Validação de método analítico para análise de amitraz em mel utilizando GC/TSD

Validation of the analytical method for analysis of the amitraz in honey using GC-TSD

ARTIGO

F.S. Silva; M.R.R. Marchi

Departamento de Química Analítica, Instituto de Química, UNESP - Univ. Estadual Paulista - 14800-900, Araraquara(SP), Brasil

RESUMO

Este artigo descreve a validação de método analítico para determinação do acaricida amitraz em mel utilizando extração com n-hexano/acetona, cleanup em cartucho de extração em fase sólida (SPE) e análise por cromatografia a gás com detector termoiônico seletivo (GC-TSD). O método pode ser utilizado para monitorar a presença do pesticida amitraz em mel, devido aos bons parâmetros analíticos, precisão (CV<11%) e exatidão (>80%) dentro do intervalo 100-400 ng g^-1. O limite estabelecido na União Européia, pelo Committee for Veterinary Medicinal Products, para amitraz em mel (200 ng g^-1) está dentro deste intervalo. A resposta do sistema analítico apresentou linearidade entre 100 e 800 ng mL^-1 com coeficiente de correlação de 0,9996, limite de detecção (LD-7 ng g^-1) e de quantificação (LQ-100 ng g^-1). O método validado foi utilizado para avaliar a qualidade de méis comercializados na cidade de Araraquara/SP, nas quais não foram detectados resíduos de amitraz.

Palavras-chave: Amitraz, validação analítica, mel, GC-TSD.

ABSTRACT

This paper describes the validation of method for analysis of the acaricide amitraz in honey using n-hexane/acetone extraction, cleanup in cartridge of solid phase extraction (SPE) and analysis by gas chromatography with nitrogen-phosphorus detector (GC -TSD). The method can be used to monitor the presence of the pesticide amitraz in honey because of its good analytical parameters, precision (CV <11%) and accuracy (> 80%) in the range of 100-400 ng g^-1. The limit set in the European Union, by Committee for Veterinary Medicinal Products, for amitraz in honey (200 ng g^-1) is within this range. The response of the analytical system was linear between 100 and 800 ng mL^-1 with correlation coefficient of 0.9996, limit of detection (LD -7 ng g^-1) and quantification (LQ -100 ng g^-1). The sample was fortified at three concentrations 100 ng g^-1, 200 ng g^-1 and 400 ng g^-1, giving an average recovery of 80, 88 and 92% respectively. The validated method was used to assess the quality of honey sold in the city of Araraquara/SP, in which there were no residues of amitraz.

Keywords: Amitraz, validation method, honey, GC-TSD

Introdução

O mel, obtido a partir do néctar das flores, é uma mistura de substâncias a qual o torna viscoso, aromático e açucarado [1]. Devido ao seu sabor característico, aroma agradável, valor nutritivo, propriedades medicinais e sensoriais têm atraído milhares de consumidores [1]. Segundo os dados da Confederação Brasileira de Apicultura (CBA), a produção de mel em 2008 no Brasil foi de aproximadamente 18 mil toneladas, gerando um faturamento de R$80,1 milhões. [2]. Esta produção pode ser afetada por ácaros que causam seriíssimos danos econômicos para a apicultura de muitos países e que representa atualmente alta preocupação dos produtores ao redor do mundo [3].

Uma das pragas que afetam as colméias é o ácaro Varroajacobsoni, também denominado Varroa destructor [3]. Foi detectado no Brasil desde 1978, e atualmente pode ser encontrado em praticamente em todo o país [4]. Trata-se de um ácaro de coloração marrom, que infesta tanto crias como abelhas adultas, ficando aderidos principalmente na região torácica, sugando a hemolinfa das abelhas, podendo causar redução do peso, longevidade e deformações nas asas e patas da abelha [3]. O controle de ácaros como este se faz através da pulverização do acaricida amitraz (Figura 1) [5], conhecido comercialmente como Apivar e Mitac.

O Comitê para Produtos Medicinais Veterinários na Europa (Committee for Veterinary Medicinal Products) recomenda como limite máximo de resíduo (LMR) de amitraz em mel, a quantidade de 200 ng g^-1 [6]. No Brasil, este pesticida é proibido pela Lei Federal de Agrotóxicos [7], número 7802, aprovada em 1989, que proíbe o registro de produtos que possam provocar câncer (carcinogênese), defeitos na criança em gestação (teratogênese) e nas células (mutagênese). Porém este pesticida continua sendo comercializado ilegalmente [7].

