EVALUACIÓN ENTRE CUATRO TÉCNICAS SEROLÓGICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES CAUSADAS POR BRUCELLA ABORTUS EN BOVINOS

AVALIAÇÃO ENTRE QUATRO TÉCNICAS SEROLÓGICAS PARA O DIAGNÓSTICO DE INFECÇÕES CAUSADAS PORBRUCELLA ABORTUS EM BOVINOS

ABSTRACT

Serum samples from 200 vaccinated adult bovine females from two herds were analyzed by buffered antigen acidified plate test (AAT) (Rose Bengal Plate Test), indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAI), 2-mercaptoethanol test (2-ME) and complement fixation test (FC). For ELISAI, the fixed value of 45 percent positivity (PP) was used. Group A was composed of 100 animals, with description of reproductive disturbances compatible with brucellosis and reagent to the AAT. Group B was composed of 100 animals serologically free of B. abortus for at least two years. Additionally, all serum samples were tested using the AAT, the 2-ME and the FC to confirm negative status. The combination of two tests, FC and 2ME was used as the gold standard. The relative sensitivity and specificity and the Kappa were calculated for each test. The result of kappa for 2-ME in relation to the FC and of the AAT and the ELISAI in relation to the gold standard was, respectively, 0.78, 0.86 And 0.84. The relative sensitivities (Sr) were, respectively, 84.1% (53/63), 100% (53/53) and 98.1% (52/53), and the relative specificities (Er) were 93.3% (111/119), 90.1% (100/111) and 90.1% (100/111). For comparison between the ELISAI and the AAT, there was obtained a Kappa of 0.91, Sr of 93% (93/100) and Er of 98% (98/100). Conclusions: 1 The option of constituting the gold standard based on at least two tests was the most suitable for this study; 2 The ELISAI resulted in values of Sr and Er similar to the AAT. Therefore, the AAT and the ELISAI are good for screening in regard to the diagnosis of brucellosis.

RESUMO

O estudo objetivou comparar o desempenho do teste mercaptoetanol (2-ME) com o teste fixação de complemento (FC) e os testes antígeno acidificado tamponado (AAT) e ELISA indireto (ELISAI) frente ao gold standard, para o sorodiagnóstico da brucelose em bovinos. Também se comparou o ELISAI com o AAT. Foram processadas 200 amostras de soro de fêmeas bovinas adultas de dois rebanhos, denominados grupos A e B. O grupo A foi composto de 100 fêmeas vacinadas contra brucelose, com histórico de problemas reprodutivos compatíveis com a doença e reatoras ao AAT. O grupo B foi composto de 100 fêmeas vacinadas e não reatoras ao AAT por mais de dois anos. Todos os soros foram submetidos aos quatro testes. Foi empregado, como gold standard, a combinação do FC com o 2ME. O índice Kappa foi usado como medida de concordância e seu resultado, para o 2-ME, o AAT e o ELISAI foi de, respectivamente, 0,78, 0,86 e 0,84. As sensibilidades relativas (Sr) foram de, respectivamente, 84,1%, 100% y 98,1% e as especificidades relativas (Er), 93,3%, 90,9% e 90,1%. Entre o ELISAI e o AAT, obteve-se Kappa de 0,91, Sr de 93% e Er de 98%. Conclusões: 1-A opção de se contituir o gold standard baseado em dois testes foi a mais adequada para este estudo; 2-Os valores de Sr e Er do ELISAI foram semelhantes aos do AAT. 3-O AAT e o ELISAI mostraram ser testes muito sensíveis e de boa especificidade e, portanto, adequados para serem usados como triagem no diagnóstico da brucelose.

PALAVRAS-CHAVE
Brucelose bovina; sorodiagnóstico; ELISA indireto; 2-mercaptoetanol; fixação de complemento

INTRODUCCIÓN

La brucelosis, por ser una zoonosis que perjuicios a la producción de carne y leche, es objeto de programas de control y erradicación en muchos países. Los perjuicios económicos provocados por la brucelosis en bovinos decuzzen de abortamientos, baja del prestigio de las propiedades infectadas, disminución de sus índices reproductivos, valor mas bajos animales y productos provenientes de áreas acometidas y pérdida de mercados potenciales (PAULIN, 2006).

