Comparação das técnicas de ELISA indireto e de soroneutralização na detecção de anticorpos contra o BHV-1 em amostras de soro bubalino (Bubalus bubalis)

Comparison of a commercial enzyme immune assay (ELISA) and serum neutralization techniques for the detection of antibodies against BHV-1 in buffaloes (Bubalus bubalis) sera

NOTA PRÉVIA

Comparação das técnicas de ELISA indireto e de soroneutralização na detecção de anticorpos contra o BHV-1 em amostras de soro bubalino (Bubalus bubalis)

Comparison of a commercial enzyme immune assay (ELISA) and serum neutralization techniques for the detection of antibodies against BHV-1 in buffaloes (Bubalus bubalis) sera

Adriana CORTEZ¹; Marcos Bryan HEINEMANN¹; Amauri Alcindo ALFIERI²; Kerly Cristina MÉDICI²; Alice Fernandes ALFIERI²; Daniela Bergamin OLIVEIRA²; Adriana Dresden MEYER³; Rodrigo Martins SOARES¹; Sidnei Mioshi SAKAMOTO²; Renato AMARAL⁴; Pietro Sampaio BARUSELLI²; Takako FUJII⁵; Leonardo José RICHTZENHAIN¹

CORRESPONDÊNCIA PARA:

Leonardo José Richtzenhaim

Departamento de Medicina

Veterinária Preventiva e Saúde

Animal da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da USP

Av. Prof. Dr. Orlando Marques de

Paiva, 87

Cidade Universitária Armando

de Salles Oliveira

05508-000 ¾ São Paulo ¾ SP

e-mail: [e-mail]

RESUMO

O desempenho de um ELISA comercial (Bovine Rhinotracheitis virus antibody test Kit, Herdcheck®, IDEXX Laboratories Inc., USA) para a identificação de anticorpos anti-herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1), em soro bovino, foi avaliado em 133 amostras de soro de búfalos (Bubalus bubalis), sem histórico de vacinação para IBR, da Região do Vale do Ribeira, Estado de São Paulo. Tomando-se a técnica de soroneutralização como referência, o ELISA indireto apresentou sensibilidade e especificidade relativa de 97,14 e 46,03%, respectivamente. A concordância estimada pelo índice kappa, entre os dois métodos, foi de 0,44 IC (0,29-0,59), utilizando um intervalo de confiança de 95%.

UNITERMOS: Rinotraquite infecciosa bovina; ELISA; Búfalos, Bubalus bubalis.

Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR), causada pelo herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1), tem acarretado grandes prejuízos econômicos nos rebanhos bovinos, principalmente em decorrência de infecções respiratórias e de alterações reprodutivas^1,2.

Devido a sua grande especificidade e sensibilidade, a técnica de soroneutralização tem sido utilizada como referência no sorodiagnóstico do BHV-1; entretanto, esta prova possui uma série de desvantagens relacionadas ao uso do cultivo celular, como, por exemplo, a infra-estrutura e o pessoal especializado necessário a sua realização, o tempo gasto para o seu processamento e a existência de amostras de soro tóxicas que impossibilitam a interpretação dos resultados³.

O teste de ELISA indireto tem sido aplicado na detecção de anticorpos contra o BHV-1 em bovinos, pois, além de apresentar uma elevada concordância (kappa = 0,94) com a soroneutralização, é uma prova rápida, de fácil execução e que pode ser automatizada, simplificando os inquéritos epidemiológicos^4,5.

Em búfalos, a literatura tem mencionado o uso do ELISA indireto empregando conjugado dirigido para a IgG bovina^6,7 na pesquisa de anticorpos contra o BHV-1, porém, nestes trabalhos não foi verificada a concordância entre as provas de ELISA indireto e a soroneutralização.

Molnár et al.⁸ testaram um ELISA indireto comercial na detecção de anticorpos anti-BHV-1 concebido, originalmente, para bovinos (Svanovir®, IBR EIA Kit, Uppsala, Suécia) nos soros de bubalinos. Estes autores avaliaram 10 amostras de soro de búfalos para as provas de soroneutralização e para o ELISA indireto e obtiveram uma concordância de 100% entre as duas provas.

