		3,74 (s, 3H)	56,29
CH3COO-2’	-	-	-			2,17 (s, 3H)	20,39
CH3COO-4’	-	-	-			2,34 (s, 3H)	20,77
CH3COO-2’	-	-	-			-	168,18
CH3COO-4’	-	-	-			-	168,45

2',4'-diacetoxi-3',6'-dimetoxichalcona (1a), RMN de ¹H e ¹³C (200 e 50 MHz, CDCl₃), (Tabela 1).

2',4'-di-hidroxi-6'-metoxichalcona (2) cristais vermelhos, P.F.=163-165 ºC (lit. 193-196 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (200 e 50 MHz, CDCl₃), (Tabela 2).

Tabela 2
Dados de RMN de ¹H e ¹³C de 2 (δ, CDCl₃, 200 e 50 MHz) e de 3 (δ, CD₃OD, 500 e 125 MHz)

H/C	2					3
	δH	δC	2 J	3 J		δH	δC	2 J	3 J
1’	-	105,59	-	-		-	106,00
2’	-	167,10	-	-		-	168,37
3’	5,92 (d, J=2,0 Hz, 1H)	96,15		C-1’		5,92 (d, J=2,2 Hz, 1H)	97,13	C-2’	C-1’, C-5’
4’		163,21*					166,60
5’	5,88 (d, J=2,0 Hz, 1H)	91,62	C-4’, C-6’	C-1’		5,98 (d, J=2,2 Hz, 1H)	92,25	C-6’	C-1’, C-3’
6’		164,82*					165,08
1		135,49					143,22
2	7,54-7,49 (m, 2H)	128,21		C-4, C-6		7,28-7,23 (m, 4H)	127,07	C-1	C-4, C-6
3	7,34-7,29 (m, 3H)	128,76		C-1		7,28-7,23 (m, 4H)	129,56	C-2, C-4
4	7,34-7,29 (m, 3H)	129,91				7,19-7,17 (m, 1H)	127,07		C-2, C-6
5	7,34-7,29 (m, 3H)	128,76		C-1		7,28-7,23 (m, 4H)	129,56	C-4
6	7,54-7,49 (m, 2H)	128,21	C-1	C-4		7,28-7,23 (m, 4H)	127,07	C-1, C-5	C-2, C-4
β	7,81 (d, J=15,6 Hz, 1H)	127,52	C-1	C- β’		2,95 (t, J=7,5 Hz, 2H)	32,25	C-α, C-1	C- β’
α	7,63 (d, J=15,6 Hz, 1H)	141,92	C- β’	C-1		3,28 (t, J=7,5 Hz, 2H)	47,11	C- β, C- β’	C-1
β’		192,53					205,83
OH-2’	14,35 (s, 1H)		C-2’	C-1’, C-3’
OH-4’
OCH3-6’	3,83 (s, 3H)	55,71				3,86 (s, 3H)	56,27		C-6’

• ^*
  Valores podem estar trocados.

2',4'-di-hidroxi-6'-metoxidi-hidrochalcona (3) cristais amarelos, P.F.=174-176 ºC (lit. 185-187 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (500 e 125 MHz, CD₃OD), (Tabela 2).

7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4) cristais amarelos, P.F. = 158,5-160,5 ºC (lit.190-192 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (300 e 75 MHz, acetona-d₆), (Tabela 3).

Tabela 3
Dados de RMN de ¹H e ¹³C de 4 (δ, 300 e 75 MHz, acetona-d₆) 5 (δ, 300 e 75 MHz, DMSO-d₆) e 6 (δ, 300 e 75 MHz, acetona-d₆)