Por esos motivos, se han desarrollado programas de control y erradicación de la brucelosis en varios países que se apoyan en la vacunación masiva de terneras con la cepa B. abortusB19 o con B. abortusRB51 y en la certificación de rebaños libres. (PAULIN, 2006a). Esta última operación se apoya en el serodiagnóstico: los tests de rutina se realizan a intervalos regulares, con sacrificio de los animales reactores, hasta la obtención de tres o más tests negativos para todos los animales destinados a la reproducción. Como el diagnóstico positivo significa la remoción del animal de la población, las características de sensibilidad y especificidad relativas de los tests se tornan importantes, pues resultados falso-positivos obligan a sacrificar animales sanos, y resultados falso-negativos a dejar fuentes de infección en contacto con los animales sanos (PAULIN, 2006b).

Los tests oficiales para diagnostico serológico de la brucelosis, del Programa Nacional de Control y Erradicación de la Brucelosis y de la Tuberculosis (PNCEBT) de Brasil son el antígeno acidificado amortiguado Rosa Bengala (AAT), el 2-mercaptoetanol (2-ME) y el test de fijación del complemento FC (BRASIL, 2004). En Argentina, el Programa Nacional es similar, solamente que el AAT es reemplazado por el test del antígeno brucélico ácido amortiguado para prueba rápida en placa – BPA (SERVICIO NACIONAL DE SANIDAD Y AGROSLIMENTARIA, 2003).

Una vez que se observa un incremento en los títulos de la sub clase de inmunoglobulinas G₁(IgG₁), en animales natural o experimentalmente infectados, muchos tests visan la detección de esa clase de anticuerpos. Entre estos, el test inmuno-enzimático ELISA de Competición (ELISAC) y el FC son los que presentan límite de detección más alto para la IgG_1.Estos tests poseen óptimos valores de sensibilidad y especificidad relativas (WRIGHT; NIELSEN, 1990). El FC es el que presenta mejor correlación con los aislamientos en animales infectados natural o experimentalmente (NIELSEN, 1995), lo que llevó a su adopción como test de referencia para la validación de otros tests serológicos (PAULIN, 2006b). El ELISA posee ventaja por no presentaren el fenómeno de prozona además de poder ser automatizado (NIELSEN et al., 1995).

El 2-ME a pesar de poseer buena especificidad, debe ser ejecutado junto con el test de suero aglutinación lenta en tubos (SAL), por que, como no detecta anticuerpos de la sub clase IgM, no es adecuado para casos de infecciones agudas, y pueden presentar resultados falso-negativos en títulos que varían de 25 a 200 UI (25-400) en el SAL (BERCOVICH, 1998). Otro motivo está ligado al fenómeno de prozona. NIELSEN (1992) demostró la ocurrencia de resultados falsonegativos en el 2-ME atribuidos al prozona y NICOLETTI (1992) demostró la ocurrencia de resultados falsonegativos al 2-ME atribuidos al fenómeno.

Los tests utilizando antígeno acidificado amortiguado son cualitativos, rápidos, baratos, de ejecución simple y poseen óptima sensibilidad y buena especificidad. El mas difundido es el AAT (PAULIN, 2006). Sin embargo, su lectura es subjetiva y estudios relatarán la ocurrencia de resultados falso-positivos (FOSGATE et al., 2002) y falso-negativos por este test (BERCOVICH, 1998).

Considerando estas informaciones y debido a la escasez de estudios sobre el ELISAI para el serodiagnóstico de la brucelosis bovina en Brasil, el objetivo del presente estudio fue comparar el desempeño del 2-ME con relación al FC, el AAT y ELISAI frente al gold standard (derivado de la combinación de los tests FC y 2-ME) y el ELISAI con relación al AAT para el diagnóstico de la brucelosis en esta especie visando contribuir para el avanzo del PNCEBT.

