BACTÉRIAS DO GÊNERO AEROMONAS NO FLUXOGRAMA DE BENEFICIAMENTO DO LEITE TIPO A E SEU COMPORTAMENTO FRENTE À AÇÃO DE ANTIMICROBIANOS

BACTERIA OF AEROMONAS GENUS IN THE TYPE “A” MILK PROCESSING FLOW AND THEIR BEHAVIOR IN REGARD TO ANTIMICROBIALS

RESUMO

Objetivando verificar os possíveis pontos de contaminação e disseminação de bactérias do gênero Aeromonas, foram analisadas amostras de leite colhidas em diferentes pontos do fluxograma de beneficiamento em uma granja de leite tipo A. De 80 amostras analisadas, Aeromonas spp. foram isoladas em 37 (46,25%) delas. Foram colhidas 20 amostras de cada ponto da linha de produção e revelaram-se positivas no isolamento, 90% (18/20) das amostras de leite cru, 30% (6/ 20) das de leite da saída do pasteurizador, 40% (8/20) das de leite do tanque de abastecimento da máquina de empacotar e 25% (5/20) das amostras do leite pronto para consumo. Dentre as espécies foram identificadas Aeromonas sobria em 40,54% das amostras, Aeromonas hydrophila e Aeromonas caviae em 21,62% delas, Aeromonas veronii em 10,81% e Aeromonas schubertii em 2,7%. Das cepas isoladas, 37 foram submetidas a testes de sensibilidade a antimicrobianos. Destas, 100% foram resistentes à ampicilina, 75,67% à cefalotina, 64,86% à cefoxitina e 48,64% ao aztreonam. As drogas as quais as cepas mostraram-se menos resistentes foram, cloranfenicol, netilmicina, amicacina, gentamicina, tetraciclina e tobramicina. Os resultados obtidos demonstram que bactérias do gênero Aeromonas resistentes a vários antimicrobianos podem estar presentes no leite tipo A, o que faz com que este produto possa determinar risco à saúde da população consumidora, e que deve servir de alerta aos serviços de saúde pública.

PALAVRAS-CHAVE
Aeromonas spp.; leite pasteurizado; antimicrobianos

ABSTRACT

Milk samples obtained from different points of the processing flow at a type “A” milk farm were analysed with the objective to verify possible points of Aeromonas genus bacteria contamination and dissemination. In 80 samples analysed, Aeromonas spp. were isolated in 37 (46.25%) of them. From each point of the processing flow 20 samples were obtained. The results showed that 90% (18/20) of raw milk samples, 30% (6/20) of the pasteurizer-exit samples, 40% (8/20) of the packing-machine-tank samples and 25% (5/20) of ready-to-drink milk samples were positive on isolation. The breakdown by species of the bacteria isolated was: Aeromonas sobria in 40.54% of the samples, Aeromonas hydrophila and Aeromonas caviae in 21.62%, Aeromonas veronii in 10.81%, and Aeromonas schubertii in 2.7%. Of the isolated strains, 37 were submitted to antimicrobial susceptibility testing, which revealed that 100% were resistant to ampicillin, 75.64% to cephalotin, 64.86% to cefoxitin and 48.64% to aztreonam. The strains presented less resistance to chloramphenicol, netilmicin, amikacin, gentamicin, tetracycline and tobramycin. The results demonstrate that Aeromonas spp. bacteria resistant to several antimicrobials may be present in type “A” milk, indicating that this product might be a risk to consumer health, and this data should be an alert to public health services.

KEY WORDS
Aeromonas spp.; pasteurized milk; antimicrobials

INTRODUÇÃO

Nos anos recentes, surtos de doenças bacterianas de origem alimentar têm sido reportados por todo mundo, alguns causados por agentes chamados clássicos, os quais têm patogenia e epidemiologia bem conhecidas, como o Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens e salmonelas, mas a grande maioria determinada por bactérias que não são comumente pesquisadas durante investigações de surtos. Dentre essas bactérias estão as aeromonas móveis (HANDFIELD et al., 1996).

