OCORRÊNCIA DE FATORES DE VIRULÊNCIA EM ESTIRPES DE ESCHERICHIA COLI ISOLADAS DE FEZES DE CÃES ERRANTES

OCCURENCE OF VIRULENCE FACTORS IN LINEAGES OF ESCHERICHIA COLI ISOLATED FROM FAECES OF STRAY DOGS

RESUMO

Escherichia coli pode causar doenças em humanos e animais, tais como infecções do trato urinário, septicemia, meningites e gastroenterites. Cães assintomáticos podem participar da cadeia epidemiológica como reservatório de E. coli patogênica ao homem. Este estudo objetivou avaliar a ocorrência de E. coli patogênica ao homem em fezes de cães errantes sem sintomas de colibacilose e assim averiguar a participação do cão como fonte de infecção de colibacilose humana. Foram coletadas 220 amostras de fezes de animais capturados por diferentes Centros de Controle de Zoonoses do Estado de São Paulo. As amostras foram submetidas a exames microbiológicos sendo isoladas 196 (89,09%) estirpes de E. coli, cujos genes de fatores de virulência foram detectados por PCR. Cento e vinte e três (62,75%) estirpes apresentaram um ou mais dos fatores de virulência estudados. Dezesseis (8,16%) foram positivas para afa, 54 (27,55%) para sfa, 38 (19,38%) para pap, 66 (33,67%) para aer, 31 (15,81%) para cnf, 13 (6,63%) para hly, 1 (0,51%) para VT2 e nenhuma das linhagens foi positiva para LT, STa e STb. Cães errantes aparentemente sadios podem participar da cadeia epidemiológica como reservatórios de E. coli uropatogênica ao homem, pois os genes encontrados com maior freqüência estão presentes em infecções extraintestinais urinárias.

PALAVRAS-CHAVE
Escherichia coli ; fezes; cães; fatores de virulência; PCR

ABSTRACT

Escherichia coli may cause diseases in humans and animals, such as urinary infections, septicemia, meningitis and gastroenteritis. Asymptomatic dogs can participate in the epidemiologic chain as a reservoir of human pathogenic E. coli. The objective of the present study was to evaluate the occurrence of pathogenic E. coli in humans, on faeces of stray dogs without colibacillosis symptoms, and thus verify the participation of dogs as a source of human colibacillosis infection. Two hundred and twenty samples of faeces from animals captured by different Zoonotic Control Centers in São Paulo state, Brazil, were collected. These faeces, when submitted to microbiological exams, resulted in the isolation of 196 (80.09%) strains of E. coli, whose virulence genes were detected by PCR. At least one of the virulence factors studied was present in 123 (62.75%) strains. Sixteen (8.16%) were afa positive, 54 (27.55%) were positive to sta, 38 (19.38%) to pap, 66 (33.67%) to aer, 31 (15.81%) to cnf, 13 (6.63%) to hly, 1 (0.51%) to VT2, and none of the strains were positive for LT, STa or STb. Stray dogs which were apparently healthy could be participating in the epidemiologic chain as an E. coli reservoir uropathogenic to man, as the genes found in a higher frequency are present in extraintestinal infections, or more specifically, urinary infections.

KEY WORDS
Escherichia coli ; faeces; dogs; virulence factors; PCR

INTRODUÇÃO

Escherichia coli é considerada habitante natural do trato intestinal de animais e do homem, mas também aparece como uma importante causa de diarréias, infecções urinárias, mastites, septicemias, meningites. Tem sido responsável por causar diarréia seguida de morte em crianças de países em desenvolvimento, assim como colite hemorrágica (HC), síndrome urêmica hemolítica (HUS) em crianças e adultos em países desenvolvidos. Veículos de infecção têm sido alimentos de origem animal, água e alimentos mal lavados como frutas, verduras e raízes. (DROLET et al., 1994; SUSSMAN, 1997; TRABULSI; CAMPOS, 1999; GUTH et al., 2002; YATSUYANAGI et al., 2002).