Diante deste mercado tão ativo e da problemática educacional com o uso adequado de acaricidas, impõe-se a necessidade do controle de qualidade e monitoramento de méis, para que a população e o ambiente não se tornem vítimas desta substância.

Este contaminante tem sido determinado por muitas técnicas cromatográficas, seja por cromatografia líquida [8] ou cromatografia a gás [9]. Pela técnica de HPLC são utilizados os detectores de ultravioleta (UV) [10], arranjo de diodos (DAD) [11] ou espectrometria de massas (MS) [12] para a determinação de amitraz. Dos detectores para cromatografia a gás, o mais utilizado devido a sua seletividade e baixos limites de detecção é o detector termoiônico seletivo (TSD). Este detector é seletivo para compostos orgânicos contendo N e P na estrutura química. A cromatografia a gás com detecção de espectrometria de massas (GC/MS) também tem sido reportada [13,14], utilizando-se o modo de monitoramento seletivo de íons (SIM) para alcançar menores limites de detecção (6 ng g^-1) [15,16].

Neste trabalho buscou-se otimizar e validar um método que permitisse a análise de amitraz em mel e que ao mesmo tempo fosse simples (poucas etapas), de baixo custo e apresentasse seletividade, precisão e exatidão adequadas. Os parâmetros envolvidos na validação foram: seletividade, intervalo de trabalho, linearidade, sensibilidade, precisão, exatidão, limites de detecção (LD) e quantificação (LQ). Após a validação analítica, méis comercializados na cidade de Araraquara (SP) foram analisados.

Materiais e método

O padrão de amitraz utilizado foi obtido da Sigma-Aldrich (Riedel-de-Haën, Alemanha) com 99,4% de pureza. Os solventes foram: n-hexano, acetona e acetato de etila grau P.A. (JT Baker , Xalostoc, México); cartuchos SPE (C-18, 500 mg) da marca J.T.Baker (Bakerbond, USA). Os equipamentos utilizados foram: cromatógrafo a gás Varian (Walnut Creek, CA, USA), modelo 3800, acoplado a workstation Star Chromatographic, injetor split/splitless, coluna capilar Supelco (30mx0,25mmx0,25µm) SPB-5 (5% fenil/95% dimetilpolisiloxano), com detector termoiônico seletivo (TSD), banho termostatizado (Tecnal TE-210); banho de ultrassom (Thornton-T50220 , 40 KHz), balança analítica (Mettler Toledo AG 245), agitador de tubos (Phoenix Model AP56) e centrífuga (Excelsa Baby I^®206).

O método aqui otimizado e validado foi adaptado da proposta de Jimenez e colaboradores [17], que consistiu em aquecimento de 2 g de mel a temperatura 35µC, extração com 3 x 15 mL de hexano:aceton (80:20, v/v) durante 10 minutos em agitador de tubos com rotação de 700 rpm. A fase orgânica foi coletada e o extrato foi concentrado até 5 mL sob fluxo brando de nitrogênio. Realizou-se a eliminação dos interferentes do extrato em cartucho de SPE (C-18), eluição com 5 mL de hexano:acetona 80:20 (v/v), secagem com fluxo brando de N2, solubilização em 1 mL de hexano:acetona 80:20, e análise por GC-TSD.

Condições cromatográficas

As condições cromatográficas do GC-TSD foram: modo de injeção: split/splitless (5:1); Injetor: 250°C; Detector: 300° C e corrente da pérola de 3,0 A. A temperatura inicial da coluna (70°C) foi mantida por 1 min, a seguir utilizou-se taxa de aquecimento de 20°C/min até 220°C, sendo a temperatura mantida neste valor por 7 min. Uma nova rampa de aquecimento (10°C/min) foi utilizada para atingir 280°C, mantendo-se esta última temperatura por 5 min. Hidrogênio foi utilizado como gás de arraste a uma vazão de 1 mL min^-1. A vazão dos gases da chama, hidrogênio e ar sintético, foram 4 ml min^-1 e 80 mL min^-1, respectivamente, enquanto que o gás auxiliar (make-up) (N2) foi utilizado a 30 mL min^-1. O volume de injeção foi 1 µL.