H/C	4				5	6
	δH	δC	2 J	3 J	δH	δC	δH	δC
2	5,55 (dd, J=12,7 e 3,0 Hz, 1H)	80,16			5,58 (dd, J=12,0 e 3,0 Hz, 1H)	78,31	5,54 (dd, J=12,4 e 3,0 Hz, 1H)	79,91
3	2,97 (dd, J=12,7 e 16,38 Hz); 2,71 (dd, J=16,38 e 3,0 Hz, 1H)	46,44	C-4, C-2	C-1’	3,26 (dd, J=17,1 e 12,0 Hz); 2,86 (dd, J=17,1 e 3,0 Hz, 1H)	42,46	2,98 (dd, J=12,4 e 16,4 Hz); 2,74 (dd, J=16,4 e 3,0 Hz, 1H)	46,46
4		188,12				196,66		188,33
5		158,85				155,75		159,72
6	6,21 (s, 1H)	94,02	C-7, C-5	C-8, C-10	6,22 (s, 1H)	92,58	6,40 (s, 1H)	91,25
7		157,35			-	157,23		158,74
8		130,29			-	126,65		131,98
9		157,47			-	148,02		157,14
10		106,55			-	102,34		107,16
1’		140,69			-	138,87		140,73
2’	7,62-7,61 (m, 2H)	127,14		C-4’, C-2, C-6’	7,57-7,55 (m, 2H)	126,58	7,61-7,58 (m, 2H)	127,14
3’	7,59-7,36 (m, 3H)	129,56	C-2’	C-5’, C-1’	7,46-7,37 (m, 3H)	128,43	7,48-7,36 (m, 3H)	129,54
4’	7,59-7,36 (m, 3H)	129,28		C-6’, C-2’	7,46-7,37 (m, 3H)	128,36	7,48-7,36 (m, 3H)	129,23
5’	7,59-7,36 (m, 3H)	129,56	C-6’	C-3’, C-1’	7,46-7,37 (m, 3H)	128,43	7,48-7,36 (m, 3H)	129,54
6’	7,62-7,61 (m, 2H)	127,14		C-4’, C-2, C-2’	7,57-7,55 (m, 2H)	126,58	7,61-7,58 (m, 2H)	127,14
OCH3-5	3,79 (s, 3H)	56,22		C-5	-	-	3,94 (s, 3H)	56,59
OCH3-7		-			3,84 (s, 3H)	56,12	3,86 (s, 3H)	56,45
OCH3-8	3,76 (s, 3H)	61,32		C-8	-	-	3,71 (s, 3H)	60,99
OH-5		-			11,80 (s, 1H)	155,75
OH-7	9,03 (sl, 1H)	-			-
OH-8		-			8,18 (s, 1H)	126,65

7-acetoxi-5,8-dimetoxiflavanova (4a), RMN de ¹H e ¹³C (200 e 50 MHz, CDCl₃).

5,8-di-hidroxi-7-metoxiflavanona (5) cristais amarelos, P.F. = 216-218 ºC (lit. 220-225 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (300 e 75 MHz, DMSO-d₆), (Tabela 3).

5,7,8-trimetoxiflavanona (6) cristais amarelos, P.F. = 160-162 ºC (154-156 ºC), RMN de ¹H e ¹³C (300 e 75 MHz, CDCl₃), (Tabela 3).

Avaliação da atividade antimicrobiana

O método usado foi a técnica de difusão em meio sólido.¹⁵ Em placas estéreis foi depositado 1 mL de cada cepa de microrganismo em suspensão em soro fisiológico, padronizada pelo tubo 0,5 da escala de McFarland e ajustada para 90% T (530 nm), correspondendo aproximadamente a 10⁶ UFC. Em seguida, adicionou-se 21 mL do meio sólido fundido a 50 ºC. Quando solidificado, foram feitas no meio de cultura cavidades de 6 X 8 mm de diâmetro. Após essa etapa, foram depositados 50 μL do composto 4 solubilizado em DMSO em diferentes concentrações. Os controles foram realizados com cloranfenicol para bactérias e cetoconazol para fungos. Os ensaios foram incubados a 24-48 h para bactérias e leveduras a temperatura ambiente (28-30 ºC) e durante 10-14 dias para fungos filamentosos.¹⁶ A atividade biológica do produto foi considerada positiva quando o halo de inibição de crescimento foi igual ou superior a 8 mm de diâmentro.¹⁷ Para os ensaios de avaliação da atividade antimicrobiana foram utilizados os seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus - ATCC 6528, Staphylococcus epidermidis - ATCC 12.228, Pseudomonas aeruginosa - LM B6, Escherichia coli - B 04, Candida albicans - LM 32, Candida tropicalis - LM 25, Candida knisei - LM 07, Candida guilliermondii - LM 16, Trichophyton rubrum - LM 75, Trichophyton mentagrophytes - LM 06, Microsporum caniis - LM 828, Aspergillus flavus - LM 27, Penicillium - LM 131 e Fusarium - LM 135.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O espectro no IV de 1 (ν_max., KBr, cm^-1) mostrou banda de absorção forte em 3.511 cm^-1 com ombro em 3.458 cm^-1, sugerindo a presença de hidroxilas livre e quelada, bandas fracas entre 3.081-3.028 cm^-1 e 2.992-2.832 cm^-1, características de deformação axial de C-H olefínicos e de estiramento C-H de grupos metílicos e metínicos, além de bandas intensas entre 1.601 cm^-1 - 1.434 cm^-1 e em 1632 cm-1, sugestivas de deformação axial C=C de anel aromático e de grupamento carbonílico na molécula.¹⁸