Aeromonas spp. são microrganismos de ocorrência amplamente difundida no meio ambiente (CUNLIFFE & ADCOCK, 1989), sendo membros importantes da microbiota normal da água (PALUMBO et al., 1996), com relatos de isolamento a partir de água utilizada para os mais diversos fins (ROSSI JÚNIOR et al., 1996; GAVRIEL et al., 1998). A água, por sua vez, exerce papel de extrema importância como fonte de contaminação dos alimentos de origem animal (HÄNNINEN& SIITONEN, 1995; ROSSI JÚNIOR et al., 2000).

O mecanismo de patogenicidade das aeromonas é considerado multifatorial, sendo sua ação classificada como de nível não intestinal e gastrentérica (KO & CHUANG, 1995). Como fatores de virulência são atribuídos ao gênero Aeromonas a produção de enterotoxinas, citotoxinas, hemolisinas e proteases, além de grande capacidade de aderência e invasão em células da mucosa intestinal (SINGH & SANYAL, 1992; KÜHN et al., 1997; MARTINS et al., 2002).

Dentre os alimentos de origem animal Aeromonas spp. já foi isolado de carnes cruas, peixes, frutos do mar, aves, ovos, leite e derivados (ABEYTA JÚNIOR et al., 1986; KIROV et al., 1993; PIN et al., 1994; COSTA & ROSSI JÚNIOR, 2002; BULHÕES & ROSSI JÚNIOR, 2002; NOCITI et al., 1999; FREITAS et al., 1993). Particularmente, em relação ao leite bovino, a maioria dos trabalhos prende-se ao estudo do leite cru (KIROV et al., 1993; PRABHA et al., 1996; MELAS et al., 1999) ou no final do fluxograma de produção, já pasteurizado e pronto para a comercialização (FREITAS et al., 1993; ENEROTH et al., 2000; CRAVEN & MACAULEY, 1992).

Em vista do exposto, foi realizado o presente estudo com o objetivo de verificar a presença de bactérias do gênero Aeromonas em diferentes etapas do fluxograma de beneficiamento do leite tipo A e verificar o comportamento dos isolados frente à ação de antimicrobianos.

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi desenvolvido analisando amostras de leite ao longo do processo de beneficiamento em uma granja de leite tipo A localizada no interior do Estado de São Paulo. Foram analisadas amostras de leite cru da saída do pasteurizador, do tanque de abastecimento da máquina de envase e do leite empacotado pronto para a comercialização. No total foram analisadas 80 amostras, sendo 20 de cada um dos pontos estudados.

As amostras do leite do tanque de leite cru, do pasteurizador e do tanque de abastecimento da máquina de envase foram colhidas em frascos de vidro esterilizados, de 500 mL de capacidade, através de torneiras para a tomada de amostras existentes naqueles pontos. Os frascos, bem como o leite pasteurizado empacotado, foram acondicionados em caixas de material isotérmico com blocos de gelo e imediatamente transportados ao laboratório onde foram realizadas as análises.

O enriquecimento seletivo das amostras foi realizado após homogeneização manual, tomando-se 10 mL de cada uma delas e transferinda-os para frascos tipo Erlenmeyer contendo 100 mL de caldo tripticasesoja (TSB) acrescido de ampicilina na concentração de 30 mg/L (ABEYTA JUNIOR et al., 1990). Após incubação a 28º C por 24h, as culturas foram semeadas em placas contendo ágar vermelho de fenol-amidoampicilina (PALUMBO et al., 1985; MAJEED et al., 1990) e ágar dextrina-ampicilina (HAVELAAR & VONK, 1988), as quais foram incubadas a 28º C por 24h e examinadas quanto à presença de colônias grandes, de cor amarela, rodeadas por halo decorrente da hidrólise do amido ou da dextrina, respectivamente, características do gênero Aeromonas.