Amostras fortificadas

Para todas as etapas do estudo de otimização e validação do método foram utilizadas amostras fortificadas, pois não há material de referencia certificado que seja constituído por mel contendo amitraz. Para obtenção das amostras fortificadas utilizou-se mel adquirido no comercio varejista de Araraquara, ao qual foram adicionadas concentrações adequadas de amitraz, através de soluções padrão, após a homogeneização por cerca de 2 min em agitador de tubos (700 rpm) as amostras foram deixadas em repouso por 24 horas em frasco de vidro âmbar, fechado e sob refrigeração. Depois deste período as amostras fortificadas foram submetidas à análise.

Resultados e discussão

Otimização da resposta do sistema cromatográfico

Utilizando-se as condições cromatográficas reportadas na literatura [17] e uma solução padrão de amitraz de 1 µg mL^-1 não foi possível obter nenhuma resposta no sistema GC/TSD. Desta maneira, foram otimizados os parâmetros: modo de injeção, proporção entre os gases da chama e corrente da pérola. As Figuras 2, 3 e 4 apresentam cromatogramas que ilustram o ganho de resposta obtido com a otimização efetuada.

Apesar da melhor resposta analítica na Figura 4.a (3,5 A), não foi utilizada esta condição devido ao menor tempo de vida da pérola, portanto utilizou-se a corrente de 3,0 A.

Intervalo GC/TSD de linearidade da resposta do sistema

Foram injetadas, em triplicata, soluções padrão de amitraz em hexano:acetona (80:20, v/v), no intervalo de 100 a 800 ng mL^-1, perfazendo um total de 8 concentrações. Para avaliação da região linear, foi utilizado o teste de Huber para excluir pontos anômalos [18], como mostra a Figura 5. Os pontos que estavam incluidos na região linear foram utilizados para a construção da curva analítica, apresentada na mesma Figura. Os parâmetros obtidos para esta curva denotam a ótima correlação linear (r² = 0,996) e a sensibilidade da resposta, dada pelo coeficiente angular da curva de 5,40. Utilizando os parâmetros da curva é possível determinar o limite de detecção e de quantificação do sistema GC/TSD para amitraz [19], que foram 16 e 48 ng mL^-1, respectivamente.

Seletividade do método

Na Figura 6, são comparados os cromatogramas da amostra fortificada com amitraz e da amostra testemunha (amostra isenta de contaminação pelo analito). Observa-se que não ocorrem interferentes da amostra testemunha no tempo de retenção do amitraz (18,3 min). Não pôde ser efetuada a análise em menor tempo devido à observação de compostos presentes na matriz no intervalo de 6 a 13,5 min.

É importante notar que a seletividade desempenha importante função na validação analítica, pois se esta não for assegurada, a linearidade, a precisão e a exatidão estarão seriamente comprometidas [19].

Exatidão e precisão

A exatidão do método foi estimada pelo fator de recuperação, R, que é definido como a quantidade do analito adicionado à amostra, que é extraída e quantificada [14]. A recuperação é calculada da seguinte maneira:

onde, C₁ = Concentração determinada na matriz fortificada; C₂=Concentração determinada na matriz isenta de fortificação; C₃= Concentração adicionada à matriz fortificada.

A exatidão foi determinada utilizando 9 determinações, sendo estas com 3 níveis de concentração em triplicata [20]. Os resultados estão apresentados na Tabela 2.

A amostra foi fortificada no início (100 ng g^-1), meio (200 ng g^-1) e fim (400 ng g^-1) da curva de calibração, obtendo recuperações médias de 80, 88 e 92%, respectivamente.

Os resultados se encontram dentro do intervalo de 70 a 120%, e isto mostra que o método é exato, conforme preconizado pela literatura para a análise de resíduos de pesticidas [20]. A precisão do método foi estimada pela dispersão dos resultados expressa pelo coeficiente de variação e mostra que o método é preciso, pois os valores encontrados foram menor que 20% [20].

Teste t para avaliação da recuperação

Uma outra maneira de avaliar a extatidão do método é a utilização do teste t de Student [21]. Para isto foram utilizadas as médias dos três níveis de fortificação aplicando o teste de hipótese. Estabeleceu-se como hipótese nula (H₀): µ = 100% de recuperação e como segunda hipótese (Hl) µ ≠ 100% de recuperação. O valor de t experimental foi calculado de acordo com a seguinte equação [22]:

onde: X rec é a média de recuperação do método, µ é o valor esperado para a recuperação (100%), n é o tamanho da amostra, igual a 3, e Srec o desvio padrão das médias de recuperação de cada nível fortificado (Tabela 3).