A habilidade de E. coli em causar doença em humanos é devida à presença de vários fatores de virulência localizados em genes plasmidiais e/ou cromossomais (DONNENBERG; WHITTAM, 2001). A patogenicidade do microrganismo está relacionada à forma como a bactéria se liga à célula do hospedeiro, à produção de toxinas e a sua invasão (SEARS; KAPER, 1996; FARMER III, 1999).

Existem relatos da ocorrência de colibacilose em cães e gatos, além de outros animais, tendo sido relatadas infecções urinárias, prostatites, vaginites e piometra, além de septicemias e endotoxemias (BEUTIN 1999).

O grupo das E. coli uropatogênicas (UPEC) está associado a doenças no trato urinário tanto em humanos como em animais. As adesinas mais importantes nas infecções urinárias são os pili. As fímbrias S (sfa) estimulam a produção de Interleucina-6 pelas células do epitélio renal na presença de UTI (infecção do trato urinário) (SAYLERS; WHITT, 1994). As fímbrias tipo 1 participam na colonização da bexiga e trato urinário inferior. A adesina das estirpes que infectam os rins é a fímbria P, que está associada às pielonefrites (CHEN et al., 2003).

Hemolisinas são citotoxinas (HlyA) que conduzem a uma lise osmótica principalmente de eritrócitos (TRABULSI; CAMPOS, 1999; RIBEIRO, 2001). E. coli uropatogênicas podem apresentar a habilidade de adquirir ferro, utilizando sideróforos, exoproteínas codificadas pelo gene aer plasmidiais (SAYLERS; WHITT, 1994). A aerobactina, sideróforo bacteriano, tem sido associada a estirpes de E. coli que causam pielonefrite e cistite em humanos (JOHNSON et al., 1988).

O fator necrotizante citotóxico (NTEC), está associado com infecções extraintestinais (septicemia e infecção do trato urinário) e enterites no homem e animais (SEARS; KAPER, 1996; RIBEIRO, 2001).

Sete fatores de virulência (FVs), incluindo pilus tipo 1 (pili), pilus associado com pielonefrite (pap), fímbria S (sfa), adesina afimbrial I (afa I), hemolisina (hly), aerobactina (aer) e fator citotóxico necrotizante (cnf) desempenham um importante papel no desenvolvimento de UTI humanas. Linhagens de E. coli isoladas de cães e gatos com UTI são similares às estirpes de E. coli isoladas de UTI humana. Pili foi o fator de virulência mais comumente encontrado entre as linhagens UPEC isoladas de cães e gatos e de humanos. Além disso, esta fímbria foi freqüentemente observada em estirpes de E. coli isoladas de fezes de cães e gatos sadios. O gene codificador da fímbria P foi encontrado com maior freqüência em fezes de cães saudáveis (YURI et al., 1998; KURAZONO et al., 2003). Escherichia coli isolada de fezes de cães, comumente exibem características típicas de ExPEC humana (E. coli extraintestinal), podendo ser relacionados com isolados clínicos de pacientes humanos com cistite, pielonefrite, bacteremia ou meningite (JOHNSON et al., 2001).

Cães têm sido apontados como potenciais reservatórios de linhagens de E. coli que causam UTI em humanos, pelo fato destes microrganismos apresentarem proximidade filogenética, de sorogrupos e certos fatores de virulência associados com E. coli extraintestinal isolados de fezes e urina caninos, sugerindo a ocorrência de transmissão de E. coli patogênica entre cães e humanos (SANNES et al., 2004). Cães e gatos compõem um grupo de animais de grande proximidade ao homem. Como conseqüência, a possibilidade de transmissão de microrganismos entre estas espécies de hospedeiros é extremamente elevada (BEUTIN, 1999).

O presente estudo teve como objetivo verificar a ocorrência de E. coli nas fezes de cães errantes, com ausência de sintomas de colibacilose, avaliando a possível presença de fatores de virulência nessas estirpes que apresentam similares às observadas nas linhagens isoladas de infecções em humanos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Coleta das amostras

A coleta do material foi realizada nas dependências dos Centros de Controle de Zoonoses (CCZs) pertencentes aos Municípios de Guarulhos, Cotia e Barueri, Estado de São Paulo. Foram colhidas amostras de fezes de 220 cães recolhidos pelos CCZ das cidades referidas. A escolha dos cães foi realizada independentemente de raça, porte, idade ou sexo, levando-se em consideração o estado geral e a consistência das fezes que deveriam indicar ausência de diarréia.