Colônias com características sugestivas foram

Semeadas em tubos com ágar tripticase-soja (TSA) inclinado e, constatada a presença de culturas puras, elas foram semeadas em ágar tríplice-açúcar-ferro (TSI) e incubadas a 28º C por 24h (SAAD et al., 1995). As culturas que apresentavam reação ácida tanto na base como no bisel, com ou sem formação de gás, foram submetidas às provas da motilidade, oxidase, catalase e resistência ao agente vibriostático O/129 (fosfato de 2,4-diamino-6,7-diisopropilpteridine), em esquema de identificação adotado por POPOFF (1984) e NEVES et al. (1990). A caracterização das espécies foi realizada seguindo o esquema dePOPOFF (1984) acrescido de outras provas recomendadas por BUCHANAN & PALUMBO (1985) e ABEYTA JÚNIOR et al. (1990). As culturas que deram reação distinta da classificação de POPOFF (1984) em apenas uma prova bioquímica foram designadas como atípicas, conforme adotado por MAJEED et al. (1990) e KIROV et al. (1993).

As espécies caracterizadas foram submetidas a testes de sensibilidade a antimicrobianos através da técnica de disco de difusão (BAUER et al., 1966; NCCLS, 2000). Utilizou-se polidiscos (Laborclin – LB6) com os princípios ativos: tetraciclina (30 µg), cloranfenicol (30 µg), netilmicina (30 µg), aztreonam (30 µg), gentamicina (10 µg), amicacina (30 µg), sulfazotrim (25 µg), tobramicina (10 µg), ampicilina (1 0µg), cefalotina (30 µg), cefoxitina (30 µg) e cefotaxima (30 µg).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os dados apresentados na Tabela 1 demonstram que, do total de 80 amostras analisadas, 37 (46,25%) revelaram-se positivas para a presença de bactérias do gênero Aeromonas, sendo que 18 (90%) eram de leite cru, 6 (30%) do leite colhido na saída do pasteurizador, 8 (40%) do leite do tanque de abastecimento da máquina de envase e 5 (25%) amostras do leite empacotado pronto para o consumo. Nestas amostras foram identificadas as espécies A. hydrophila, A. sobria, A. caviae, A. veronii e A. schubertii, além de vários isolados considerados como cepas atípicas.

Tabela 1
Número de amostras positivas para cada uma das espécies de bactérias do gênero Aeromonas identificadas, em relação ao total analisado para cada um dos tipos de amostras colhidas em diferentes pontos do fluxograma de beneficiamento do leite tipo A.

Tipo de amostra1	Total de amostras positivas/analisadas	Espécies identificadas no de amostras (%)
		A. hydrophila	A. sobria	A. caviae	A. veronii	A. schubertii	atípicas
Total	37/80	8 (21,62)	15 (40,54)	8 (21,62)	4 (10,81)	1 (2,7)	11 (29,73)
LC	18/20	5 (25)2	6 (30)	5 (25)	4 (20)	1 (5)	5 (25)
LSP	6/20	0 (0)	3 (15)	0 (0)	0 (0)	0 (0)	3 (15)
LTE	8/20	3 (15)	2 (10)	2 (10)	0 (0)	0 (0)	3 (15)
LE	5/20	0 (0)	4 (20)	1 (5)	0 (0)	0 (0)	0 (0)

• ¹
  LC= leite cru; LSP= leite na saída do pasteurizador; LTE= leite do tanque da máquina de empacotar; LE= leite envasado.
• ²
  Número de amostras em que a espécie foi isolada (porcentagem em relação ao total de amostras analisadas para cada tipo).

