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Resistência de genótipos de algodoeiro (Gossypium hirsutum L.) a Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae)

Resistance of cotton genotypes (Gossypium hirsutum L.) to Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae)

Resumos

Avaliou-se a resistência de onze genótipos de algodoeiro a A. argillacea, considerando-se aspectos biológicos das fases jovem e adulta deste inseto. Os ensaios foram realizados em câmara climatizada mantida a 25±1ºC, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12h. A duração do primeiro ínstar foi significativamente maior quando lagartas de A. argillacea alimentaram-se dos genótipos CNPA 94/139 e CNPA Precoce 1. Durante o segundo ínstar, as lagartas que se alimentaram do genótipo CNPA 94/139 apresentaram período significativamente menor. O intervalo de variação para a duração do terceiro e quarto ínstares foram, respectivamente, de 1,8 a 2,1 e 1,9 a 2,2 dias. As lagartas de A. argillacea que se alimentaram da cultivar CNPA Precoce 2 apresentaram uma duração do quinto ínstar de 4,9 dias. O peso médio das lagartas foi menor quando alimentadas com o genótipo CNPA Precoce 1. Os períodos pré-pupal e pupal apresentaram intervalo de variação de 1,0 a 1,9 e 7,8 a 8,7 dias, respectivamente. O intervalo de variação para a fase larval foi de 13,1 a 14,7 dias. Os genótipos CNPA Precoce 1, Precoce 2, 9211-18 e 9211-21 promoveram uma duração significativamente maior para o período larva-adulto. Durante as fases larval e larva-adulto, lagartas que consumiram folhas dos genótipos CNPA 9211-41 e CNPA 9211-31 apresentaram menor percentual de sobrevivência, respectivamente 64,2 e 60,7; 62,1 e 58,6%. Fêmeas de A. argillacea originadas de lagartas alimentadas com o genótipo CNPA Precoce 1 apresentaram menor período de oviposição e menor capacidade de postura. Concluiu-se que os genótipos CNPA 9211-31, CNPA Precoce 1, CNPA Precoce 2 e CNPA 9211-41 apresentaram resistência do tipo antibiose e/ou não-preferência para alimentação, enquanto que GL2 GL3 e CNPA 9211-29 foram suscetíveis ao curuquerê.

resistência de plantas; curuquerê do algodoeiro; biologia


Eleven cotton genotypes were evaluated for resistance to A. argillacea, considering biological aspects of young and adult phases of this insect. The trials were conducted in climatic chambers at 25±1ºC under relative humidity of 70±10% and photophase of 12h. The first instar was significantly larger when A. argillacea fed on CNPA 94/139 and CNPA Precoce 1 genotypes. During the second instar, the cotton leafworm fed CNPA 94/139 genotype presented significantly shorter period. The variation interval for the third and fourth instars duration was, respectively, 1.8 to 2.1 and 1.9 to 2.2 days. The cotton leafworm fed CNPA Precoce 2 presented fifth instar duration of 4.9 days. The leafworms average weight at 5 days of age was lower when fed CNPA Precoce 1 genotype. The pre-pupal and pupal periods ranged from 1.0 to 1.9 and 7.8 to 8.7 days, respectively. The interval variation for the larval phase was 13.1 to 14.7 days. CNPA Precoce 1, CNPA Precoce 2, CNPA 9211-18 and CNPA 9211-21 genotypes promoted significantly higher duration larva-adult period. During the larval and larva to adult periods, the leafworms fed CNPA 9211-41 and CNPA 9211-31 genotypes leaves presented lower survival rates, 64.2 and 60.7; 62.1 and 58.6% respectively. A. argillacea females originated from leafworms fed CNPA Precoce 1 genotype showed shorter oviposition period and lower number of eggs laid. It was concluded that CNPA 9211-31, CNPA Precoce 1, CNPA Precoce 2 and CNPA 9211-41 genotypes showed antibiosis and/or feeding nonpreference resistance, while GL2 GL3 and CNPA 9211-29 were susceptible to cotton leafworm.

Insecta; host plant resistance; cotton leafworm; biology; Insecta


PROTEÇÃO DE PLANTAS

Resistência de Genótipos de Algodoeiro (Gossypium hirsutum L.) a Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae)

TEREZINHA M. DOS SANTOS E ARLINDO L. BOIÇA JÚNIOR

Departamento de Fitossanidade, FCAV-UNESP, Via de Acesso Professor Paulo Donato Castellane, s/n, 14884-900, Jaboticabal - SP.

Resistance of Cotton Genotypes (Gossypium hirsutum L.) to Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae)

ABSTRACT – Eleven cotton genotypes were evaluated for resistance to A. argillacea, considering biological aspects of young and adult phases of this insect. The trials were conducted in climatic chambers at 25±1ºC under relative humidity of 70±10% and photophase of 12h. The first instar was significantly larger when A. argillacea fed on CNPA 94/139 and CNPA Precoce 1 genotypes. During the second instar, the cotton leafworm fed CNPA 94/139 genotype presented significantly shorter period. The variation interval for the third and fourth instars duration was, respectively, 1.8 to 2.1 and 1.9 to 2.2 days. The cotton leafworm fed CNPA Precoce 2 presented fifth instar duration of 4.9 days. The leafworms average weight at 5 days of age was lower when fed CNPA Precoce 1 genotype. The pre-pupal and pupal periods ranged from 1.0 to 1.9 and 7.8 to 8.7 days, respectively. The interval variation for the larval phase was 13.1 to 14.7 days. CNPA Precoce 1, CNPA Precoce 2, CNPA 9211-18 and CNPA 9211-21 genotypes promoted significantly higher duration larva-adult period. During the larval and larva to adult periods, the leafworms fed CNPA 9211-41 and CNPA 9211-31 genotypes leaves presented lower survival rates, 64.2 and 60.7; 62.1 and 58.6% respectively. A. argillacea females originated from leafworms fed CNPA Precoce 1 genotype showed shorter oviposition period and lower number of eggs laid. It was concluded that CNPA 9211-31, CNPA Precoce 1, CNPA Precoce 2 and CNPA 9211-41 genotypes showed antibiosis and/or feeding nonpreference resistance, while GL2 GL3 and CNPA 9211-29 were susceptible to cotton leafworm.

