A Interleucina 1-beta mostra uma ação protetora na fase aguda do modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina

The il1β have a protective action in the acute phase of the pilocarpine-induced epilepsy model

ORIGINAL ARTICLE

A Interleucina 1-beta mostra uma ação protetora na fase aguda do modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina^*

The il1 β have a protective action in the acute phase of the pilocarpine-induced epilepsy model

VDB Pascoal^I; RB Marchesini^I; AHB Matos^I; FF Conte^I; TC Pereira^II; R Gilioli^III; JM Malheiros^IV; RS Polli^IV; HH Buzzá^IV; A Tannús^IV; L Covolan^V; EA Cavalheiro^VI; L Velloso^VII; F Cendes^VIII; I Lopes-Cendes^I

^IDepartamento de Genética Medica, FCM-UNICAMP, Campinas, SP. CINAPCE: Cooperação Interinstitucional de Apoio a Pesquisa sobre o Cérebro

^IIDepartamento de Genética Medica, FCM-UNICAMP, Campinas, SP. Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP, Ribeirão Preto, SP

^IIICentro Multidisciplinar de Investigação Biológica (CEMIB)-UNICAMP, Campinas, SP

^IVDepartamento de Física e Bioinformática, IFSC, USP, Laboratório de Ressonância Magnética, São Carlos, SP. CINAPCE: Cooperação Interinstitucional de Apoio a Pesquisa sobre o Cérebro

^VDepartamento de Fisiologia, UNIFESP/EPM, SP. CINAPCE: Cooperação Interinstitucional de Apoio a Pesquisa sobre o Cérebro

^VIDisciplina de Neurologia Experimental, Departamento de Neurologia e Neurocirurgia UNIFESP/EPM, SP. CINAPCE: Cooperação Interinstitucional de Apoio a Pesquisa sobre o Cérebro

^VIIDepartamento de Clínica Médica, FCM-UNICAMP

^VIIIDepartamento de Neurologia, FCM-UNICAMP, Campinas, SP. CINAPCE: Cooperação Interinstitucional de Apoio a Pesquisa sobre o Cérebro

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: Existem contradições na literatura quanto aos efeitos dos genes il1β e il1rn nas epilepsias. Nosso objetivo foi avaliar os efeitos do silenciamento desses dois genes na fase aguda do modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina.

MÉTODOS: Para alterar a expressão dos genes il1β e il1rn utilizamos a técnica de interferência por RNA.

RESULTADOS: Obtivemos taxas de silenciamento significativas para os dois genes no sistema nervoso central. Observamos efeitos fenotípicos significativos, incluindo a alteração na taxa de mortalidade dos animais 5 dias após a indução do modelo.

CONCLUSÕES: A il1β parece exercer um papel protetor na fase aguda do modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina.

Unitermos: iRNA, il1β, il1rn, modelo animal, silenciamento, siRNA.

ABSTRACT

INTRODUCTION: There is contradictory information regarding the of effects il1β and il1rn in epilepsy. We aimed to evaluate the effect of silencing both genes in the acute phase of the pilocarpine-induced epilepsy model.

METHODS: We used RNA interference in order to achieve gene silencing.

RESULTS: We obtained significant gene silencing in the central nervous system. In addition, we observed phenotypic effects including differences in mortality rates of animals 5 days after pilocarpine injections.

CONCLUSION: Our results indicate that il1β seems to have a protective effect in the acute phase of the pilocarpine-induced epilepsy model.

Keywords: RNAi, il1β, il1rn, animal model, silencing, siRNA.

INTRODUÇÃO

A interleucina 1-beta (il1β), uma importante mediadora da resposta inflamatória no sistema nervoso central (SNC) contra traumas e processos patológicos, tem sua expressão aumentada em modelos animais de epilepsia, principalmente no induzido pela pilocarpina.¹ Em geral, o aumento na expressão do gene il1β tem sido relacionado com uma possível ação neurotóxica, o que resulta em efeitos pró-convulsivantes.^2-4 Porém, essas observações são restritas a poucos relatos e obtidas em experimentos nos quais foram utilizados inibidores não específicos.⁵ Uma nova ferramenta para o estudo funcional de genes é a interferência por RNA (RNAi). Essa técnica tem por objetivo diminuir a expressão gênica de maneira potente e altamente específica através da degradação do RNA mensageiro (RNAm) induzido por pequenas moléculas de dupla fita de RNA (siRNAs) complementares ao RNAm do gene alvo.^6-7

Com o intuito de ampliar o conhecimento a respeito do papel da il1β na homeostase neuronal e estudar sua possível ação no modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina, o objetivo de nosso trabalho foi analisar o efeito das alterações na expressão dos genes il1β e il1rn (antagonista endógeno da il1β), induzidos pela técnica de RNAi, sobre a excitabilidade neuronal durante a fase aguda do modelo.

