SISTEMA API CAMPY PARA CARACTERIZAÇÃO DE AMOSTRAS DE CAMPYLOBACTER ISOLADAS DE DESCARGA CECAL, FEZES, SWABS CLOACAIS E CARCAÇAS DE FRANGOS DE CORTE

CHARACTERIZATION OF CAMPYLOBACTER STRAINS IN CECAL DROPPINGS, FECES, CLOACAL SWABS AND CARCASSES OF BROILER FLOCKS

RESUMO

O presente estudo verificou a aplicação do sistema API Campy para identificação de bactérias do gênero Campylobacter. Foram utilizadas 48 amostras, sendo 15 oriundas de descarga cecal, cinco de fezes, três de swabs cloacais e 21 de carcaças, isoladas de 22 lotes de frangos de corte com três semanas de idade. As amostras caracterizadas presuntivamente por microscopia em contraste de fase, coloração de Gram, catalase/oxidase e aglutinação em látex foram inoculadas no sistema API Campy, que consta de testes enzimáticos e convencionais em aerobiose e testes de assimilação ou inibição em microaerofilia, ambos incubados a 37º C por 24-48 horas, sendo a leitura realizada em sistema informatizado. Foi possível identificar 43 amostras (89,58%), enquanto cinco (10,41%) tiveram perfil inaceitável. Identificou-se as espécies C. jejuni subsp. jejuni (68,8%); C. coli (8,3%); C. jejuni subsp. doylei (6,3%); C. upsaliensis (4,2%) e C. fetus subsp. fetus (2,1%). A ocorrência de Campylobacter nos lotes de frango de corte estudados foi de 81,8% e as espécies identificadas principalmente como Campylobacter jejuni subesp. jejuni pelo sistema API Campy, apresentando um maior número de espécies, subespécies e biotipos deCampylobacter dentre as amostras isoladas de carcaças de frango do que dentre as amostras clínicas isoladas nas granjas.

PALAVRAS-CHAVE
Sistema API Campy; Campylobacter ; testes enzimáticos; testes de assimilação; microaerofilia

ABSTRACT

The aim of the present study was to assess the API Campy system for characterization of Campylobacter strains. Forty-eight Campylobacter strains were isolated from 22 three-week-old broiler flocks: 15 from cecal droppings, 5 from feces, 3 from cloacal swabs, and 21 from carcasses. The strains were presumptively analyzed by phase contrast microscopy, Gram staining, catalase/oxidase activity, and latex agglutination test, and were then inoculated into the API Campy system, which consists of enzyme-linked and conventional assays under aerobic conditions and assimilation or inhibition tests under microaerophilic conditions, both incubated at 37º C for 24–48 hours, the readings made with a computerized system. A total of 43 strains (89.58%) could be identified, whereas 5 (10.41%) yielded an unacceptable profile. The following species were identified: C. jejuni subsp. jejuni (68.8%), C. coli (8.3%), C. jejuni subsp doylei (6.3%), C. upsaliensis (4.2%) and C. fetus subsp. fetus (2.1%). An 81.8% prevalence was found for Campylobacter in broiler flocks, mainly Campylobacter jejuni subsp. jejuni, identified by the API Campy system, showing a larger number of species, subspecies and biotypes of Campylobacter among the strains isolated from carcasses than among the clinical strains obtained from poultry farms.

KEY WORDS
API Campy system; Campylobacter ; enzyme-linked conventional assay assimilation tests; microaerophilic conditions

Campylobacter termófilos são microorganismos patogênicos associados com aves ou alimentos de origem avícola (GREGORY et al., 1997; HALD et al., 2000). Sua importância está relacionada à prevalência de Campylobacter jejuni nos frangos de corte e suas carcaças (BERRANG et al., 2001; JORGENSEN et al., 2002), cuja frequência e os níveis de contaminação têm sido correlacionados com casos de gastroenterites em humanos (KRAMER et al., 2000). Esta correlação decorre da persistência de Campylobacter no habitat do frango de corte, que proporciona a colonização intestinal assintomática na ave, sendo esta a origem mais importante de contaminação das carcaças (BUHR et al., 2002; DOMINGUES et al., 2002; EVANS; SAYERS, 2000; MEAD, 2002). Por ser um micro-organismo microaerófilo, o Campylobacter é considerado de difícil cultivo (PRESTON; PENNER, 1989), além da insuficiência de intervenções estratégicas para a redução da contaminação das carcaças de frango pelo agente (PATTISON, 2001). Por outro lado, os estudos de sua taxonomia, epidemiologia, métodos microbiológicos convencionais, biologia molecular e patogenia estão acelerados (LLOVO et al., 2003; SALEHA, 2002). A rastreabilidade da fonte de origem é importante no esclarecimento da contaminação dos lotes de frango de corte, na higiene alimentar e na prevenção de doenças veiculadas por alimentos (CARVALHO et al., 2001). Neste sentido, tem sido incrementado o emprego de testes rápidos e de fácil execução nas rotinas laboratoriais, já que sua identificação por testes bioquímicos convencionais requer no mínimo cinco dias (SHIH, 2000). A necessidade de reconhecer e referenciar Campylobacter tem o objetivo de um melhor entendimento das fontes de infecção e vias de transmissão do agente (FROST et al., 1998).