MATERIAL Y MÉTODOS

Delineamento experimental

Fueron utilizados sueros sanguíneos de 200 hembras de bovinos sometidos a cuatro diferentes tests, visando el diagnóstico serológico de la brucelosis. Los tests, realizados simultáneamente considerando las interpretaciones en serie y en paralelo, fueron: AAT, ELISAI, 2-ME y FC.

Animales y muestras

En el período de enero a diciembre de 2002, fueron obtenidas muestras de suero de 200 hembras bovinas adultas (24 a 60 meses) de la raza Nelore (aptitud para carne), provenientes de dos propiedades situadas en la región de Araçatuba, norte del Estado de São Paulo y denominadas, en el presente estudio, de propiedad A (grupo A) y propiedad B (grupo B).

Grupo A: rebaño compuesto de 100 hembras vacunadas para brucelosis con la cepa B19 y con histórico de problemas reproductivos compatibles con la enfermedad. Todos los animales del rebaño fueron reactivos al AAT, ejecutado por el veterinario responsable del rebaño.

Grupo B: rebaño compuesto de 100 hembras vacunadas para brucelosis con la B19 y no reactivas al AAT por más de dos años. El test fue ejecutado por el veterinario responsable por el rebaño.

Antígenos

Los antígenos utilizados para el serodiagnóstico por AAT, SAT, 2-ME y FC fueron producidos en el Instituto Biológico, de acuerdo con el protocolo descripto por el Centro Panamericano de Zoonosis (CEPANZO, 1969). Todos fueron producidos a partir de la cepa 1119-3 de Brucella abortus.

Para detectar los anticuerpos de la clase IgG₁contra B. abortusen las hembras, fue utilizado el ELISAI (kitCeditest® B. abortus)desarrollado por el IASH-Institute for Animal Science and Health, cuyo antígeno se constituyó del lipopolisacárido (LPS) de la pared de B. abortusmuestra 99 en la dosis de reactividad óptima (INSTITUTE FOR ANIMAL SCIENCE AND HEALTH, 2000).

Protocolo de los tests

Los tests AAT, 2-ME y SAT fueron realizados de acuerdo con ALTON et al. (1988). La interpretación de sus resultados fue realizado de acuerdo con el reglamento del PNCEBT (BRASIL, 2004). Se incrementaron las diluciones 1:400 y 1:800 del 2-ME, a finde evitar el fenómeno de prozona. Los resultados considerados sospechosos por el 2-ME fueron excluidos de los análisis.

El kitde ELISAI Ceditest® B. abortusfue ejecutado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (INSTITUTE FOR ANIMAL SCIENCE AND HEALTH, 2000). La lectura de la densidad óptica fue hecha en aparato Multiskan, utilizándose filtro de 405nM. Los resultados fueron expresos en porcentaje de positivos (PP), considerándose como reactivos sueros con PP ≥ 45% y como no reactivos, sueros con PP < 45% (WRIGHT et al., 1993).

La ejecución de la FC, así como la titulación de la hemolisina, complemento y antígeno fueron hechos de acuerdo con la técnica descrita por ALTON et al. (1988). El título del suero fue obtenido determinándose la recíproca de la mayor dilución de la fijación del 25% del complemento. Fueron considerados como positivos sueros con títulos iguales o sobre cuatro.

Análisis de datos

Para elaborar el gold standardse tomó la combinación de dos tests de referencia, FC y 2-ME, (realizados simultáneamente las interpretaciones en serie y en paralelo), considerándose animales positivos para los reactivos en FC (título≥cuatro) y en 2-ME (criterio para hembra vacunada) y como negativos los animales no reactivos en FC (título< cuatro) y en 2-ME (criterio para hembra vacunada). Eso criterio fue adoptado siguiendo la recomendación de MARTIN et al. (1987). La interpretación del 2-ME siguió la legislación del PNCEBT (BRASIL, 2004) y los resultados considerados sospechosos para el 2-ME fueron excluidos de los análisis. El índice de concordancia Kappa fue calculado para todos los tests y los valores obtenidos fueron interpretados de acuerdo con LANDIS; KOCH (1977).

RESULTADOS

Todos los tests combinados detectaran 52% (52/100) sueros reactivos para el Grupo A y 98% (98/100) sueros no reactivos (para el Grupo B).

