Metalo-beta-lactamases

Metallo-beta-lactamases

Resumos

Nos últimos anos tem sido observada maior incidência de bacilos Gram-negativos resistentes a cefalosporinas de espectro ampliado no ambiente hospitalar, ocasionando, assim, maior uso de betalactâmicos mais potentes, como os carbapenens. A utilização de carbapenens exerce maior pressão seletiva sobre a microbiota hospitalar, o que pode ocasionar aumento da resistência a esses agentes. Entre os mecanismos de resistência a carbapenens mais comumente identificados estão a produção de betalactamases, como, por exemplo, as pertencentes à classe D de Ambler e as que pertencem à classe B de Ambler, ou metalo-beta-lactamases (MbetaL). Essas últimas hidrolisam todos betalactâmicos comercialmente disponíveis, sendo a única exceção o monobactam aztreonam. Desde o início da década de 1990, novos genes que codificam MbetaLs têm sido descritos em microrganismos clinicamente importantes, como Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e membros da família Enterobacteriaceae. O encontro desses microrganismos não-sensíveis a carbapenens pode ser submetido a metodologias fenotípicas para detecção da produção de MbetaL com o intuito de auxiliar a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) e prevenir a disseminação desses determinantes de resistência, uma vez que genes que codificam MbetaLs estão contidos em estruturas genéticas que propiciam sua mobilidade de forma muito efetiva, sendo então facilmente disseminados.

Bacilo Gram-negativo; Resistência a carbapenens; Metalo-beta-lactamase; Integron; Cassete gênico

Increase isolation of Gram-negative bacilli resistant to broad-spectrum cephalosporin has been observed during the last few years, thus determining the use of more potent beta-lactams, such as carbapenems. The use of these antimicrobial agents may lead to the emergence of carbapenem resistant Gram-negative bacilli in the nosocomial environment. Carbapenem resistance may be due to the production of Ambler class D beta-lactamase or Ambler class B beta-lactamase, also called metallo-beta-lactamase (MbetaL). Apart from the monobactam aztreonam, this class of enzyme virtually hydrolyze all the commercially available beta-lactams. Since 90s, several clinical important nosocomial microorganisms, including members of Enterobacteriaceae family, Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp., have been found to produce MbetaLs enzymes. When these carbapenem non-susceptible strains are found, they may be submitted to phenotypic MbetaL detection test in the microbiology laboratory in order to help infection control practioners and prevent the MbetaL gene dissemination, once these genes are embedded in mobile genetic elements, which can spread rapidly to other Gram-negative species.

Gram-negative bacilli; Carbapenem resistance; Metallo-beta-lactamase; Integron; Gene cassette

ARTIGO DE REVISÃO REVIEW PAPER

Metalo-b-lactamases

Metallo-b-lactamases

Rodrigo Elisandro Mendes, Ph.D.; Mariana Castanheira, Ph.D.; Antonio Carlos Campos Pignatari, Ph.D.; Ana Cristina Gales, Ph.D.

Disciplina de Infectologia da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo (EPM/UNIFESP); Laboratório ALERTA; Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Nos últimos anos tem sido observada maior incidência de bacilos Gram-negativos resistentes a cefalosporinas de espectro ampliado no ambiente hospitalar, ocasionando, assim, maior uso de betalactâmicos mais potentes, como os carbapenens. A utilização de carbapenens exerce maior pressão seletiva sobre a microbiota hospitalar, o que pode ocasionar aumento da resistência a esses agentes. Entre os mecanismos de resistência a carbapenens mais comumente identificados estão a produção de betalactamases, como, por exemplo, as pertencentes à classe D de Ambler e as que pertencem à classe B de Ambler, ou metalo-b-lactamases (MbL). Essas últimas hidrolisam todos betalactâmicos comercialmente disponíveis, sendo a única exceção o monobactam aztreonam. Desde o início da década de 1990, novos genes que codificam MbLs têm sido descritos em microrganismos clinicamente importantes, como Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e membros da família Enterobacteriaceae. O encontro desses microrganismos não-sensíveis a carbapenens pode ser submetido a metodologias fenotípicas para detecção da produção de MbL com o intuito de auxiliar a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar (CCIH) e prevenir a disseminação desses determinantes de resistência, uma vez que genes que codificam MbLs estão contidos em estruturas genéticas que propiciam sua mobilidade de forma muito efetiva, sendo então facilmente disseminados.