O valor de t tabelado (t_tab) com 95% de confiança e n-1 graus de liberdade é 4,3, valor maior que o calculado (t_cal = 3,7), portanto aceita-se a hipótese nula (H₀), ou seja, não há diferença significativa entre o valor quantificado e o valor adicionado na amostra. Portanto o método tem exatidão para avaliação de amitraz em amostras de mel.

Limite de Detecção e Quantificação

Segundo Thier (23), nenhum sinal deveria ser obtido para a amostra controle. Entretanto, sinais de "resíduos aparentes" podem ocorrer e são chamados sinais do branco. Eles podem ser devido a algumas causas que podem simular a presença dos resíduos como: co-extrativos não removidos, impurezas de solventes ou reagentes ou ruídos do instrumento.

O LD pode ser estimado a partir dos resultados de um estudo de recuperação, utilizando as equações apresentadas abaixo:

sendo:

σ_A -desvio padrão estimado a partir do estudo de recuperação com o menor nível de fortificação.

σ_B -desvio padrão obtido com a aplicação do método à amostra controle.

m -número de repetições da aplicação do método à amostra com menor nível de fortificação.

n -número de repetições da aplicação do método à amostra controle.

f -número de graus de liberdade, estimado por m+n - 2.

S -sensibilidade do sistema analítico.

O limite de detecção do método foi de 7 ng g^-1 enquanto o limite de quantificação foi de 100 ng g^-1. O limite de quantificação foi adequado, pois foi inferior ao limite máximo de resíduos (LMR) estabelecido pela União Européia (200 ng g^-1), o que possibilita a aplicação deste método na averiguação do nível de contaminação neste tipo de alimento.

O método aqui validado apresentou semelhança com outros trabalhos na literatura [15, 24] quanto aos parâmetros de exatidão (recuperação > 70%) e precisão (<11%). Entretanto, a comparação dos limites de detecção e quantificação do método, com o que é apresentado na literatura, não é possível, uma vez que os artigos não explicitam se os limites apresentados referem-se ao sistema analítico (limite instrumental) ou ao método, conforme a Tabela 4.

Análise de amostras de mel comercializadas em Araraquara.

O método proposto e validado, foi utilizado para avaliar a ocorrência de amitraz em amostras de méis obtidas do comércio varejista e diretamente com coletores de mel silvestre na cidade de Araraquara-SP.

As análises para a determinação de amitraz foram realizadas em triplicata, não sendo detectados resíduos de amitraz nos méis obtidos, dentro dos limites estabelecidos (< 100 ng g^-1), conforme os cromatogramas da Figura 7.

Há muitos métodos para a determinação de amitraz em mel na literatura [12,24,11,25] porém são poucos os trabalhos que apresentam aplicações em amostras disponíveis para a população através do comercio local. O único trabalho encontrado na literatura e que analisou mel comercializado para a população foi o efetuado por Rial-Otero et al. [15] , no qual foram avaliados 11 méis em provenientes de diferentes localidades em Portugal [15] e que também não observaram resíduos de amitraz em nenhuma amostra.

Conclusão

Estabeleceu-se um método seletivo, sensível, preciso e exato, para análise de amitraz em mel de abelhas. Este método é semelhante aos descritos na literatura, tendo como vantagem de ser simples e rápido. Cabe salientar que este trabalho apresenta dados de limites de detecção e quantificação para o método proposto, o que não ocorre com nenhum trabalho existente na literatura sobre este mesmo tema.

O valor do limite de quantificação para determinação de amitraz em mel (100 ng g^-1) foi menor do que o limite máximo de resíduos (LMR) estabelecido pela União Européia (200 ng g^-1). O método foi aplicado na análise de mel comercializado na cidade de Araraquara-SP, demonstrando que estas estavam isentas de resíduos de amitraz.

Considerando que a legislação brasileira não avalia a qualidade do mel quanto à presença de amitraz e compostos orgânicos tóxicos, o método validado pode ser utilizado em estudos de monitoramento para avaliar a qualidade de mel quanto à presença deste contaminante.

Agradecimentos

Agradecimentos a FAPESP processo (200403/13906-6) pelo suporte financeiro.

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Validação de método analítico para análise de amitraz em mel utilizando GC/TSD

Validation of the analytical method for analysis of the amitraz in honey using GC-TSD

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Ago 2011
• Data do Fascículo
  2010