A caracterização das espécies de Campylobacter é dificultada devido à inatividade do micro-organismo frente aos açúcares e por serem bioquimicamente pouco ativos (EUZÉBY, 2002). Testes fenotípicos usados para diferenciar outros grupos de bactéria, como os membros da família Enterobacteriaceae, não têm o mesmo potencial discriminatório para Campylobacter, dificultando sua identificação na rotina laboratorial (ON, 1996). Segundo ON (1996), os problemas fundamentais na identificação do agente por testes fenotípicos decorrem da falta de padronização dos testes utilizados entre os laboratórios, dificultando a comparação dos dados de diversas origens, e a falta de objetividade dos esquemas de identificação disponíveis, onde um único teste seria essencial para caracterizar a espécie, não levando em consideração os mutantes (ZINPRIN et al., 2001). Exemplo disso é a utilização da hidrólise do hipurato como chave para distinguir C. jejuni, apesar da existência de amostras de C. jejuni negativas, que seriam confundidas como C. coli e outros campilobacteres que não o hidrolisam (EUZÉBY, 2002). Nestes casos são necessárias técnicas mais sensíveis como a cromatografia em relação à nihidrina para a diferenciação das espécies (SHIH, 2000).

Segundo EUZÉBY (2001), o kit API Campy compreende duas galerias com 21 testes para a identificação de 18 gêneros de Campylobacter, sendo de fácil utilização. Porém, a taxonomia de certas espécies é ainda mal definida. Adicionalmente, a resistência ao ácido nalidíxico normalmente distingue Campylobacter lari de C. jejuni e C. coli (SHIH, 2000). SHIH (2000) comparou os testes do API Campy com o método bioquímico convencional para caracterização de 85 amostras de Campylobacter isoladas de carcaças de aves e 29 amostras de referência de bactérias diferentes de Campylobacter, obtendo 100% de concordância para gênero e para as espécies C. jejuni (96%) e C. coli (97%). Assim, este trabalho objetivou verificar a aplicação do sistema comercial API Campy para identificação de bactérias do gênero Campylobacter isoladas de descarga cecal, fezes, swabs cloacais e carcaças de frangos de corte.

Foram avaliadas 48 amostras de Campylobacter,das quais 15 foram isoladas de descarga cecal, cinco de fezes, três de swabs cloacais e 21 de carcaças, oriundas de 22 lotes de frangos de corte com três semanas de idade. Como controles utilizou-se Campylobacter jejuni spp. jejuni 1 (ATCC 33291), C. jejuni ssp. jejuni 2 (Instituto Adolfo Lutz IAL 2247) e Campylobacter coli (Instituto Biológico de São Paulo IB). As amostras previamente caracterizadas por microscopia em contraste de fase, coloração de Gram, catalase/oxidase e aglutinação em látex (Dryspot Campylobacter Test) estavam estocadas a -20º C e foram cultivadas em Agar sangue em microaerofilia (5% O2, 10% CO2 85% N2) a 42º C por 48h (HERNANDEZ, 1996). Para a inoculação foi necessário obter-se uma suspensão consistente com o padrão 6 na escala de McFarland.

Posteriormente, foram inoculadas 100 µL desta suspensão em uma ampola de3 mL de NaCl 0,85% (Kit API Campy) para a formação do inóculo da primeira galeria e teste de H₂S. Após, 150µL foram adicionadas em uma ampola de AUX Medium (Kit API Campy) para a inoculação na segunda galeria. A caracterização e identificação para a espécie, subespécie e biotipo de Campylobacter foi realizada em 20 microtubos compreendidos no kit API Campy, que utiliza minitestes padronizados, teste de catalase e uma base de dados específica informatizada. A primeira parte da galeria compreende testes enzimáticos e convencionais incubados em aerobiose (urease, redução de nitratos, esterase, hipurato, gama glutamil transferase, redução do cloreto de trifenil tetrazolium, pirrolidonil arilamidase, L-arginina arilamidase, L-asparato arilamidase e fosfatase alcalina). A segunda parte da galeria inclui testes de assimilação ou de inibição incubados em microaerofilia (produção de H₂S, assimilação daglicose, sucinato, acetato, propionato, malato e citrato, sensibilidade ao ácido nalidíxico, cefazolina e eritromicina). A primeira galeria foi incubada em aerobiose e a segunda em microaerofilia, ambas a 37º C por 24-48 horas, quando se procedeu a leitura consultando-se o sistema de identificação informatizado.