Para el grupo A, el estudio identificó 80% (80/100) de animales reactores para brucelosis apenas en el FC y 53% (53/100) de animales reactores para brucelosis en los tests FC y 2-ME. En ese grupo, XVIII sueros presentaron resultados sospechosos al 2-ME.

La Tabla 1 trae el resultado del 2-ME con relación al FC. Los valores encontrados de sensibilidad relativa (Sr) y especificidad relativa (Er) para el 2-ME fueron, respectivamente, 84,13% (53/63) y 93,28% (111/119). La mayor parte de los sueros (71% 27/38) con títulos grandes al 2-ME ( 200 UI) mostraron títulos igualmente grandes al FC (> 32). El resultado del índice de concordancia Kappa fue 0,78 (óptimo). El porcentaje de falso-positivos fue de 6,7% (8/119) y de falsonegativos, 15,9% (10/63).

Tabla 1
Resultados del 2-ME frente al test FC (criterio para hembra vacunada). São Paulo, 2007.

2-ME	FC										Total
	positivos							negativos
Reactores	≥4 a 16	>16 a 32	>32 a 64	>64 a 128	>128	total		negativo	>0 a <4	total
25/25	1	01				02		04		04	06
25/50
25/100
50I/50I								02		02	02
50/50	1					01					01
50I/100	1					01		01		01	02
50/100		01				01					01
100I/100I		01				01					01
100I/100								01		01	01
100/100	3		01			04					04
100/200	1	01	01			03					03
200I/200I		01		01		02					02
200/200	4	07	12	09	06	38					38
Total	11	12	14	10	06	53 (a)		08	-	08 (b)	61
No Reactores	06	04				10 (c)		110	01	111 (d)	121
Total	17	16	14	10	06	63		118	01	119	182

• 2-ME test 2-mercaptoetanol; FC teste fijación del complemento. Kappa 0,78 (concordancia óptima)

Para el AAT, las Sr y Er encontradas, con relación al gold standard, fueron respectivamente 100% (53/53) y 90,09% (100/111) Tabla 2. El índice Kappa fue 0,86 (óptimo). El porcentaje de falsos positivos fue de 9,9% (11/111) y de falsos negativos 0% (0/53). Si apenas el FC hubiesse sido considerado como gold standard, el Sr continuaría la misma 100% (100/100) pero Er caería para 83,33% (100/120). El valor del Kappa continuaría óptimo (0,80).

Tabla 2
Resultados del AAT frente al gold standard (combinación de los tests FC y 2-ME). São Paulo, 2007.

gold standard (FC + ME)	Positivo	Negativo	Total
AAT
Positivo	53	11	64
Negativo	0	100	100
Total	53	111	164

• AAT test del antígeno acidificado amortiguado Rosa de Bengala; 2-ME test 2-mercaptoetanol; FC test fijación del complemento. Kappa 0,86 (concordancia óptima)

Los resultados del ELISAI con relación al gold standardse presentan en la Tabla 3. Los valores de Sr y Er fueron, respectivamente, 98,11% (52/53) y 90,09% (100/111). La mayor parte de los sueros (72,4% 21/29) con títulos grandes al ELISAI (PP > 112%) mostraron títulos igualmente grandes al FC (≥ 64). De los 63 sueros reactivos al ELISAI, 52 (82,5%) fueron positivos al FC y 11 fueron negativos al FC (17,5%). Apenas un suero fue positivo al FC y negativo al ELISAI, generando un porcentaje de muestras con resultados falso-negativos de 1,9% (1/53). El resultado del índice Kappa fue de 0,78 (óptimo). El porcentaje de muestras con resultado falso-positivos fue de 9,9% (11/111). Considerando apenas el FC como goldstandard, los valores de Sr y Er caerían de, respectivamente, 98,11% para 95,0% (76/ 80) y de 90,09% para 84,17% (101/120). El Kappa continuaría óptimo (0,77). Sin embargo, al envés de 11, habrían 17 resultados falso-positivos.

Tabla 3
Resultados ELISAI frente al gold standard (combinación de los tests FC y 2-ME). São Paulo, 2007.