A coleta de amostras de fezes foi feita no momento em que os animais apresentavam sinais clínicos de anestesia, antes de serem eutanasiados. Tal coleta foi realizada com o auxílio de suabe estéril introduzido profundamente ao intestino (porção retal), após os animais terem sido anestesiados.

Exames microbiológicos de amostras de fezes de cães

Os suabes foram encaminhados ao laboratório em condição de refrigeração, condicionados em geladeira portátil de isopor com gelo reciclável. No laboratório, foram submetidos aos exames microbiológicos que consistiram inicialmente no cultivo dos mesmos em caldo BHI (brain and heart infusion broth), ágar sangue de carneiro (5%) (blood agar base) e ágar MacConkey (MacConkey agar) com incubação em aerobiose, a 37° C com leituras a 24-96h. As amostras também foram cultivadas em ágar Sabourauddextrose (Sabouraud dextrose agar) com incubação em aerobiose, mantidas em temperatura ambiente, por um período mínimo de 7 dias. As amostras incubadas em caldo BHI foram posteriormente semeadas em ágar sangue de carneiro (5%) e ágar MacConkey, sendo a incubação destas similar à descrita anteriomente para o cultivo inicial.

Os microrganismos isolados foram identificados de acordo com LENNETTE et al. (1985) e classificados segundo KREEGER-VAN-RIG (1984), KRIEG; HOLT (1994), FARMER III et al. (1999).

Pesquisa dos genes codificadores dos fatores de virulência de E. coli.

Como controles positivos para os diferentes genes pesquisados foi empregada amostra de E. coli enterotoxigênica e verotoxigênica pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de Sanidade Suína-VPSFMVZ-USP. Estas amostras foram previamente caracterizadas através de provas fenotipicas quanto à produção das toxinas STa, STb, LT e VT. As cepas de E. coli uropatogênicas foram cedidas pelo Laboratório de Ornitopatologia – VPT/FMVZ-USP sendo previamente caracterizadas quanto à presença destes fatores por métodos fenotípicos.

Extração do DNA bacteriano

Para extração do DNA genômico as amostras foram cultivadas em infusão cérebro coração (BHI), a 37º C por 18h. Uma alíquota de 200μL da cultura foi submetida à extração de DNA através do método baseado na utilização de isothiocianato de guanidina descrito por BOOM et al. (1990). As amostras de DNA foram mantidas a -20º C até sua utilização na PCR.

Reação em cadeia da polimerase

Os oligonucleotídeos iniciadores (primers) específicos para os genes codificadores dos fatores de virulência estudados foram sintetizados pela Life Technologies (Miami) e são apresentados no Tabela 1. Foram realizadas duas combinações de primers para pesquisa dos genes. O primeiro multiplex consistiu da pesquisa dos genes para STa, STb. LT e VT1 e VT2, o segundo agrupou todos os fatores relacionados a amostras uropatogênicas.

Tabela 1
“Primers” utilizados na PCR para amplificar fragmentos de diferentes genes para enterotoxinas (LT, STa e STb) e vero citotoxinas (VT1, VT2 e VT2e) e de diferentes genes para pap, sfa, afa, hly, aer e cnf.