O espectro de RMN de ¹H (acetona-d₆, 300 MHz) de 1 mostrou sinais característicos de hidroxila quelada (d_H 14,40), de grupamento carbonílico a, β insaturado {d_H: 8,03 (d, J=15,6 Hz) e 7,78 (d, J=15,6 Hz)], este corroborado pela presença de um sinal em d_C 193,79 no espectro de RMN ¹³C (técnica BB), de anel aromático monossubstítuido [d_H 7,74-7,70 (m, 2H); d_H 7,49-7,42 (m, 3H)] e pentassubstítuido [d_H 9,17 (sl, 1H); d_H 6,13 (s, 1H); d_H 3,98 (s, 3H); d_H 3,76 (s, 3H) e d_H 14,40 (s, 1H)] e permitiu atribuir d_H: 14,40; 8,03; 7,78; 7,74-7,70; 7,49-7,42 e 3,76, respectivamente, para as posições 2', β, a, 2/6, 3/4/5 e OCH₃-3', a última definida pelas correlações d_H 14,40/d_C 130,07; d_C 106,69; d_C 160,89 e d_H 3,76/130,07, encontradas no experimento HMBC, que também definiu os sinais em d_C: 160,89 e 106,69 para C-2' e C-1', respectivamente. O deslocamento químico de OCH₃-3' (d_C 60,69) permitiu propor a presença de substituinte na posição 4'; tal dado, ao lado das correlações cruzadas entre o sinal em d_H 6,13 com d_C: 130,07; 106,69; 159,84 e 158,14, definiu d_H 6,13 para H-5', originando as possibilidades estruturais A (OH-4' e OCH₃-6') e B (OH-6' e OCH₃-4')

Preparação do derivado acetilado de 1 (1a) mostrou, no espectro ¹H x ¹H NOESY (CDCl_3, 200 MHz), correlação entre d_H 2,34 (s, 3H, CH₃) e d_H 6,62 (s, 1H, H-5' ) e permitiu sugerir d_H 2,34 para a metila da acetoxila na posição 4' ou 6'. Tal dado aliado ao sinal da correlação entre d_H 2,34 e d_H 3,75 (OCH₃-3') sugeriu substituinte OH [d_H 9,17(sl, 1H)] em C-4' (A), proposta corroborada pelo espectro no UV de 1 (λ_max., CH₃OH), o qual mostrou um deslocamento batocrômico da banda I de 361 nm para 389 nm (após a adição de acetato de sódio) indicando a presença de uma chalcona¹⁰ com grupo OH livre na posição 4' do anel A¹⁹ e, consequentemente, o substituinte metoxílico em d_H 3,98 para C-6' em 1.

Os demais sinais vistos no espectro de RMN de ¹³C de 1 (acetona-d₆, 75 MHz) foram atribuídos com o auxílio dos espectros bidimensionais HMQC (300/75 MHz, acetona-d₆) e HMBC (300/75 MHz, acetona-d₆) (Tabela 1).

Análise conjunta dos dados extraídos dos espectros citados permitiu sugerir que 1 trata-se de: 2',4'-di-hidroxi-3',6'-dimetoxichalcona (Figura 1), já isolada de uma espécie da família Poligonaceae,²⁰ mas pela primeira vez em Piperaceae. O derivado 1a é descrito pela primeira vez na família Piperaceae.