Unitermos: Bacilo Gram-negativo, Resistência a carbapenens, Metalo-b-lactamase, Integron, Cassete gênico.

ABSTRACT

Increase isolation of Gram-negative bacilli resistant to broad-spectrum cephalosporin has been observed during the last few years, thus determining the use of more potent b-lactams, such as carbapenems. The use of these antimicrobial agents may lead to the emergence of carbapenem resistant Gram-negative bacilli in the nosocomial environment. Carbapenem resistance may be due to the production of Ambler class D b-lactamase or Ambler class B b-lactamase, also called metallo-b-lactamase (MbL). Apart from the monobactam aztreonam, this class of enzyme virtually hydrolyze all the commercially available b-lactams. Since 90s, several clinical important nosocomial microorganisms, including members of Enterobacteriaceae family, Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp., have been found to produce MbLs enzymes. When these carbapenem non-susceptible strains are found, they may be submitted to phenotypic MbL detection test in the microbiology laboratory in order to help infection control practioners and prevent the MbL gene dissemination, once these genes are embedded in mobile genetic elements, which can spread rapidly to other Gram-negative species.

Key words: Gram-negative bacilli, Carbapenem resistance, Metallo-b-lactamase, Integron, Gene cassette.

Introdução

Nos últimos anos tem sido observada maior incidência de bacilos Gram-negativos resistentes a cefalosporinas de espectro ampliado no ambiente hospitalar, ocasionando, assim, maior uso de betalactâmicos mais potentes, como os carbapenens⁽⁵⁹⁾. Atualmente esses agentes são importantes opções terapêuticas utilizadas no tratamento de infecções nosocomiais. Isso se deve a sua elevada afinidade pelas proteínas ligadoras de penicilina do tipo 2 (PBP2), estabilidade a muitas betalactamases, incluindo as de espectro ampliado (ESBL) e as cromossômicas (AmpC), e excelente permeabilidade através da membrana externa bacteriana⁽⁷⁸⁾.

A maior utilização de carbapenens no ambiente hospitalar acaba por ocasionar maior pressão seletiva sobre a microbiota nosocomial, o que favorece a seleção de subpopulações de microrganismos com sensibilidade diminuída ou resistente a esses antimicrobianos. Atualmente, amostras bacterianas de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. resistentes a grande maioria dos agentes antimicrobianos e sensíveis somente à polimixina B têm sido isoladas pelos laboratórios de microbiologia clínica na maior parte dos hospitais brasileiros⁽²³⁾.

A produção de betalactamase cromossômica, a qual pode ser induzível, é responsável pela resistência intrínseca de P. aeruginosa e Acinetobacter spp. aos betalactâmicos, como penicilinas e cefalosporinas^{(38, 54)}. Entretanto a resistência às cefalosporinas de espectro ampliado pode ser decorrente da hiperexpressão de betalactamase cromossômica associada à diminuição da permeabilidade da membrana externa (mediada pela perda ou expressão reduzida de proteínas de membrana externa, conhecidas como porinas), ou, ainda, hiperexpressão de bombas de efluxo, as quais reduzem a concentração do antimicrobiano na célula bacteriana por meio da extrusão do mesmo^{(37, 38, 54)}.

Outros mecanismos que conferem resistência aos betalactâmicos de espectro ampliado e carbapenens têm sido descritos⁽⁵⁶⁾, como a produção das betalactamases pertencentes à classe D de Ambler^{(1, 6, 22, 27)} e as que pertencem à classe B de Ambler, também denominadas metalo-b-lactamases (MbL). Adicionalmente, a produção dessas enzimas tem sido comumente responsável pelo fenótipo de resistência a esses betalactâmicos⁽⁷²⁾. As MbLs são betalactamases pertencentes à classe B de Ambler ou à classe 3 de Bush-Jacoby-Medeiros e hidrolisam todos os betalactâmicos comercialmente disponíveis, sendo a única exceção o monobactam, aztreonam⁽⁷⁾. Essas enzimas caracterizam-se por necessitarem de dois íons divalentes, usualmente zinco, como co-fator para atividade catalítica, por terem a mesma estrutura tridimensional e por apresentarem resíduos conservados, os quais são responsáveis pela interação da enzima com cátions divalentes⁽⁴⁴⁾. Além disso, essas enzimas são inibidas pelo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou por compostos derivados do ácido tiolático (i.e., ácido 2-mercaptopropiônico), não sendo impedidas por inibidores de serino-betalactamases disponíveis comercialmente, como o ácido clavulânico, o sulbactam e o tazobactam⁽⁸⁾.