A presença de Aeromonas sp. no leite cru tem sido demonstrada por vários autores, em diversas partes do mundo, com percentuais de amostras positivas bem inferiores aos 90% encontrados no presente estudo. SAAD (1991) obteve 38% de amostras positivas colhidas em Assiut City, identificando a espécie A. hydrophila. PIN et al. (1994) na Espanha e URAZ & ÇITAK (1998) na Turquia encontraram percentuais de 20% e 0,5%, respectivamente, também com predominância dentre os isolados da espécie A. hydrophila. KIROV et al. (1993), no entanto, encontraram positividade em 60% das amostras e identificaram as espécies A. sobria, A. hydrophila e A. caviae, além de cepas atípicas. PRABHA et al. (1996) identificaram as mesmas espécies na Índia, e 33,82% de amostras positivas. Os autores citados são unânimes em afirmar que a origem desses microrganismos estaria relacionada a deficiências nos procedimentos de higiene na obtenção do leite. Com base nessas afirmações, e em vista dos resultados obtidos, pode-se afirmar que o percentual de 90% de amostras positivas verificado no presente estudo é um forte indicativo de falhas no processo de obtenção.

Considerando-se ainda os dados da Tabela 1, referentes ao leite recém pasteurizado colhido na saída do pasteurizador e ao leite do tanque de abastecimento da máquina de empacotar, que não deveriam encontrar-se contaminados, pois as Aeromonas spp são sensíveis ao calor e destruídas durante a pasteurização, verifica-se que foram encontradas 6 (30%) amostras do primeiro produto e 8 (40%) do segundo, positivas para o gênero Aeromonas. ENEROTH et al. (1998) analisando os pontos críticos de contaminação no fluxograma de laticínios na Suécia e Noruega, não verificaram contaminação do leite na saída do pasteurizador e tampouco no leite do tanque de abastecimento da máquina de envase.

Um fato que pode explicar a presença de aeromonas no leite pasteurizado é que as tubulações, o tanque de abastecimento da máquina de envase e a própria máquina de envase podem conter resíduos de água antes da passagem do leite. Sabe-se que estes resíduos podem abrigar um número considerável de microrganismos e os equipamentos, por estarem constantemente úmidos durante o dia de produção, se não forem apropriadamente limpos e secos no fim do dia podem permitir a formação de biofilmes, em decorrência da multiplicação dos microrganismos nas superfícies. ISONHOOD & DRAKE (2002) afirmam que as aeromonas podem formar biofilmes e que estes contribuem no aumento da resistência aos tratamentos bactericidas normais.

No que diz respeito às amostras de leite pasteurizado prontas para consumo, o percentual de positividade encontrado, de 25% (5/20), foi superior ao verificado por KIROV et al. (1993), que obtiveram 4% de amostras positivas. Coincidentemente ao encontrado no presente estudo, a espécie que prevaleceu no leite pasteurizado foi a A. sobria, em cujas cepas os autores verificaram capacidade de produzir fatores de virulência como enterotoxinas, hemolisinas, citotoxinas e adesinas, caracterizando risco à saúde pública.

Os dados da Tabela 1 permitem verificar também que a Aeromonas caviae foi a espécie que determinou o segundo maior número de amostras positivas, 8 (21,62%), isoladas em todos os tipos de amostras, exceto do leite recém pasteurizado colhido na saída do pasteurizador. O isolamento de A. caviae em leite tipo A pronto para consumo, que é considerado um leite de melhor qualidade, é outro fator que deve ser levado em consideração pelos serviços de saúde pública, pois o leite é um alimento comum na dieta de muitas pessoas, incluindo grupos de alto risco, mais susceptíveis às infecções alimentares, e já foi observado que aquela espécie, ainda que em menor grau, também produz fatores de virulência, conforme descrevem CAHILL (1990) e HAVELAAR et al. (1992). Segundo REINA et al. (1991), a espécie A. caviae foi encontrada como principal enteropatógeno em casos de diarréia infantil em crianças submetidas a aleitamento artificial em Palma de Mallorca (Balares).