Figura 1
Compostos isolados e derivados obtidos das partes aéreas de P. glandulosissimum

O espectro de 2 no IV (ν_max., KBr, cm^-1) mostrou bandas de absorção em 3.433 cm^-1, indicativa de grupamento hidroxila na molécula, entre 3.065 cm^-1 e 2.851 cm^-1, sugestivas de de formação axial de C-H de olefinas e de grupos metílicos e metínicos, e em 1.682 cm^-1 e 1.125 cm^-1 que apontaram para a presença de grupamento carbonílico e para deformação axial de C-O-C de alquilaril éter,²¹ respectivamente.

O espectro de UV (λ_max., CH₃OH) apresentou a banda I em 348 nm e um ombro em 310 nm. O uso de AlCl₃/HCl provocou um deslocamento batocrômico da banda I para 375 nm, com magnitude de 27 nm em relação ao espectro em CH₃OH e ainda fez emergir uma banda II em 310 nm, esta menos intensa que a primeira, o que é característico de chalconas.¹⁰

O espectro de RMN de ¹H (CDCl₃, 200 MHz) de 2, semelhante ao de 1, sugeriu que 2 difere de 1 apenas quanto a substituição do anel A. O sinal simples em d_H 14,35, característico de hidroxila quelada em C-2', mostrou, no experimento bidimensional HMBC, correlações com os sinais em d_C 167,10, 105,59 e 96,15 e foram atribuídas as posições 2', 1' e 3', respectivamente. O espectro HMQC (CDCl_3, 200/50 MHz) mostrou correlação de d_C 96,15 e d_H 5,92 (d, J=2,0 Hz, 1H), o que permitiu atribuir este sinal a H-3' e, consequentemente, d_H 5,88 (d, J=2,0 Hz, 1H) para a posição 5'. O singleto em d_H 3,83 (3H), juntamente com a correlação mostrada no HMBC, de d_H 5,88 com os sinais: d_C 164,82 e d_C 163,21, sugeriram a existência de mais dois carbonos oxigenados no anel A e permitiram definir C-6'e C-4' como as posições que sustentam metoxila (d_H 3,83, s, 3H) e hidroxila, respectivamente, uma vez que a inversão dessas posições levaria a um único valor de deslocamento químico para os dois hidrogênios (H-3' e H-5') do anel A. Os demais carbonos da molécula foram atribuídos com o auxílio dos espectros ¹H x ¹³C- HMQC e HMBC (Tabela 2).

Análise dos espectros de RMN ¹H e ¹³C uni e bidimensionais, IV e UV, e comparações com modelos da literatura, permitiram sugerir que 2 seja 2',4'-di-hidroxi-6'-metoxichalcona (Figura 1), conhecida como cardamonina e já isolada de espécies de Piper,²² e de espécies de Fabaceae,²³ Lauraceae²⁴ e Pteridaceae.²⁵

O espectro no IV de 3 (ν_max., KBr, cm^-1) apresentou bandas de absorção em: 3.292, 1.373, 1.653, sendo as duas primeiras típicas de deformação axial de O-H em ligação de hidrogênio intramolecular e deformação angular no plano de OH, respectivamente e a terceira da presença de carbonila em ligação de hidrogênio.¹⁴ Anel aromático foi inferido a partir de bandas observadas em 1.618 e 1.568 cm^-1, referentes à deformação axial de C=C de anel aromático. Bandas intensas em 1.298 e 1.195 cm^-1 foram atribuídas a estiramento e deformação de grupo C-O.

O espectro de UV de 3 (λ_max., CH₃OH e CH₃OH + AlCl₃) apresentou uma banda de absorção em 289 nm, além de um ombro em 332 nm, sugerindo núcleo flavonoídico tipo di-hidrochalcona.¹³ O uso de AlCl₃ provocou deslocamento batocrômico das bandas II e I para 310 e 365 nm, respectivamente.