Os resultados do presente trabalho estão apresentados nas Tabelas 1 e 2. Foram caracterizadas pelo sistema API Campy 48 amostras de Campylobacter, sendo possível identificar 43 amostras, enquanto que 5 obtiveram perfil inaceitável. A identificação de Campylobacter termófilos resultou em três espécies: C. jejuni, C. coli e C. upsaliensis. Embora a cultura primária tenha sido realizada em 42º C, foi obtida uma espécie não termófila, C. fetus subsp. fetus. Na identificação das espécies enteropatogênicas (C. jejuni e C. coli ) encontrou-se principalmente C. jejuni subsp. jejuni (68,8%), e dentro desta, o biotipo C. jejuni subsp. jejuni 1 (58,3%), C. jejuni subsp. jejuni 2 (10,4%), C. jejuni subsp doylei (6,3%), além da espécie C. coli (8,3%). Já as espécies não enteropatogênicas encontradas foram C. upsaliensis (4,2%) e C. fetus subsp. fetus (2,1%).

As amostras de Campylobacter isoladas e as amostras de referência utilizadas como controle no sistema API Campy envolveram 51 testes, dos quais 46 (90,2%) corresponderam a uma boa identificação, enquanto que cinco amostras revelaram perfil inaceitável (10,4%). O perfil de identificação obtido pelo sistema API Campy para as amostras isoladas resultou na probabilidade de 79,3% a 99,7% para C. jejuni subsp. jejuni 1, de 99,5% a 99,9% para C. jejuni subsp. jejuni 2, de 76,2% a 99,6% para C. coli, 90,3% a 98,8% para C. doylei, 94,7% para C. upsaliensis e 84,8% para C. fetus. Para as amostras de referência, as probabilidades encontradas foram de 99,4% paraC. jejuni subsp. jejuni 1 (ATCC33291-Oxoid®), 99,9% para C. jejuni ssp. jejuni 2 (IAL 2247) e 99,9% para C. coli (IB).

Tabela 1
Identificação de amostras de Campylobacter isoladas de descarga cecal, fezes, swab s cloacais e carcaças de frangos de corte e de amostras de referência.

Identificação	Nº de amostras	%
C. jejuni ssp. jejuni 1	28/48	58,3
C. jejuni ssp. jejuni 2	5/48	10,4
C. coli	4/48	8,3
C. jejuni ssp. doylei	3/48	6,3
C. upsaliensis	2/48	4,2
C. fetus ssp. fetus	1/48	2,1
Perfil inválido	5/48	10,4
Amostras de referência:
C. jejuni ssp. jejuni 1 (ATCC 33291)	1
C. jejuni ssp. jejuni 2 (IAL)	1
C. coli (IB)	1

Tabela 2
Distribuição das espécies, subespécies e biotipos de Campylobacter identificados em 22 lotes de frangos de corte.

Lote	C. spp.	C. jejuni 1	C. jejuni 2	C. zcoli	C.doylei	C. upsaliensis	C.fetus	Inválido
1	40	4		1
2	25	1		2
3	5							1
4	5				1
5	5	1				1
6	25	1		1
7	5	1
8	25
9	25	1	1
10	25	1				1
11	25	3
12	25	2	1
13	25							2
14	20
15	25	2						1
16	20	2
17	25	1						1
18	25		1
19	25	2
20	25	2	1
21	25	2
22	25	2	1		2		1
Total	466	28	5	4	3	2	1	5
%	85,35	58,3	10,4	8,3	6,3	4,2	2,1	10,4