Tabela 2
Distribuição das cepas de Aeromonas hydrophila, A. sobria, A. caviae, A. veronii e atípicas, isoladas em diferentes pontos do fluxograma de beneficiamento do leite tipo A, resistentes a agentes antimicrobianos testados.

Antimicrobiano	No de cepas resistentes/testadas(%)					Total de cepas resistentes (%)
	A. hydrophila	A. sobria	A. caviae	A. veronii	atípicas
Amicacina	0/12 (0%)	2/8 (25)	0/8 (0)	0/4 (0)	1/5 (20)	3 (8,11)1
Ampicilina	12/12 (100)	8/8 (100)	8/8 (100)	4/4 (100)	5/5 (100)	37 (100)
Aztreonam	7/12 (58,33)	4/8 (50)	4/8 (50)	0/4 (0)	3/5 (60)	18 (48,64)
Cefalotina	8/12 (66,66)	7/8 (87,5)	4/8 (50)	4/4 (100)	5/5 (100)	28 (75,67)
Cefotaxima	1/12 (8,33)	2/8 (25)	2/8 (25)	0/4 (0)	4/5 (80)	9 (24,32)
Cefoxitina	6/12 (50)	7/8 (87)	5/8 (62,5)	1/4 (25)	5/5 (100)	24 (64,86)
Cloranfenicol	1/12 (8,33)	2/8 (25)	1/8 (12,5)	1/4 (25)	3/5 (60)	8 (21,62)
Gentamicina	1/12 (8,33)	2/8 (25)	3/8 (37,5)	1/4 (25)	2/5 (40)	9 (24,32)
Netilmicina	0/12 (0)	2/8 (25)	1/8 (12,5)	0/4 (0)	3/5 (60)	6 (16,21)
Sulfazotrim	3/12 (25)	3/8 (37,5)	4/8 (50)	0/4 (0)	5/5 (100)	15 (40,54)
Tetraciclina	3/12 (25)	1/8 (12,5)	1/8 (12,5)	1/4 (25)	4/5 (80)	10 (27,02)
Tobramicina	2/12 (16,66)	2/8 (25)	0/8 (0)	1/4 (25)	4/5 (80)	9 (24,32)

• ¹
  Porcentagem em relação ao total de cepas testadas

Analisando-se os dados da Tabela 2 verifica-se que o maior percentual de cepas resistentes, sem considerar a ampicilina, foi verificado frente a cefalotina (75,67%), cefoxitina (64,86%) e aztreonam (48,64%). Para os demais princípios ativos testados os percentuais de cepas resistentes estiveram abaixo de 40%. KO et al. (1998) encontraram resultados semelhantes para cefalotina e cefoxitina em Tainan (Taiwan), ao analisarem cepas de A. hydrophila isoladas de paciente com infecção. URRIZA et al. (2000), analisando cepas isoladas de água de 2 rios europeus encontraram baixa resistência à gentamicina (1%) e à tetraciclina (14%) e alta resistência à gentamicina (93%) o que difere do presente estudo. NOCITI et al. (1999) verificaram alto percentual de resistência a vários antimicrobianos entre cepas isoladas de carcaças de frango, concluindo pelo risco de infecções por microrganismos de alta resistência a partir do consumo daqueles produtos. Os autores citados são unânimes em afirmar que a emergência de resistência entre as Aeromonas spp. pode ser acelerada pelo mau uso dos antibióticos na terapêutica clínica, e também pela adição generalizada de subdoses em rações animais.

Considerando que as bactérias do gênero Aeromonas possuem capacidade de sobreviver e multiplicar em alimentos mantidos sob refrigeração, como o leite, e que muitas cepas são capazes de produzir toxinas, sua presença em leite pasteurizado, particularmente no tipo A, pode conferir a este produto um sério risco à saúde, principalmente, para o segmento da população considerado de alto risco, como crianças, idosos e pacientes imunodeprimidos.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Jan 2022
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2006

Histórico

• Recebido
  24 Maio 2006
• Aceito
  23 Ago 2006