Epidemiologia das metal-b-lactamases

As MbLs são produzidas intrinsecamente por determinados microrganismos, como Stenotrophomonas maltophilia^{(3, 19, 65)}, Bacillus cereus⁽⁶⁷⁾, Chryseobacterium meningosepticum⁽⁶³⁾, Chryseobacterium indologenes, Legionella gormanii, Caulobacter crescentus⁽⁶⁴⁾ e Aeromonas spp.^{(39, 75, 76)}. Contudo, desde o início da década de 1990, novos genes que codificam MbLs têm sido descritos em patógenos clinicamente importantes, como Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e membros da família Enterobacteriaceae^{(55, 61, 80)}. A Tabela 1 contém os dados dos primeiros exemplares de cada uma das variantes encontradas entre as cinco subclasses de MbLs adquiridas descritas até o momento.

Estes novos genes que codificam as MbLs foram encontrados inseridos em estruturas genéticas que fornecem mobilidade ao gene, fazendo com que essas enzimas passassem a ser conhecidas como MbLs móveis ou MbLs adquiridas. Atualmente são conhecidas cinco subclasses de MbL adquiridas: IMP (imipenemase)⁽⁴⁶⁾, VIM (Verona imipenemase)⁽³³⁾, SPM (São Paulo metalo-b-lactamase)⁽⁷²⁾, GIM (German imipenemase)⁽¹⁰⁾ e, mais recentemente, SIM-1, codificada pelo gene bla_SIM-1 detectado em sete A. baumannii isolados de um hospital terciário em Seul, Coréia⁽³⁵⁾.

O primeiro relato de MbL adquirida ocorreu em 1994⁽⁴⁶⁾, quando foi descrita uma nova subclasse denominada IMP-1. Essa enzima foi detectada em uma cepa clínica de Serratia marcescens isolada no Japão, a qual apresentava fenótipo de resistência a imipenem e cefalosporinas de espectro ampliado. Durante muitos anos a ocorrência de isolados produtores de IMP-1 foi restrita a esse país, entretanto, atualmente, a IMP-1 tem sido detectada em diferentes microrganismos, como Acinetobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae isolados de diferentes regiões geográficas^{(11, 20, 21, 28, 29, 43, 61, 69, 82)}.

As variantes pertencentes à subclasse IMP parecem ser mais prevalentes na Ásia, sendo comumente encontradas em bacilos Gram-negativos não-fermentadores (BGN-NF) (Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas spp. e Acinectobacter spp.). No entanto, já houve relatos da produção dessas enzimas por microrganismos pertencentes à família Enterobacteriaceae^{(32, 46, 80)}.

O primeiro relato de uma MbL no continente americano ocorreu em 2002 por Gibb et al.⁽²⁵⁾. Os autores descreveram a detecção de uma cepa de P. aeruginosa num hospital canadense que apresentava alto grau de resistência a ceftazidima e carbapenens. Análises posteriores revelaram a presença de uma nova enzima, denominada IMP-7.

Em 1999, a segunda subclasse de MbL adquirida descrita foi denominada VIM-1. A presença dessa enzima foi observada numa amostra de P. aeruginosa isolada em Verona, Itália⁽³³⁾. As enzimas pertencentes a essa subclasse apresentam menor número de variantes atualmente descritas, bem como distribuição concentrada em determinadas regiões geográficas, quando comparadas às pertencentes à subclasse IMP.

As variantes de VIM foram encontradas tanto em microrganismos fermentadores de glicose quanto naqueles não-fermentadores. Essas enzimas são mais prevalentes na Europa, região onde foi originariamente encontrada em 1999⁽³³⁾. Posteriormente houve diversos relatos dessas enzimas em microrganismos isolados em países da Comunidade Européia^{(4, 50, 52, 55, 58, 77)}. No entanto, variantes de VIM também foram relatadas na Ásia^{(79, 83)} e, mais recentemente, nos EUA⁽⁷¹⁾, no Chile e na Venezuela⁽⁴¹⁾.