Conforme a Tabela 2, observa-se a presença de mais de uma espécie de Campylobacter nos lotes 1, 2 e 6 . A identificação de uma única espécie ocorreu nos lotes 7, 11, 15, 16, 17, 19 e 21, enquanto nos lotes 9, 12 e 20 foram encontrados C. jejuni subsp. jejuni 1 e 2. O perfil inválido detectado pelo sistema API Campy ocorreu em cinco amostras e nos lotes 3, 13, 15 e 17. Entretanto, estas foram caracterizadas presuntivamente e confirmadas pelo teste de aglutinação em látex. Adicionalmente, em dados não contemplados na Tabela 2, observou-se resistência ao ácido nalidíxico em 45,8% das amostras avaliadas (22/ 48), enquanto C. jejuni 1 apresentou 53,6% (15/28), C. jejuni 2, 60% (3/5) e C. coli, 50% (2/4). Para a eritromicina, o C. coli apresentou uma resistência de 50,0% (2/4), C. jejuni 2 40,0% (2/5) e C. jejuni 1 17,86% (5/28). O sistema API Campy estabelece até 30% de resistência a eritromicina para a identificação de C. coli, enquanto para o C. jejuni esta é inferior, em torno de 1 a 4%. C. jejuni 1 foi resistente a cefazolina em 67,9% (19/28) e para C. jejuni 2 em 60% (3/5), enquanto para C. coli foi de 25% (1/4). O C. jejuni caracteriza-se como resistente a cefazolina (96%). Entretanto, esta resistência foi ainda menor ao estabelecido para o C. coli (79%). O teste de hidrólise do hipurato resultou em 75% (3/4) de amostras positivas de C. coli, enquanto o esperado seria de 0%. A não redução de nitratos, a sensibilidade a cefazolina, ao ácido nalidíxico e a eritromicina caracterizaram as amostras de C. doiley em 100% (3/3). O teste de esterase negativo e a sensibilidade à cefazolina identificaram as amostras de C. upsaliensis em 100% (2/2) e do C. fetus (1/1). Grande parte das amostras reduziu o TTC (45/47; 93,6%), enquanto somente 6,4% (3/47) das amostras não o reduziram, entre elas dois C. jejuni 1 e um de C. doylei. Nenhuma amostra produziu H₂S ou hidrolisou a uréia.

Para as carcaças foram identificadas 21 amostras (21/24) procedentes de 16 lotes, as quais resultaram em quatro espécies e duas subespécies. Esta foi predominantemente identificada em 66,7% para C. jejuni, sendo 42,9% (9/21) para C. jejuni subsp. jejuni 1 e 23,8% (5/21) para C. jejuni subsp. jejuni 2, com 9,5% (2/21) para C. jejuni subsp. doylei, enquanto as outras três espécies resultaram em 14,3% (3/21) para C. coli e 4,8% (1/21) de C. fetus e C. upsaliensis. Três amostras obtiveram um perfil inválido em dois lotes. As amostras isoladas na granja foram classificadas em quatro espécies de Campylobacter e principalmente a espécie C. jejuni em 75% (18/24), enquanto foi obtido 4,2% (1/24) para C. coli e C.upsaliensis. Nas descargas cecais, com origem em 13 lotes, foram identificadas em 93,3% (14/15) para C. jejuni subsp. jejuni 1 e somente em um lote (10) ocorreu 6,67% (1/15) para C. upsaliensis. Já as amostras de fezes, com origem em 4 lotes, foram identificadas em 60,0% (3/5) para C. jejuni subsp. jejuni 1 e em 20% (1/5) paraC. jejuni subsp. doylei. As quatro amostras de swabs de cloaca procederam de três lotes, ocorrendo em 50% (2/4) a presença de C. jejuni subsp. jejuni 1 e 25% (1/4) para C.coli. Duas amostras resultaram em perfil inválido, sendo encontradas nas fezes e no swab de cloaca, respectivamente nos lotes 17 e 15.

Com o uso do sistema API Campy foi demonstrada prontamente a caracterização das amostras de Campylobacter. Entretanto, a ocorrência de perda do perfil para algumas espécies, em um teste considerado chave para a sua diferenciação, pode ter prejudicado sua aplicabilidade na identificação das amostras que resultaram em um perfil inválido, sugerindo que estas podem ter sido resultado de mutações (ON, 1996). Um maior número de espécies de Campylobacter foi encontrado nas carcaças em relação às amostras clínicas na granja, reforçando as diferentes origens de contaminação e/ou contaminação cruzada durante o processo. Os dados do presente trabalho sugerem a necessidade de técnicas mais sensíveis, como metodologias moleculares para um melhor esclarecimento dos testes comerciais disponíveis (COLLES et a.l, 2003; NADEAU et al., 2002). Segundo EUZÉBY (2001), não existe um método ideal para identificar campilobacteres, sendo recomendável utilizar um conjunto de procedimentos. Adicionalmente, a taxonomia do Campylobacter é complexa pela sua diversidade, com uma nova espécie ou subespécie descrita por ano, sendo complexo desenvolver esquemas de identificação que os reconheçam (ON, 1996). No presente trabalho foi encontrada uma prevalência de 81,8% de Campylobacter nos lotes de frango de corte estudados, identificados pelo sistema API Campy como pertencentes à espécie Campylobacter jejuni subesp. jejuni em 68,8% dos casos, precisamente a espécie mais frequentemente relatada nas ocorrências de gastroenterite em seres humanos (GAUDREAU; GILBERT, 2003), reforçando a importância da caracterização das amostras de Campylobacter isoladas de origem aviária, para corresponder às expectativas de rastreabilidade das fontes de contaminação pelo agente.

REFERÊNCIAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Jun 2021
• Data do Fascículo
  Apr-Jun 2009

Histórico

• Recebido
  23 Ago 2007
• Aceito
  06 Maio 2009