ELISAI	gold standard (FC + 2-ME)												Total
Reactores	positivos								negativos
	≥ 4 a 16	>16 a 32	>32 a 64	>64 a 128	>128	total			negativo	>0 a <4	total
>45 a 67,2					1	1			1	1	2
>67,2 a 90	1	3		1		5			3		3
>90 a 112	7	4	3	2	1	17			5		5
>112	4	4	11	5	5	29			1		1
Total de reactores	12	11	14	8	7	52	(a)		10	1	11	(b)	63
No reactores
≥6 a < 45				1
Totais no reactores				1		1	(c)		100		100	(d)	101
Total						53			110	1	111		164

• ELISAI testimunoenzimático ELISA indirecta; 2-ME test 2-mercaptoetanol; FC test fijación del complemento. Kappa - 0,84 (concordancia óptima).

ELISAI x AAT

Comparando el ELISAI con el AAT como padrón para el serodiagnóstico en este estudio, se obtuvo un Sr de 93% (93/100) y un Er de 98% (98/100), con apenas tres resultados discordantes (Tabla 4). El resultado del Kappa fue óptimo (0,91).El porcentaje de muestras con resultados falso-positivos fue de 2,0% (2/100) y con resultados falso-negativos 7,0% (7/100).

Tabla 4
Resultados del test ELISAI frente al test AAT. São Paulo, 2007.

AAT	Positivo	Negativo	Total
ELISAI
Positivo	93	2	95
Negativo	7	98	105
Total	100	100	200

• ELISAI - test imunoenzimático ELISA indirecta; AAT - test del antígeno acidificado amortiguado. Kappa - 0,91 (concordancia óptima).

DISCUSIÓN

El valor de Er del 2-ME encontrada en este estudio (93,3%) fue poco mas baja de los resultados relatados por STEMSHORM et al. (1985) y PAULIN et al. (2002), respectivamente 99,8% y 95,6%. La Sr (84,13%) también fue mas baja del relatado por PAULIN et al.(2002), 96,8% así como el resultado del Kappa 0,78 contra 0,92 encontrado por PAULIN et al. (2002).

De las 18 muestras discordantes del Grupo A, ocho sueros fueron reactivos al 2-ME, entretanto negativos al FC y 10 (55,6%) fueron positivos al FC pero no reactivos al 2-ME (Tabla 1).

Un dato que llamala atención esel porcentaje de resultados falso negativos del 2-ME en relación al FC. Este facto tal vez pueda ser explicado analizándose la epidemiología de la brucelosis, caracterizada por expandirse rápidamente en el rebaño. Si el organismo del hospedero afectado no tuvo tiempo hábil para desenvolver respuesta inmune humoral, no habrá concentración de anticuerpos suficiente para causarseñal en un test con limite de detección bajo, como es el caso del 2ME. De los 63 sueros positivos al FC (en títulos que variaran de cuatro a 32), diez (55,6%) no reaccionaran al 2-ME, lo que sugiere mayor sensibilidad del FC con relación al 2-ME, debido al límite de detección del primer test ser mas alto de que del segundo (KRUZE, 1975).

Para el AAT, la Sr encontrada fue de 100%, mayor que las encontradas por DAVIES (1971) y DAJER et al. (1999), respectivamente 99,6% y 98,3%. Además, el AAT detectó la mayor Sr y el mayor número de animales infectados de que cualquier otro test en este estudio, dato importante para un test generalmente adoptado como tamiz. Este resultado viene al encuentro de la actual situación epidemiológica de la brucelosis en Brasil, en que la prevalencia es de mediana a alta y donde, o los animales son vacunados o poseen historia de vacunación irregular con la cepa B19. En ambos casos, un test de Sr elevada debe ser elegido.