A SPM-1, terceira subclasse de MbL adquirida, foi identificada em amostra de P. aeruginosa 48-1997 recuperada do trato urinário de um paciente hospitalizado no complexo Hospital São Paulo, da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Essa amostra bacteriana foi enviada ao programa SENTRY, que, em parceria com o laboratório Bristol Centre for Antimicrobial Research and Evaluation (BCARE), da Universidade de Bristol, Inglaterra, caracterizou esse novo determinante de resistência⁽⁷²⁾. O gene que codifica SPM-1 parece estar especificamente relacionado à espécie P. aeruginosa, uma vez que, até então, não foi detectado em demais microrganismos nosocomiais^{(23, 53)}. Posteriormente, a mesma parceria avaliou cinco cepas de P. aeruginosa provenientes de Dusseldorf, Alemanha, encontrando uma nova e quarta subclasse de MbL adquirida, denominada GIM-1⁽¹⁰⁾.

Epidemiologia das metalo-b-lactamases no Brasil

No Brasil, o primeiro relato da ocorrência de amostras produtoras de MbL adquirida ocorreu em 2002⁽⁵¹⁾. Entretanto, esse relato não caracterizou o determinante de resistência envolvido. Mais tarde, em 2003, uma variante de IMP foi relatada por Gales et al.⁽²⁴⁾. Esses autores descreveram o achado de uma cepa de A. baumannii isolada no complexo Hospital São Paulo/UNIFESP produtora de IMP-1. A análise do resultado de seqüenciamento dos 400-bp (pares de base) provenientes da reação da polimerase em cadeia (PCR) revelou tratar-se de um gene apresentando 100% de similaridade genética com a seqüência do gene bla_IMP-6 anteriormente publicada no GenBank sob o número S71932.

Em trabalho realizado na UNIFESP, investigou-se a presença de MbL adquirida em Acinetobacter spp. isolados de pacientes internados no Hospital São Paulo, no período entre maio de 1993 e novembro de 2001. Entre as amostras que apresentaram resistência ou sensibilidade reduzida aos carbapenens, 54,8% (40/73) eram produtoras de IMP-1, sendo que a emergência desse determinante de resistência foi detectada em amostras bacterianas isoladas a partir de 1998. Além disso, após este ano, a produção de MbL adquirida pareceu ser o mecanismo responsável pelo fenótipo de resistência aos carbapenens nas amostras avaliadas⁽⁶⁸⁾.

Mais recentemente, em estudo realizado em amostras bacterianas isoladas de pacientes internados no Hospital São Paulo durante os anos de 2002 e 2003, foi detectado o gene bla_IMP-1 em sete Acinetobacter spp. e uma P. aeruginosa⁽⁹⁾. Posteriormente, uma P. aeruginosa apresentando fenótipo de resistência a todos os betalactâmicos, inclusive imipenem e meropenem, foi isolada de um paciente internado no Hospital de Base de Brasília, em 2002. Estudos posteriores revelaram tratar-se da presença de uma nova variante de IMP, designada IMP-16⁽⁴³⁾.

Mais recentemente, uma amostra bacteriana de Klebsiella pneumoniae, isolada no Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (HU/USP), foi caracterizada como produtora de IMP-1⁽³⁶⁾. Este foi o primeiro relato de MbL adquirida em membros da família Enterobacteriaceae na América Latina. Entre 2003 e 2004 também foi evidenciada a primeira ocorrência de um surto hospitalar numa UTI causado por um clone de K. pneumoniae resistente a carbapenem e, mais tarde, testes moleculares confirmaram a presença do gene bla_IMP-1 nessas amostras⁽²⁶⁾. Além disso, uma amostra bacteriana de P. aeruginosa produtora de IMP-16 isolada de paciente internado no Hospital São Paulo e amostras bacterianas de A. baumannii produtoras de IMP-1 isoladas do Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo (HSPE) têm sido detectadas nos últimos anos (dados não publicados).

Como descrito anteriormente, SPM-1 foi detectada numa amostra bacteriana de P. aeruginosa isolada em 2001. Desde então, amostras produtoras dessa enzima têm sido isoladas em diversos centros no Brasil, como São Paulo, Brasília, Salvador, Fortaleza, Santo André, Londrina, Curitiba e Maringá⁽²³⁾, e, atualmente, a detecção de SPM-1 em hospitais brasileiros eventualmente tem sido observada em locais, como o Hospital São Paulo e o Hospital 9 de Julho, ambos localizados em São Paulo, e o Hospital Santa Catarina, em Blumenau (dados não publicados).