O espectro de RMN de ¹H de 3 (CD₃OD, 500 MHz), semelhante a 2, diferiu apenas quanto a ausência de sinais correspondentes a hidrogênios olefínicos a, β-carbonílicos, sugerindo a estrutura de uma di-hidrochalcona, que foi confirmada pela presença de dois tripletos em d_H 3,28 (J=7,5 Hz, 2H) e d_H 2,95 (J=7,5 Hz, 2H), vistos correlacionados no espectro bidimensional ¹H x ¹H - COSY. O experimento gHMBC mostrou as correlações: d_H 3,28/d_C 32,25; d_C 143,22 e d_C 205,83 e d_H 2,95/d_C 47,11; d_C 143,22 e d_C 205,83 que permitiram propor d_H 3,28 e d_H 2,95 para as posições a e β e atribuir d_C 32,35; d_C 47,11; d_C 143,22 e d_C 205,83 para os carbonos β, a, 1 e β', respectivamente. O espectro HMBC ainda apresentou as correlações: d_H 5,98 (d, J=2,2 Hz, 1H)/d_C: 166,60; 106,00; 165,08 e 97,13 e de d_H 5,92 (d, J=2,2 Hz, 1H)/d_C: 106,00 e 92,25, o que permitiu sugerir d_H 5,98 e d_H 5,92 para H-5' e H-3' e os sinais de carbono em d_C: 166,60; 106,00; 165,08; 97,13 e 92,25 para as posições 4', 1', 6', 3' e 5', respectivamente. As correlações cruzadas d_H 3,86 (s, 3H)/d_C 165,08 e d_H 3,86 (s, 3H)/d_H 5,98 vistas, respectivamente, nos experimentos gHMBC e NOESY, corroboraram d_H 3,86/d_C 165,08 e d_C 166,60 para as posições 6' e 4' e permitiram inferir d_C 168,37 para C-2'. Os dados relatados e sumarizados na Tabela 2 permitem identificar 3 (Figura 1) como 2'-4'-di-hidroxi,6'-metoxidi-hidrochalcona, conhecida como uvangoletina²⁶ e anteriormente descrita em algumas famílias, como Myrtaceae,²⁷ Annonaceae,²⁸ Piperaceae.²⁹

O espectro no IV de 4 mostrou bandas em 3.552 cm^-1, 3.473 cm^-1 e 3.242 cm^-1, atribuídas a grupos hidroxila e deformação axial de C-H de carbonos aromáticos. Absorções na região entre 2.983 cm^-1 e 2.851 cm^-1 são oriundas de estiramento C-H de grupos metílicos, metilênicos e metínicos. Bandas devidas à deformação axial de C=C aromáticos são visíveis na região entre 1.605 cm^-1 e 1.429 cm^-1 e em 1.647 cm^-1 absorção de deformação axial de C=O. Bandas de deformação axial de C-O-C assimétrica e simétrica de alquilaril éteres foram observadas em 1.285 cm^-1, 1.200 cm^-1 e 1.114 cm^-1, sugerindo a presença de função éter no composto.

O espectro no UV, em CH₃OH, mostrou banda I em 324 nm e banda II em 288 nm, esta última de maior intensidade, o que sugere esqueleto de flavanona.¹³ A adição de acetato de sódio ao metanol provocou deslocamento batocrômico da banda II para 328 nm, numa magnitude de 40 nm, que sugeriu a presença de grupo 7-OH livre na molécula.

O espectro de RMN de ¹H de 4 (acetona-d₆, 300 MHz) mostrou sinais em d_H 9,03 (sl, 1H), d_H 3,79 (s, 3H) e d_H 3,76 (s, 3H), característicos de hidroxila aromática não quelada e de duas metoxilas aromáticas, respectivamente, além de um sinal simples em d_H 6,21 (1H), dois multipletos em d_H 7,62-7,61 (m, 2H) e d_H 7,59-7,36 (m, 3H) e três duplo dubletos em d_H 5,55 (J=12,7 e 3,0 Hz, 1H); d_H 2,97 (J=12,7 e 16,38 Hz, 1H) e d_H 2,71 (J=16,38 e 3,0 Hz, 1H). A análise dos duplos dubletos, aliada às correlações observadas no experimento COSY entre d_H 5,55/d_H 2,71 e d_H 2,97, sugeriram estes sinais para hidrogênios oxi-metínico (H-2) e metilênicos (H-3) de esqueleto flavanônico. Correlações vistas no HMQC entre d_H 5,55/d_C 80,16 e d_H 2,97 e d_H 2,71/d_C 46,44 permitiram atribuir d_C 80,16 e d_C 46,44 a C-2 e C-3. Esses dados aliados à presença dos dois sinais múltiplos em d_H 7,62-7,61 (2H) e d_H 7,59-7,36 (3H) permitiram sugerir que o composto 4 trata-se de uma flavanona com anel B monossubstítuido e anel A pentassubstítuido com duas metoxilas e uma hidroxila.