O objetivo do presente trabalho foi analisar o desempenho de um kit comercial de ELISA (Rhinotracheitis virus antibody test kit, HerdCheck®, IDEXX Laboratories Inc., USA), desenvolvido para detectar anticorpos bovinos contra o BHV-1, na detecção de anticorpos contra o mesmo vírus em amostras de soros de búfalos (Bubalus bubalis). O teste ELISA para a detecção de anticorpos contra BHV-1 em búfalos foi executado e interpretado conforme recomendado pelo fabricante.

Para tanto, foram utilizadas 133 amostras de soros de búfalos fêmeas da raça Murrah e suas cruzas, em idade de reprodução (3 a 16 anos), não vacinadas contra IBR, pertencentes a 11 rebanhos da região do Vale do Ribeira, SP.

A microtécnica de soroneutralização foi realizada com células MDBK (Madin Darby Bovine Kidney) empregando 100 TCID 50% do protótipo viral Los Angeles do BHV-1. A incubação do vírus/soro foi completada em 1 hora a 37ºC, em atmosfera de 5% de CO2, segundo a metodologia descrita por Britsch⁹. A leitura final foi efetuada em 72 horas. O ponto final da reação foi determinado pela maior diluição do soro capaz de inibir 100% do efeito citopático induzido pelo BHV-1 nas células MDBK. O animal foi considerado positivo quando o título do soro foi maior ou igual a 8.

A concordância entre as duas técnicas foi calculada através do índice kappa¹⁰.

Na Tab. 1, estão expostos os resultados do sorodiagnóstico de IBR obtidos pelas técnicas de soroneutralização e ELISA indireto nas amostras de soro de búfalo.

Tomando-se a soroneutralização como referência, o ELISA indireto apresentou sensibilidade relativa de 97,14% (68/70 x 100) e especificidade relativa de 46,06% (29/63 x 100). A baixa especificidade do ELISA em relação à soroneutralização poderia ser atribuída ao fato de que esta última detecta apenas anticorpos relacionados ao fenômeno de neutralização. Em contrapartida, a técnica de ELISA indireto detecta qualquer anticorpo direcionado contra proteínas estruturais e não-estruturais do BHV-1. A capacidade de o ELISA indireto gerar sinal a partir de quantidades muito pequenas de anticorpos também poderia explicar a sua aparente perda de especificidade em relação à soroneutralização. Outras causas da perda de especificidade poderiam estar associadas a eventual ocorrência de interações não-imunológicas (ruídos decorrentes da adsorção de IgG de búfalo ou de conjugado anti-IgG bovina a microplaca) ou de reações cruzadas com anticorpos produzidos após a infecção dos búfalos com outro vírus antigenicamente relacionado ao BHV-1.

O índice kappa encontrado, com um intervalo de confiança de 95%, entre as provas de ELISA indireto e a soroneutralização foi de 0,44, o que indica um grau regular de concordância entre as duas técnicas¹¹, apesar de Krakker e Goel¹² terem demonstrado que as subclasses de IgG (1 e 2) de búfalo (Bubalus bubalis) e de bovino compartilham propriedades físico-químicas e biológicas, além de serem relacionadas antigenicamente.

Estes resultados diferem fortemente dos obtidos por Médici⁵, que acharam um kappa de 0,94 quando o mesmo sistema de ELISA indireto (HerdCheck®) foi comparado com a soroneutralização na pesquisa de anticorpos contra o BHV-1 em bovinos.

Ao pesquisar anticorpos anti-BHV-1 em búfalos, empregando um kit de ELISA indireto para detecção de anticorpos em bovinos, Molnár et al.⁸ encontraram uma concordância de 100% entre os testes de ELISA e soroneutralização. A patente divergência desses resultados em relação àqueles obtidos no presente trabalho poderia ser justificada pelo fato de que estes autores testaram somente 10 amostras de soro e por terem utilizado um kit comercial diferente.

Os dados obtidos com 133 soros bubalinos indicam que o Kit HerdCheck®, IDEXX Laboratories Inc., USA, originalmente desenvolvido para bovinos, não deve ser aplicado para a pesquisa de anticorpos contra o BHV-1 em búfalos.