Contexto genético das MbL adquiridas

As MbL adquiridas são codificadas por cassetes gênicos localizados no cromossomo ou plasmídio bacteriano. No entanto, com exceção da enzima SPM-1, que é codificada por um gene localizado em plasmídio^{(72, 53)}, as demais MbL adquiridas são codificadas por genes localizados em integrons de classe 1^{(41, 43, 50, 69, 77)}.

Embora a grande maioria dos integrons encontrados em isolados clínicos pertença à classe 1, já foram descritas outras classes distintas de integrons (i.e., classes 2, 3 e 4). Membros dessas classes possuem suas respectivas integrases (intI1, intI2, intI3 e intI4), as quais compartilham similaridade entre 35% e 94%⁽¹⁷⁾. A classe 1 tem sido extensivamente estudada, e membros dela foram originalmente descritos como integrons. A classe 2 constitui-se de uma estrutura genética encontrada em transposon Tn7 e elementos relacionados, porém essa classe é composta por uma integrase defeituosa e incapaz de promover a mobilização de cassetes gênicos. A classe 3 é composta de um único exemplo até hoje descrito^{(5, 16)}.

Integrons de classe 1

Integrons de classe 1 são elementos genéticos constituídos de uma região conservada 5’ (5’-CS), formada por um gene intI1, uma região promotora e um sítio de recombinação (attI1) e uma região conservada 3’ (3’-CS) (Figura 1). Essa última região é geralmente composta do gene qacED1 conjugado ao gene sul1, sendo que esses genes codificam resistência a compostos de amônio quaternário e sulfonamidas, respectivamente^{(5, 13-15, 48, 60)}.

Na região upstream ao gene intI1, integrons apresentam uma região promotora, a qual é responsável pela expressão dos cassetes gênicos inseridos entre as regiões conservadas 5’ e 3’⁽⁴⁷⁾. Essa região é formada por um promotor denominado P_ant, constituído por duas seqüências de seis bases nas posições -35 e -10, respectivamente, sendo elas intercaladas por exatos 17-bp. Variações dessas seqüências já foram encontradas e podem ocasionar diferenças nas taxas de transcrição dos cassetes gênicos⁽⁶⁶⁾. Alguns integrons de classe 1 podem também apresentar um segundo promotor, localizado 119-bp downstream de P_ant⁽¹⁵⁾.

Assim como diferentes promotores apresentam distinções nas taxas de transcrição do gene, a posição onde o cassete gênico encontra-se inserido, entre as regiões conservadas 5’ e 3’, também influencia sua taxa de transcrição. Experimentos evidenciaram que a transcrição dá-se de forma mais eficiente à medida que o cassete gênico encontra-se mais próximo à região promotora. Sendo assim, genes localizados nas primeiras posições apresentam maiores taxas de transcrição⁽¹⁵⁾.

Entre as regiões conservadas 5’ e 3’ integrons podem apresentar quantidade variável de cassetes gênicos, que são inseridos e extraídos pela IntI1 codificada pelo intI1 (Figura 2). Cassetes gênicos usualmente codificam resistência a antimicrobianos e desinfetantes; no entanto é importante salientar que o maior número de genes de resistência encontrado provavelmente deve estar associado ao maior interesse em pesquisar amostras bacterianas resistentes aos antimicrobianos, uma vez que essa mobilização genética acontece de forma aleatória^{(5, 60)}.

Cassetes gênicos têm normalmente entre 500 e 1.000-bp e são constituídos por dois componentes funcionais: um gene, responsável pela codificação de alguma proteína, e um sítio de recombinação, conhecido como 59 elementos de base (59-be). Esses genes não possuem promotor, sendo, portanto, o evento de expressão gênica dependente do promotor presente no integron, no qual o cassete gênico se encontra inserido^{(13, 14)}.

A integrase, enzima codificada pelo intI1, é uma recombinase sítio-específico e possui como substrato preferencial dois sítios de ação, um na porção do 59-be, pertencente ao cassete gênico, e outro no receptor do cassete gênico ou attI1, localizado no integron^{(15, 48)}. Usualmente as reações de recombinação ocorrem entre attI1 (localizado no integron) e 59-be (localizado no cassete gênico), no entanto também foram demonstradas, em eventos experimentais, reações entre attI1 e attI1, 59-be e 59-be, mas com freqüência bastante reduzida (Figura 2)^{(13, 14)}.