Genes codificadores das toxinas	Nome do primer	Seqüência do oligonucleotídeo (5´→3´)	Tamanho do produto amplificado	Referência
LT	LTA-1	GGCGACAGATTATACCGTGC	696 bp	SCHULTSZ et al. (1994)
	LTA-2	CCGAATTCTGTTATATATGTC
STa	STI-1	TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG	147 bp	OLSVIK et al. (1993)
	STI-2	CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC
STb	STb-1	ATCGCATTTCTTCTTGCATC	172 bp	BLANCO et al. (1997)
	STb-2	GGGCGCCAAAGCATGCTCC
VT1	VT1-A	GAAGAGTCCGTGGGATTACG	130 bp	POLLARD et al. (1990)
	VT1-B	AGCGATGCAGCTATTAATAA
VT2 hb2	VT2-3	CCGTCAGGACTGTCTGAAAC	726 bp	WOODWARD et al. (1992)
	VT2-5	GAGTCTGACAGGCAACTGTC
Pap	pap-1	GCAACAGCAACGCTGGTTGCATCAT	336 bp	YAMAMOTO et al. (1995)
	pap-2	AGAGAGAGCCACTCTTATACGGACA
Hly	hly-1	AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT	1.177 bp	YAMAMOTO et al. (1995)
	hly-2	ACCATATAAGCGGTCATTCCCGTCA
Aer	aer-1	TACCGGATTGTCATATGCAGACCGT	602 bp	YAMAMOTO et al. (1995)
	aer-2	AATATCTTCCTCCAGTCCGGAGAAG
Cnf	cnf1	AAGATGGAGTTTCCTATGCAGGAG	498 bp	YAMAMOTO et al. (1995)
	cnf2	CATTCAGAGTCCTGCCCTCATTATT
Sfa	sfa-1	CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC	410 bp	YAMAMOTO et al. (1995)
	sfa-2	CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA
Afã	afa-1	GCTGGGCAGCAAACTGATAACCTC	750 bp	YAMAMOTO et al. (1995)
	afa-2	CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG

A solução de amplificação padrão de PCR consistiu de 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, gelatina 0,001% (w/v), 200μM de cada um dos desoxinucleosídeos trifosfatos, 20 pmoles da cada primer e 0,2 μL de Taq DNA polimerase, 5 μL da amostra de DNA e água até o volume final de 50 μL.

O programa utilizado para todas as reações consistiu de 1 ciclo a 95º C por 5min, 35 ciclos a 95º C por 1min, 55º C por 1min, 72º C por1 min e um ciclo final de 72º C por 5min (Termociclador).

A cada amplificação realizada, foi adicionado um controle positivo contendo o DNA da E. coli positiva para o gene pesquisado e um controle negativo contendo os reagentes sem DNA.

Detecção do produto amplificado

Os produtos de PCR (10μL) foram separados por eletroforese em gel de agarose 2%, a 4 volts/cm. Após a corrida, o gel foi corado com brometo de etídio (10μg/mL) e fotografado sob luz ultravioleta. Foi utilizado o marcador molecular 100 bp DNA ladder.

Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o teste de Fisher, empregando-se o software GraphPad Instat 3.

RESULTADOS

Exames microbiológicos de amostras de fezes de cães errantes

Em 196 (89,09%) das 220 amostras de fezes, foram isoladas 120 (54,55%) estirpes de E. coli em cultura pura e 76 (34,54%) estirpes em associação com outros agentes, dentre outros microrganismos (Tabela 2). A freqüência de isolamentos de E. coli (89,09% ou 196 amostras), considerando-se as amostras nas quais o agente foi isolado em cultura pura e também em associação com outros microrganismos, foi estatisticamente mais significante (P < 0,05) do que as freqüências de isolamentos de todos os outros microrganismos.

Tabela 2
Freqüência de ocorrência de microrganismos (bactérias e fungos) em cultura pura ou em associações, isolados a partir de 220 suabes retais de cães errantes.