MÉTODOS

Os animais utilizados foram previamente tratados com injeções intravenosas (veia caudal) de moléculas de siRNA contra os genes il1β e Il1rn conjugadas a um peptídeo presente no capsídeo que reveste o vírus da raiva, o RVG (Rabies Virus Glycoprotein). Este complexo siRNA:RVG teve por finalidade transportar os siRNAs através da barreira hematoencefálica (BHE), possibilitando a transfecção de células no sistema nervoso central.⁸

Injetou-se cada animal duas vezes com doses de 25 µg de siRNA em uma razão molar de 1:10 siRNA:RVG, respeitando oito horas de intervalo entre as injeções. Foram utilizados dois grupos controle (animais injetados apenas com tampão PBS ou com siGFP) e dois grupos experimentais injetados com siil1b e siil1rn. Todos os grupos foram compostos por cinco animais, e os experimentos foram sempre realizados com no mínimo uma duplicata biológica. O modelo da pilocarpina foi induzido 48 h após as injeções de siRNA pela via intraperitonial.^9-10

O tempo para a primeira crise, para o status epilépticus e o número de crises durante a fase aguda foram quantificados por dois observadores cegos. Os cérebros dos animais foram coletados, o RNA total foi extraído pelo método do Trizol e o cDNA foi sintetizado usando a Super Script III (ambos os procedimentos conforme especificações do fabricante). Os níveis de expressão dos genes il1β, il1ra, nfκβ, tnfa e do scl1α3 foram analisados através da quantificação dos transcritos pela técnica de PCR em Tempo Real. Uma parte do tecido também foi utilizada para extração total de proteínas, as quais foram quantificadas pelo método de Bradford. Em seguida, procedeu-se com experimentos de Western Blotting para a determinação da abundância das proteínas alvos. Tanto no PCR em Tempo Real quanto no Western Blotting as quantificações foram corrigidas em relação aos controles endógenos Gapdh/Hprt1 e β-actina, respectivamente.

Alguns animais foram observados fenotipicamente através de monitorização por câmera com gravação contínua (vídeo-monitorização 24 h) até o momento do sacrifício. O tecido destes animais foi também utilizado para análise histológica com colorações de Neo-Timm e Cressil.

RESULTADOS

Primeiramente, verificou-se o quão efetivo foi o silenciamento gênico causado pela inoculação dos siRNAs contra os genes il1β e il1rn. Como resultado, observou-se uma diminuição na expressão do gene il1β e na abundância da proteína de aproximadamente 65%. Foi possível verificar também que o silenciamento já podia ser detectado 24 h após as injeções de siRNA, atingindo o ápice após 48 h (coincidindo exatamente com o momento em que foi induzido o modelo da pilocarpina) e mantendo-se significativo por até 96h após as injeções. Além disso, observou-se que a expressão de dois genes (Trκ2, Plat) não relacionados à via de sinalização da il1β não sofreram alteração com o silenciamento de il1β, o que comprovou a especificidade do sistema utilizado. Além disso, demonstrou-se que o silenciamento ocorreu em diversas regiões do SNC (córtex frontal, hipocampo, cerebelo e bulbo olfatório), mas não na medula espinhal e tronco encefálico.

Como foi utilizado um complexo formado pela molécula de siRNA conjugada ao peptídeo RVG, investigou-se se não houve quebra da BHE com a injeção deste complexo. Para esse fim, foram utilizadas imagens de ressonância magnética dos animais 3 horas após a injeção do siRNA:RVG, utilizando gadolíneo como contraste.¹¹ Os resultados não evidenciaram qualquer sinal de quebra de BHE com a injeção do complexo siRNA:RVG em comparação com os controles positivos (animais após SE).¹²

A análise fenotípica dos animais demonstrou que o grupo que recebeu siil1β demorou menos tempo para ter a primeira crise, assim como para entrar em SE (p<0,05 ANOVA); efeito exatamente oposto foi visto nos animais que receberam siil1rn (p<0,05 ANOVA). Observou-se também que a taxa de recuperação dos animais nos cinco dias posteriores ao SE foi diferente entre os grupos analisados: a taxa de mortalidade dos animais controle foi de 50%, a dos tratados com siil1b foi de 75%, e dos tratados com o siil1rn, de 35%. Portanto, a análise fenotípica da fase aguda demonstra um efeito benéfico da il1β na fase imediatamente pós-dano induzido pela pilocarpina no SNC, sendo que os animais que tiveram a expressão do gene il1β diminuída nessa fase apresentaram uma evolução menos favorável. O efeito oposto aconteceu com os animais que tiveram o antagonista endógeno da il1β silenciado (aumentando a ligação da il1β ao seu receptor específico).

Com a finalidade de se investigar o possível efeito da il1κβ na excitabilidade neuronal após a injeção da pilocarpina, prosseguiu-se com o estudo de alguns genes/vias de sinalização nesse processo. Para isso, a expressão dos genes il1β, il1rn, il1r1, nfκβ (p65), p-Ikk, e Scl1α3 foi avaliada pelas técnicas de PCR em Tempo Real e Western Blotting. Como resultado, observou-se uma diferença significativa tanto da abundância de nfkb quanto de sua atividade, medida pela taxa de fostorilação da ikk. Além disso, houve uma diminuição na expressão de Scl1α3 (25%) nos animais silenciados para il1β e um aumento (30%) nos animais silenciados para il1rα. Scl1α3 é um dos principais recaptadores de glutamato no SNC e tem sua via se sinalização regulada pelo fator de transcrição nfκβ.¹³

Portanto, os resultados obtidos neste trabalho indicam que a il1β parece contribuir indiretamente para a regulação dos níveis de expressão dos genes codificadores de recaptadores de glutamato no SNC, atuando na modulação da expressão de fatores de transcrição, como o nfκβ.