Paralelamente à disseminação de genes de MbL, observou-se também a ocorrência da disseminação de outros determinantes de resistência, entre eles genes codificadores de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos em integrons de classe 1. Grande número dos genes de MbL que tiveram seu contexto genético pesquisado encontrava-se associado a um ou mais genes de resistência a aminoglicosídeos, explicando em parte os casos de multirresistência em P. aeruginosa^{(52, 62, 69, 70)}.

Enzimas modificadoras de aminoglicosídeos têm sido comumente descritas como provenientes de genes de resistência a aminoglicosídeos em P. aeruginosa desde as décadas de 1960 e 1970, no entanto esse cenário mantém-se em constante movimento, uma vez que genes, como aac(3’), aac(6’) e aadA1 são freqüentemente encontrados em integrons de classe 1 e uma variedade de novas enzimas continuam a ser caracterizadas^{(43, 52)}.

Detecção

Devido aos inúmeros encontros de amostras produtoras de MbL em diferentes regiões do mundo, houve a necessidade de se desenvolver testes simples, práticos e de baixo custo que propiciassem o rastreamento de amostras produtoras de MbLs pelo laboratório de rotina microbiológica. Uma vez que as MbLs necessitam de íons divalentes (i.e., Zn⁺²) como co-fator para a reação de hidrólise do anel betalactâmico, essas enzimas podem ser detectadas por meio de testes fenotípicos com o auxílio de um agente quelante, como EDTA, derivados de ésteres de tiol (ácidos mercaptoacético, mercaptocarboxílico, 2-mercaptopropiônico [MPA] e mercaptoetanol), p-clorometilbenzoato, metais pesados, como Hg (II), Fe (II), Fe (III) Cu (II), e ácido succínico.

Entre as metodologias fenotípicas desenvolvidas, o teste de disco-aproximação pode apresentar boas sensibilidade e especificidade, porém esses resultados podem variar de acordo com a espécie bacteriana testada, o substrato e o agente quelante utilizado. Em estudo realizado por Arakawa et al.⁽²⁾, o agente quelante MPA apresentou melhor sensibilidade (100%), quando comparado aos demais agente utilizados na detecção de amostras produtoras de MbLs utilizando-se ceftazidima como substrato.

Em estudo posterior realizado por Lee et al.⁽³⁴⁾, o ácido mercaptoacético apresentou melhor sensibilidade (100%) na detecção de amostras de Acinetobacter spp. produtoras de MbLs, porém esse mesmo quelante falhou em detectar 10,5% das amostras de Pseudomonas spp. testadas. Em contrapartida, o EDTA apresentou melhor detecção da produção de MbLs em amostras de P. aeruginosa (100%), mas falhou em detectar 6% das amostras de Acinetobacter spp.

De forma geral, a metodologia de disco-aproximação consiste da inoculação do espécime clínico em uma placa de Mueller Hinton ágar, tal qual as recomendações preconizadas pelo Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) (formalmente National Committee for Clinical Laboratory Standards [NCCLS]) para a realização de antibiograma⁽⁴⁵⁾. Em seguida, discos contendo substratos, como ceftazidima (30µg) e imipenem (10µg), são posicionados na placa, ao lado de um disco estéril de papel de filtro adicionado de uma solução de agente quelante, conforme representação esquemática demonstrada na Figura 3. Em amostras produtoras de MbL observam-se uma distorção e a ampliação do halo de inibição de crescimento da bactéria teste na região do ágar onde houve a difusão do agente quelante (Figura 4). Já em testes negativos não se observa a alteração no halo de inibição de crescimento da bactéria teste (Figura 5).

Com base no mesmo princípio da difusão em ágar, desenvolveu-se uma fita de Etest^®, a qual é incorporada de imipenem em uma das extremidades e imipenem associado ao EDTA na outra. Essa metodologia é bastante simples e apresenta praticidade, podendo também ser utilizada para rastreamento de amostras produtoras de MbL, porém apresenta custo mais elevado⁽⁷⁴⁾. Para essa metodologia considera-se amostra produtora de MbL aquela que apresentar uma concentração inibitória mínima (CIM) de imipenem associado ao EDTA três diluições menor ou inferior àquela demonstrada pela amostra frente ao imipenem (Figura 6).