Microrganismos isolados	N	%
E. coli	120	54,55*
E. coli / Proteus mirabilis	23	10,45
E. coli / Klebsiella pneumoniae	8	3,64
E. coli / Edwarsiela tarda	6	2,73
E. coli / Proteus mirabilis / Klebsiella pneumoniae	5	2,27
E. coli / Klebsiella pneumoniae / Staphylococcus sp.	4	1,82
E. coli / Proteus mirabilis / Staphylococcus sp.	4	1,82
E. coli / Staphylococcus sp.	4	1,82
E. coli / Klebsiella pneumoniae / Streptococcus sp.	2	0,91
E. coli / Proteus mirabilis / Candida albicans	2	0,91
E. coli / Proteus mirabilis / Edwarsiella tarda	2	0,91
E. coli / Pseudomonas sp.	2	0,91
E. coli / Candida albicans	1	0,45
E. coli / Candida albicans / Klebsiella oxytoca	1	0,45
E. coli / Klebsiella pneumoniae / Candida albicans	1	0,45
E. coli / Klebsiella pneumoniae / Staphylococcus sp. / Streptococcus sp.	1	0,45
E. coli / Proteus mirabilis / Klebsiella pneumoniae / Salmonella sp.	1	0,45
E. coli / Proteus mirabilis / Streptococcus sp.	1	0,45
E. coli / Proteus vulgaris / Citrobacter amanolaticus	1	0,45
E. coli / Providencia sp.	1	0,45
E. coli /Klebsiella oxytoca	1	0,45
E. coli / Proteus vulgaris	2	0,91
E. coli / Staphylococcus sp. / Proteus vulgaris	1	0,45
E. coli / Streptococcus sp.	1	0,45
E. coli / Streptococcus sp. / Citrobacter amalonaticus	1	0,45
E. coli / outros	76	34,54
Proteus mirabilis	6	2,73
Proteus mirabilis / Klebsiella pneumoniae	2	0,91
Salmonella sp.	2	0,91
Klebsiella pneumoniae / Providencia sp.	1	0,45
Proteus mirabilis / Edwarsiella tarda	1	0,45
Proteus mirabilis / Klebsiella pneumoniae / Staphylococcus sp.	1	0,45
Proteus mirabilis / Salmonella sp. / Streptococcus sp.	1	0,45

• ^*
  Verificou-se diferença estatisticamente (P < 0,05) significante entre a ocorrência de Escherichia coli e os outros microrganismos isolados.

Tabela 3
Freqüência de ocorrência de fatores de virulência em estirpes de E. coli em fezes de cães sem diarréia.

Fatores de Virulência	N	%
afa	16	8,16
sfa	54	27,55
pap	38	19,38
aer	66	33,67
cnf	31	15,81
hly	13	6,63
VT2	1	0,51

• Legenda: pili associados com pielonefrite (pap); aerobactina (aer); fator necrotizante citotóxico (cnf); fímbria S (sfa); adesina afimbrial I (afa); hemolisina (hly); verotoxina 2 (VT2).

Pesquisa dos genes codificadores dos fatores de virulência de E. coli utilizando PCR

De um total de 196 estirpes de E. coli isoladas, 123 (62,75%) apresentaram um ou mais dos fatores de virulência estudados. Destas estirpes, 16 (8,16%) foram positivas paraafa, 54 (27,55%) parasfa, 38 (19,38%) para pap, 66 (33,67%) paraaer, 31 (15,81%) paracnf, 13 (6,63%) para hly, 1 (0,51%) para VT2 e nenhuma das linhagens foi positiva para LT, STa e STb (Tabela 3). Do total de linhagens estudadas, 61 (49,59%) apresentou mais de um tipo de fator de virulência.

Os fatores de virulência aer e sfa apresentaram freqüência de ocorrência significantemente maior (P < 0,05) quando comparados com afa, cnf, hly, LT, STa, STb e VT. Por sua vez, pap apresentou freqüência de ocorrência significantemente maior (P < 0,05) que afa, hly, LT, STa, STb e VT.

DISCUSSÃO

O isolamento de estirpes de E.coli em uma freqüência de 89,09%, em cultura pura ou associação com outros microrganismos, demonstrou a elevada ocorrência deste microrganismo em fezes de cães hígidos, a qual é estatisticamente (P < 0,05) maior do que dos outros agentes isolados. Segundo SANCAK et al.(2004),

E. coli é um dos principais componentes da flora intestinal dos seres humanos e dos animais.

De acordo com BEUTIN (1999), estirpes de E. coli uropatogênicas isoladas da flora fecal e de infecções extra-intestinais de cães foram similares às linhagens uropatogênicas isoladas de humanos quanto aos seus atributos de virulência. Segundo este pesquisador, os cães devem apresentar um papel importante como reservatórios deste microrganismo para outros animais e para o homem, pois estudos indicam a transmissão de linhagens uropatogênicas fecais entre humanos e cães. Entretanto, pouco se conhece sobre o modo de transmissão dasE. coli uropatogênicas entre os diferentes hospedeiros mamíferos.