As correlações vistas no espectro HMBC entre: d_H 7,62-7,61/d_C 80,16 permitiram a atribuição de d_H 7,62-7,61/d_C 127,14 para as posições 2'/6'; d_H 2,71/ d_C 188,12 e d_H 2,97/d_C 188,12 e 140,69 sugeriram d_C 188,12 e 140,69 para C-4 e C-1', respectivamente. O sinal em d_H 6.21 mostrou correlação direta, no espectro HMQC, com d_C 94,02 e foi sugerido para H-6. No HMBC foram observadas as correlações: d_H 6,21/d_C 158,85; 106,55; 130,29 e 157,35; d_H 3,76/d_C 130,29; d_H 3,79/d_C 158,85, além das correlações d_H 3,79/d_C 56,22 e d_H 3,76/d_C 61,32, vistas no experimento HMQC, que permitiram sugerir d_H 3,79/d_C 56,22 e d_H 3,76/d_C 61,32, para as posições 5 e 8 e, consequentemente, d_C: 130,29; 158,85 e 106,55 para C-8, C-5 e C-10 do anel A de 4. A posição da hidroxila em C-7 e, consequentemente, de d 6,21 (s, 1H) para H-6 foi estabelecida a partir da análise do espectro HMBC que mostrou a correlação de d_H 6,21/d_C 106,55 (C-10) e d_C 157,35 (C-7). Os espectros de ¹H e ¹³C (200 e 50 MHz, CDCl₃) do derivado acetilado 4a mostraram os sinais dos átomos de carbonos das metoxilas em d_C 56,30 e d_C 60,95, além do sinal da acetoxila em d_C 149,29, confirmando as posições das metoxilas em 5 e 8 e a presença de grupo OH em C-7 de 4. O sumário dos dados extraídos dos espectros analisados encontra-se na Tabela 3 e permite propor que 4 trata-se de 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona³⁰ (Figura 1), isolado pela primeira vez na família Piperaceae.

Os espectros de RMN ¹H de 5 (DMSO, 300 MHz) e 6 (Acetona-d₆, 300 MHz) mostraram sinais característicos de esqueleto flavanônico com anel B não substítuido, como em 4, diferindo apenas quanto ao padrão de substituição do anel A. O espectro de 5 apresentou quatro sinais simples em d_H: 11,80 (1H); 8,18 (1H); 6,22 (1H) e 3,84 (3H), os dois primeiros sugestivos de substituintes hidroxílicos e o último de grupo metoxílico no anel A do esqueleto flavanônico. O sinal em d_H 11,80 permitiu definir a presença de grupo OH-5; além disso, as correlações deste sinal com d_C 92,58; d_C 102,34 e d_C 155,75; vistas no espectro HMBC (DMSO, 300 e 75 MHz), permitiram atribuí-los para C-6, C-10 e C-5 e, portanto, o sinal em d_H 6,22 (s, 1H), que no experimento HMQC (DMSO, 300 e 75MHz) mostrou correlação com d_C 92,58, para H-6. As posições de OCH₃ (d_H 3,84, s, 3H) e OH (d_H 8,18, s, 1H) foram definidas para C-7 e C-8 por meio das correlações: d_H 6,22/d_C 126,65 e 157,23; d_H 3,84/d_C 157,23 e de d_H 8,18/d_C 126,65, 157,23 e 148,02, vistas no experimento HMBC e, como consequência, d_C 157,23; d_C 126,65 e d_C 148,02 foram definidos para os carbonos 7, 8 e 9, respectivamente. O espectro de RMN ¹H de 6 apresentou quatro sinais em d_H : 3,71 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,94 (s, 3H) e 6,40 (s, 1H), os três primeiros característicos de metoxílas em anel aromático, o que permitiu deduzir a presença de anel A pentasubstítuido; por outro lado, o espectro bidimensional HMBC (Acetona-d₆, 300 e 75 MHz) mostrou correlações de d_H 3,71/d_C 131,98, d_H 3,86/d_C 158,74, d_H 3,94/d_C 159,72 e de d_H 6,40/d_C 159,72; 158,74; 131,98 e 107,16, que ao lado das correlações vistas no HMQC (Acetona-d₆, 300 e 75 MHz): d_H 3,71/d_C 60,99, d_H 3,86/d_C 56,45, d_H 3,94/d_C 56,59 e d_H 6,40/d_C 91,25 permitiram sugerir os sinais d_H 3,71/d_C 60,99 para a posição 8 do anel aromático e os demais em d_H 3,86 e d_H 3,94 para as posições 7 e 5, respectivamente. A flavanona 5 já foi isolada das folhas de Uvaria scheffleri,³¹ mas não de Piperaceae, e a flavanona 6 (Figura 1) é descrita pela segunda vez no gênero Piper.³²