Sin embargo, este resultado puede incluir también falso-positivos debido a las reacciones inespecíficas (ALLAN et al., 1976), generalmente, asociadas a la presencia de la inmunoglobulina de la clase IgM en el suero sanguíneo (CORBEL, 1985). La acidificación de la suspensión de antígenos aumenta el poder de aglutinación del anticuerpo de la clase IgG₁y reduce la reactividad de la mayor parte de los anticuerpos de la clase IgM (WRIGHT ; NIELSEN, 1990). Por otro lado, CHAPPEL (1989) refiere que no hay total inactivación de esta anticuerpos. Por lo tanto, el AAT puede ser utilizado como tamiz, con tanto que uno o mas tests específicos y de sensibilidades relativas elevadas sean usados como confirmatorio.

El valor de la Er fue óptimo (90,1%) y mejor que el encontrado por DAVIES (1971) y DAJER et al. (1999), respectivamente 83,1% y 68,8%.

Para el ELISAI, la Sr obtenida en este estudio fue de 98,1%, número semejante a los encontrados por UZAL et al. (1995), SAMARTINO et al. (1999) y VANZINI et al.(1998). UZAL et al. (1995) relataran Sr de 98,7%, adoptándose punto de corte de 40% de PP (mas bajo del adoptado en este estudio, que fue de 45% de PP), mientras que SAMARTINO et al. (1999) demostraron Sr de 98,2% con punto de corte también de 40% PP. Sin embargo,VANZINI et al.(1998) verificaran Sr un poco mas elevada (99,6%). Entre tanto, el punto de corte adoptado por este autor fue mas alto de que el adoptado en el trabajo (53% PP).

Cuanto Er, el presente estudio obtuvo el valor de 90,1%, mas bajo dos que los obtenidos por UZAL et al. (1995) e SAMARTINO et al. (1999), respectivamente 98,9%, y 98,6%. Importante reiterar que los tres autores adoptaran puntos de corte distintos del presente estudio, lo que puede alterar el resultado del test.

Cuando se comparó el ELISAI con el AAT, la Sr del ELISAI fue mas baja do que la del AAT (98,1% versus 100%). Todavía, la Er fue la misma (90,1%) y, cuando el ELISAI fue comparado con el AAT, el Kappa encontrado fue 0,91 (óptimo), así como los valores de Sr y Er, respectivamente 93% e 98%.

Uno dato interesante que merece ser mencionado es que VANZINI et al. (1998) no notaram diferencia significativa en los valores epidemiológicos cuando sometieron sueros al ELISAI tanto para hembras adultas vacunadas como para hembras adultas no vacunadas.

CONCLUSIONES

Analizando los resultados de sensibilidad y especificidad relativas de los tests, el porcentaje de falso-negativos por los resultados sospechosos presentados por el 2-ME, los resultados falso-positivos del ELISAI, así como la facilidad de realización de los tests, podemos concluir:

1. La opción de constituirse el gold standardbasado en al menos dos tests fue la mas adecuada para este estudio;

2. El AAT y el ELISAI son buenos métodos de tamiz para el diagnóstico serológico de la brucelosis. Sin embargo, el uso del AAT como tamiz es recomendado si un o más tests específicos y de óptimas sensibilidades sean utilizados como confirmatorios. Para esta finalidad, el ideal seria trabajar con tests cualitativos con alto límite de detección, en que los sueros no necesitasen ser inactivados o tratados, no hubiese necesidad de titulación periódica de los reactivos utilizados y el operador no manipulase elementos tóxicos, como ocurre con los tests FC y 2ME;

3. El ELISAI generó valores de especificidad y sensibilidad relativas semejantes al AAT. Sin embargo, el ELISAI ofrece ventajas como: a) Su punto de corte puede ser ajustado de acuerdo con la prevalencia de enfermedad en la población; b) La manipulación de datos es hecha electrónicamente, o sea, la lectura es objetiva; c) El ELISAI puede ser automatizado, permitiendo el procesamiento de gran número de muestras; d) La literatura consultada relata que no hay diferencia significativa en los valores epidemiológicos cuando se analiza suero tanto de hembras vacunadas como de no vacunadas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Dra. Eliana Monteforte Cassaro Villalobos por la gentileza en asistir en la ejecución del test de ELISAI.

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Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  28 Mayo 2021
• Fecha del número
  Jan-Mar 2009

Histórico

• Recibido
  17 Abr 2007
• Acepto
  10 Dic 2008