A análise por Neo-Timm dos animais que sofreram crises recorrentes após 2 meses de observação (fase crônica) e que haviam sido injetados com siil1rn + pilocarpina não demonstrou diferença significativa quando comparados com os animais injetados apenas com pilocarpina. Entretanto, a análise feita nos corte corados por Nissl evidenciaram uma diminuição da morte neuronal nas regiões do hipocampo dos animais pré-tratados com os siil1rn.

DISCUSSÃO

A il1β parece exercer um papel protetor no SNC contra eventos excitotóxicos induzidos pela pilocarpina na fase aguda do modelo. O mecanismo pelo qual a il1β atua parece estar relacionado à alteração da expressão e atividade de fatores de transcrições (nfαβ), que por sua vez alteram a expressão de recaptadores de glutamato (Scl1α3).

Entretanto, esse efeito protetor da il1β, induzido indiretamente pelo silenciamento de seu antagonista endógeno (il1rn), não foi capaz de impedir a ocorrência de crises (incluindo o SE) e a reorganização sináptica na fase crônica, evidenciando a complexidade dos mecanismos envolvidos na epileptogênese.

Received June 04, 2010; accepted June 11, 2010.

• 1. Voutsinos-Porche B, Koning E, Kaplan H, Ferrandon A, Guenounou M, Nehlig A, Motte J. Temporal patterns of the cerebral inflammatory response in the rat lithium-pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol. Dis. 2004;17:385-402.
• 2. Vezzani A, Conti M, De Luigi A, Ravizza T, Moneta D, Marchesi F, De Simoni MG. Interleukin-1beta immunoreactivity and microglia are enhanced in the rat hippocampus by focal kainate application: functional evidence for enhancement of electrographic seizures. J. Neurosci. 1999;19:5054-65.
• 3. Vezzani A, Moneta D, Conti M, Richichi C, Ravizza T, De Luigi A, De Simoni MG, Sperk G, Andell-Jonsson S, Lundkvist J, Iverfeldt K, Bartfai T. Powerful anticonvulsant action of il-1 receptor antagonist on intracerebral injection and astrocytic overexpression in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000;97:11534-9.
• 4. Vezzani, A, Moneta D, Richichi C, Aliprandi M, Burrows S, Ravizza T, Perego C, De Simoni MG. Functional role of inflammatory cytokines and anti-inflammatory molecules in seizures and epileptogenesis. Epilepsia 2002;43(Suppl. 5):30-5.
• 5. Rijkers K, Majoie HJ, Hoogland G, Kenis G, De Baets M, Vles JS. The role of interleukin-1 in seizures and epilepsy: a critical review. Exp Neurol. 2009 Apr;216(2):258-71. Epub 2008 Dec 31.
• 6. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998;391:806-11.
• 7. Hannon GJ. RNA interference. Nature 2002;418:244-51.
• 8. Kumar P, Wu H, McBride JL, Jung KE, Kim MH, Davidson BL, Lee SK, Shankar P, Manjunath N. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature 2007 July 5;448(7149):39-43. Epub 2007 June 17.
• 9. Turski WA, et al. Limbic seizures produced by pilocarpine in rats: behavioural, electroencephalographic and neuropathological study. Behav Brain Res. 1983 Sept;9(3):315-35.
• 10. Cavalheiro EA. The pilocarpine model of epilepsy. Ital J Neurol Sci. 1995 Feb-Mar;16(1-2):33-7. Review.
• 11. Prior MJ, Brown AM, Mavroudis G, Lister T, Ray DE. MRI characterisation of a novel rat model of focal astrocyte loss. MAGMA. 2004 Dec;17(3-6):125-32.
• 12. Marchi N, Angelov L, Masaryk T, Fazio V, Granata T, Hernandez N, Hallene K, Diglaw T, Franic L, Najm I, Janigro D. Seizure-promoting effect of blood-brain barrier disruption. Epilepsia 2007 Apr;48(4):732-42.
• 13. Rodriguez-Kern A, Gegelashvili M, Schousboe A, Zhang J, Sung L, Gegelashvili G. Beta-amyloid and brain-derived neurotrophic factor, BDNF, up-regulate the expression of glutamate transporter GLT-1/EAAT2 via different signaling pathways utilizing transcription factor nf-kb. Neurochem Int. 2003 Sept/Oct;43(4-5):363-70.

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Trabalho premiado com o Prêmio Aristides Leão durante o XXXIII Congresso Brasileiro de Epilepsia, 03-06 junho 2010 (Brasília/DF).

FCM-UNICAMP, Campinas, SP

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Jan 2011
• Data do Fascículo
  Set 2010

Histórico

• Recebido
  04 Jun 2010
• Aceito
  11 Jun 2010