Atividade antimicrobiana de 7-hidroxi-5,8- dimetoxiflavanona (4)

Os resultados para a atividade antimicrobiana são mostrados na Tabela 4. O composto 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4) mostrou atividade antibacteriana fraca contra Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis. De uma forma geral, o efeito antibacteriano dos flavonoides deve-se a presença de grupos fenólicos que apresentam afinidade para as proteínas e, por essa razão, atuam como inibidores de enzimas bacterianas, assim como interferem nas suas vias de síntese.³³ Já a atividade antifúngica contra Trichophyton mentagrophytes e Microsporum canis mostrou-se bem mais promissora, com a formação de halos de inibição de 20 e 22 mm, respectivamente, valores de diâmetro próximos aos halos de inibição dos antifúngicos controle. Os flavonoides exibem uma ampla capacidade de inibir a germinação de esporos patogênicos em plantas.³⁴ Estes compostos também têm a capacidade de formar complexos com proteínas solúveis presentes nas paredes das células fúngicas e, por isso, têm sido frequentemente propostos para combater infecções causadas por fungos no homem.³⁵

Tabela 4
Valores médios dos halos de inibição (mm) da avaliação da CIM de 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4) sobre bactérias e fungos, em meio sólido

Microrganismo e cepa testada	400 μg/mL	200 μg/mL	100 μg/mL	50 μg/mL	Controle: Cloranfenicol (30 μg/mL)	Controle: Cetoconazol (100 μg/mL)
Staphylococcus aureus - ATCC 6528	12	10	7	0	20	_
Staphylococcus epidermidis - ATCC 12.228	10	0	0	0	21	_
Trichophyton mentagrophytes - LM 06	20	16	12	8	_	22
Microsporum caniis - LM 828	22	18	13	10	_	23

Não houve inibição do crescimento para os demais microrganismos testados.

CONCLUSÃO

O estudo químico de Piper glandulosissimum Yuncker e o consequente isolamento desses compostos contribuem para uma maior compreensão da quimiossistemática do gênero Piper³ e da família Piperaceae. Este é um dos primeiros relatos de estudo químico desta espécie e os compostos isolados pertencem a um grupo de metabólitos secundários (flavonoides) que responde por cerca de 4% do montante de compostos isolados no gênero Piper. Em pesquisas anteriores com Piper montealegreanum¹⁰ e Piper carniconnectivum,¹⁰ duas espécies de Piper oriundas também da região Norte do Brasil, foram obtidos vários flavonoides, alguns deles com um ótimo potencial biológico. A continuação dos estudos químico-farmacológicos com espécies desse gênero tem se mostrado bastante promissora, pois além de novos compostos isolados na família, tem sido registradas atividades biológicas interessantes, como é o caso da atividade antifúngica obtida com o composto 7-hidroxi-5,8-dimetoxiflavanona (4).

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pelo suporte financeiro, à Dra. Maria das Graças B. Zoghbi (Museu Paraense Emílio Goeldi) pela coleta do material vegetal, à Dra. Elsie Guimarães pela identificação do material botânico, a Vicente Carlos Oliveira Costa e ao Prof. Edilberto Rocha Silveira pelos espectros de RMN.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Fev 2015

Histórico

• Recebido
  26 Mar 2014
• Aceito
  23 Out 2014