No presente estudo foram identificados fatores de virulência em 62,75% das linhagens avaliadas. Os fatores de virulência detectados com maior freqüência foram os genes aer (33,67%), sfa (27,55%) e pap (19,38%), os quais estão freqüentemente associados a casos de infecções urinárias e/ou genitais humanas.

KURAZONO et al. (2003) apontaram a presença de genes pap, sfa, afa, hly, aer e cnf em estirpes de E. coli isoladas de fezes normais e urina de cães. Por sua vez, FÉRIA et al. (2000) detectaram diferentes fatores de virulência em estirpes isoladas de infecção do trato urinário de humanos, cães e gatos, sendo que aerobactina (aer) apresentou a maior freqüência entre os gatos, hemolisina (hly) entre os humanos e pili associados a pielonefrite (pap) entre os cães, sugerindo uma adaptação de E. coli uropatogênica aos receptores celulares de cada hospedeiro. No presente estudo por sua vez, os fatores de virulência encontrados com maior freqüência foram aer, sfa e pap, embora também tenham sido verificados, em freqüência inferior, a hemolisina (hly) e fator citotóxico necrotizante (cnf).

YURI et al. (1998) verificaram a presença de fatores de virulência, incluindo pili associados com pielonefrite (pap), fímbria S (sfa), adesina afimbrial (afa I), alfa hemolisina (hly), fator citotóxico necrotizante 1 (cnf 1) e aerobactina (aer) em estirpes isoladas de urina de cães e gatos com UTI e fezes de animais hígidos. Estes fatores de virulência também são encontrados em estirpes isoladas de humanos. As linhagens isoladas de humanos e cães com UTI possuem maior quantidade de fatores de virulência do que aquelas encontradas em humanos e cães saudáveis.

Tendo em vista que Escherichia coli é um dos mais freqüentes agentes causais de infecções do trato urinário de humanos, tanto quanto de cães e gatos, é importante o seu conhecimento, particularmente quando se considera o convívio próximo entre estas espécies. No presente estudo, os fatores de virulência mais encontrados foram uropatogênicos (aer, sfa e pap) concordando com as observações de YURI et al. (1998), embora os animais estudados fossem cães errantes e não apresentassem sinais clínicos de UTI. LOW et al. (1988) estudaram E. coli isoladas do reto e do trato urinário de cães com infecção urinária e concluíram que os isolados de urina poderiam ser de origem intestinal. Em mulheres, a microbiota fecal é reconhecida como reservatório de microrganismos potencialmente causadores de infecções bacterianas do trato urinário (WADAS, 1996).

Estudo realizado por JOHNSON et al. (2001) apontou semelhanças entre amostras de ExPEC (E. coli Patogênica Extraintestinal) humana e canina com relação aos fatores de virulência, baseado no polimorfismo genético, mas não comprovou a transmissão cruzada entre as espécies ou excluiu a possibilidade de humanos e caninos adquirirem o mesmo tipo de E. coli de origem externa comum.

O cão errante poderia estar contaminando o meio ambiente e expondo o ser humano a enterites por E. coli e até mesmo outras manifestações de colibacilose, através do risco de contaminação de mananciais ou pelo contato direto que pessoas poderiam vir a ter com estes animais os quais, desta forma, atuariam como fontes de infecção na ocorrência de colibacilose humana (BLANCO et al., 1997; KRUTH, 1998; FARMER III, 1999).

Os cães errantes aparentemente sadios, sem sintomas de colibacilose, poderiam estar participando da cadeia epidemiológica como reservatórios de E. coli (microrganismo isolado com maior freqüência das fezes destes animais) de natureza uropatogênica ao homem, pois os genes detectados em maior frequência foram aer, sfa e pap, presentes em linhagens associadas a infecções extraintestinais, mais especificamente infecções urinárias. Deve-se proceder à realização de mais estudos que visem à identificação do modo como pode ocorrer a transmissão deste agente entre cães e humanos, o que possibilitaria o desenvolvimento de mecanismos de prevenção da doença.

REFERÊNCIAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Fev 2022
• Data do Fascículo
  Oct-Dec 2006

Histórico

• Recebido
  24 Maio 2006
• Aceito
  29 Out 2006