Essas metodologias demonstram facilidade em detectar amostras produtoras de MbL que apresentam fenótipo de resistência ao imipenem, pois a diferença observada entre o halo de inibição de crescimento bacteriano com o agente quelante e sem a presença desse é bastante visível. Entretanto, a expressão fenotípica de MbL em membros da família Enterobacteriacea geralmente não ocasiona o mesmo fenótipo de resistência ao imipenem demonstrado por BGN-NF, o que pode dificultar a detecção⁽⁸¹⁾.

Até o presente momento, o CLSI não sugere nenhum teste para detecção de amostras produtoras de MbL, uma vez que esse mecanismos de resistência não é prevalente nos EUA⁽¹²⁾. No entanto, recentemente foi constatado que 41,3% das amostras de P. aeruginosa (85/206) resistentes a carbapenens isoladas de distintos hospitais brasileiros eram produtoras de MbL, evidenciando uma realidade diferente daquela encontrada nos EUA e enfatizando a necessidade da realização de testes de detecção para esse fenótipo de resistência em nossos laboratórios de microbiologia.

Já o controle de qualidade do teste fenotípico de detecção da produção de MbL pode utilizar a cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 como controle negativo. Uma cepa sabidamente produtora de MbL, tal qual a cepa P. putida 48-12346, pode vir a ser utilizada como controle positivo. Essa última cepa foi isolada de hemocultura de paciente internado no Hospital São Paulo e demonstrou resistência a todos os betalactâmicos testados, aminoglicosídeos e fluoroquinolonas, sendo sensível somente à polimixina. Estudos moleculares posteriores evidenciaram a presença de um integron de classe 1, o qual continha três cassetes gênicos. O gene bla_IMP-1 foi encontrado na primeira posição, seguido de dois genes que conferem resistência a aminoglicosídeos (aadA31 e aadA1). Esta cepa encontra-se à disposição daqueles interessados no Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC) ou Laboratório ALERTA⁽⁴²⁾.

Vale a pena ressaltar que o teste fenotípico para detecção de amostras produtoras de MbL somente deve ser realizado quando houver objetivos bem estabelecidos, visto que o conhecimento do mecanismo responsável pelo fenótipo de resistência a carbapenens, por si só, não fornece benefício adicional à terapêutica antimicrobiana. Na presença de Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e membros da família Enterobacteriaceae não-sensíveis a carbapenens, testes fenotípicos para detecção de MbL seriam importantes para se ter conhecimento da prevalência de amostras produtoras de MbL entre as amostras não-sensíveis a carbapenens e, uma vez que esses microrganismos sejam detectados, pode auxiliar os membros da CCIH para que medidas de controle de infecção possam ser implantadas com o intuito de prevenir a disseminação desses determinantes de resistência, visto que eles estão contidos em estruturas genéticas que propiciam sua mobilidade de forma muito efetiva.

Conclusões

O encontro de diferentes enzimas em diferentes espécies bacterianas evidencia a real capacidade de disseminação desses elementos genéticos e causa grande preocupação, uma vez que esses eventos de disseminação podem alcançar maiores proporções. Isso acarretaria importante impacto clínico e as opções terapêuticas para os casos de infecção nosocomial por BGN-NF e membros da família Enterobacteriaceae poderiam se tornar limitadas.

Adicionalmente, como a troca de informações genéticas entre microrganismos nunca deixará de ocorrer, medidas de racionalização do uso de agentes antimicrobianos de espectro ampliado também devem ser implantadas com o intuito de minimizar a seleção de subpopulações bacterianas resistentes a carbapenens devido à produção de MbL⁽⁴⁰⁾. Uma vez selecionadas essas subpopulações, metodologias fenotípicas podem ser utilizadas para detecção desses microrganismos para que então, posteriormente, auxiliem as condutas de controle de infecção e, assim, possam prevenir a disseminação desses determinantes de resistência^{(38, 73)}.

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Primeira submissão em 31/03/05

Última submissão em 29/07/05

Aceito para publicação em 03/04/05

Publicado em 20/04/06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Jul 2006
• Data do Fascículo
  Abr 2006

Histórico

• Aceito
  20 Abr 2006
• Revisado
  29 Jul 2005
• Recebido
  01 Mar 2005