SUMMARY

The performance of a commercial ELISA (Bovine Rhinotracheitis virus antibody test Kit, Herdcheck®, IDEXX Laboratories Inc., USA) designed to detect the presence of antibody to the Bovine Herpesvirus type 1 (BHV-1) in bovine serum, was evaluated in samples of buffaloes (Bubalus bubalis) serum. Sera of 133 buffaloes without IBR vaccination were performed both by ELISA and standard serum neutralization technique. Sensitivity and specificity of ELISA were 97.14% and 46.03%, respectively. The estimated concordance between two serologic diagnostic methods by kappa index was 0.44 IC (0.29-0.59) using 95% confidence level.

UNITERMS: Infections bovine rhinotracheites; ELISA; Buffaloes, Bubalus bubalis.

Recebido para publicação: 13/03/2001

Aprovado para publicação: 16/08/2001

• ¹
  - MILLER, J. M. The effects of IBR virus infection on reproductive function of cattle. Veterinary Medicine, v. 86, n. 1, p. 95-98, 1991.
• ²
  - HEDGER, R. S.; HAMBLIN, C. Neutralizing antibodies to bovid herpesvirus 1 (Infectious bovine rhinotracheitis/Infectious pustular vulvo-vaginitis) in african wildlife with special reference to the cape buffalo (Syncerus caffer). Journal Comparative Pathology, v. 88, n. 2, p. 211-218, 1978.
• ³
  - WITTMANN, G. Herpesvirus diseases of cattle, horses, and pigs Boston: Kluwer Academic, 1989. 345 p.
• ⁴
  - PERRIM, B.; PERRIM, M.; MOUSSA, A. Evaluation of a commercial gE blocking ELISA test for a detection of antibodies to infectious bovine rhinotracheitis virus. Veterinary Record, v. 25, n. 138, p. 520, 1996.
• ⁵
  - MÉDICI, K. C.; ALFIERI, A. A.; ALFIERI, A. F. Ensaio Imunoenzimático comercial no diagnóstico sorológico das infecções por herpesvírus bovino 1. Ciência Rural, v. 30, n. 2, p. 343-346, 2000.
• ⁶
  - RENUKARADHYA, G. J.; RAJASEKHAR, M.; RAGHAVAN, R. Seroprevalence of infectious bovine rhinotracheitis in southern India. Revue Scientific et Technologic, v. 15, n. 3, p. 1021-1028, 1996.
• ⁷
  - SURESH, K. B.; SUDHARSHANA, K. J.; RAJASEKHAR, M. Seroprevalence of infectious bovine rhinotracheitis in India. Indian Veterinary Journal, v. 76, n. 1, p. 5-9, 1999.
• ⁸
  - MOLNÁR, E.; SERRA, M. T. A.; GUEDES, V. T. M.; MOLNÁR, L. Prevalência da infecção pelo vírus da rinotraqueíte bovina (IBR) em bubalinos criados no Estado do Pará. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 20., 1999, Salvador. Anais... Salvador: Colégio Brasileiro de Microbiologia. 1999. p. 145.
• ⁹
  - BITSCH, V. The modification of the infectious bovine rhinotracheitis virus serum neutralization test. Acta Veterinaria Scandinava, v. 19, n. 4, p. 497-505, 1978.
• ¹⁰
  - GART, J. J.; BUCK, A. A. Comparison of a screning test and a reference test in a epidemiology studies. American Journal of Epidemiology, v. 83, p. 593-602, 1966.
• ¹¹
  - PEREIRA, M. G. Epidemiologia teórica e prática Rio de Janeiro : Guanabara Koogan, 1995. 583 p.
• ¹²
  - KRAKKER, N. K.; GOEL, M. C. Purification and characterization of IgG1 and IgG2 from buffalo (Bubalus bubalis) serum and colostrum. Veterinary Immunology and Immunopathology, v. 37, n. 1, p. 61-71, 1993.

¹

Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP ¾ SP

²

Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Universidade Estadual de Londrina (UEL) - PR

³

ICB, USP - SP

⁴

Médico Veterinário Autônomo

⁵

Instituto Biológico São Paulo - SP

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Jun 2002
• Data do Fascículo
  2001

Histórico

• Aceito
  16 Ago 2001
• Recebido
  13 Mar 2001