KEY WORDS: Insecta, host plant resistance, cotton leafworm, biology.

RESUMO – Avaliou-se a resistência de onze genótipos de algodoeiro a A. argillacea, considerando-se aspectos biológicos das fases jovem e adulta deste inseto. Os ensaios foram realizados em câmara climatizada mantida a 25±1ºC, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12h. A duração do primeiro ínstar foi significativamente maior quando lagartas de A. argillacea alimentaram-se dos genótipos CNPA 94/139 e CNPA Precoce 1. Durante o segundo ínstar, as lagartas que se alimentaram do genótipo CNPA 94/139 apresentaram período significativamente menor. O intervalo de variação para a duração do terceiro e quarto ínstares foram, respectivamente, de 1,8 a 2,1 e 1,9 a 2,2 dias. As lagartas de A. argillacea que se alimentaram da cultivar CNPA Precoce 2 apresentaram uma duração do quinto ínstar de 4,9 dias. O peso médio das lagartas foi menor quando alimentadas com o genótipo CNPA Precoce 1. Os períodos pré-pupal e pupal apresentaram intervalo de variação de 1,0 a 1,9 e 7,8 a 8,7 dias, respectivamente. O intervalo de variação para a fase larval foi de 13,1 a 14,7 dias. Os genótipos CNPA Precoce 1, Precoce 2, 9211-18 e 9211-21 promoveram uma duração significativamente maior para o período larva-adulto. Durante as fases larval e larva-adulto, lagartas que consumiram folhas dos genótipos CNPA 9211-41 e CNPA 9211-31 apresentaram menor percentual de sobrevivência, respectivamente 64,2 e 60,7; 62,1 e 58,6%. Fêmeas de A. argillacea originadas de lagartas alimentadas com o genótipo CNPA Precoce 1 apresentaram menor período de oviposição e menor capacidade de postura. Concluiu-se que os genótipos CNPA 9211-31, CNPA Precoce 1, CNPA Precoce 2 e CNPA 9211-41 apresentaram resistência do tipo antibiose e/ou não-preferência para alimentação, enquanto que GL2 GL3 e CNPA 9211-29 foram suscetíveis ao curuquerê.

PALAVRAS-CHAVE: Insecta, resistência de plantas, curuquerê do algodoeiro, biologia.

Os artrópodes pragas constituem o principal fator de redução da produtividade e qualidade do algodoeiro, destacando-se entre eles o curuquerê, Alabama argillacea (Hübner). Na maioria dos sistemas de produção de algodão no mundo, os inseticidas químicos constituem o principal meio de controle de insetos (Luttrell et al. 1994). A utilização freqüente desses produtos tem apresentado várias desvantagens como a resistência dos insetos-pragas aos inseticidas; efeitos adversos sobre organismos não alvos de controle; resíduos e riscos diretos aos usuários de tais produtos; ressurgência de pragas secundárias, como ocorrido com a lagarta das maçãs (Heliothis virescens Fabr.) e o pulgão-do-algodoeiro (Aphis gossypii Glover) em algumas regiões do Brasil (Ramalho et al. 1995).

Visando amenizar esses riscos no Brasil, foram estabelecidos programas de manejo integrado de pragas do algodoeiro no início de 1980 (Ramalho 1994). As mais recentes revisões sobre essa técnica, sugerem que programas futuros de controle de pragas nesta cultura dependerão muito menos de inseticidas químicos e deste modo, as oportunidades de expansão para a resistência de plantas, controle biológico e outros métodos de controle serão maiores (Luttrell 1994).

A utilização de cultivares de algodoeiro resistentes a pragas como estratégia de manejo integrado, tem despertado grande interesse dos pesquisadores (Wilson et al. 1986). Várias características da planta de algodão afetam o estabelecimento das pragas, como a pilosidade das folhas (Calhoun et al. 1994, Harris et al. 1994), a presença ou ausência de nectários extra-florais (Flint et al. 1992, Smith 1992), tipos de brácteas e folhas (Wilson & George 1982, Brook et al. 1992, Maredia et al. 1993) e teor de aleloquímicos nas várias partes da planta (Parrott et al. 1983, Mohan et al. 1996). Os prováveis mecanismos envolvidos na resistência do algodoeiro ao curuquerê são a não-preferência e/ou antibiose (Bleicher 1982, Montandon et al. 1986, Lara 1991, Lara et al. 1999).

Para a implementação de cultivares resistentes dentro de programas de produção de algodão, torna-se importante o conhecimento dos efeitos dessas cultivares sobre a biologia do inseto-praga (Mullins & Pieters 1982). Desse modo, esta pesquisa teve por objetivo avaliar a resistência de genótipos de algodoeiro a A. argillacea, relacionando o efeito destes sobre a biologia do inseto.

Material e Métodos

A pesquisa foi desenvolvida no Departamento de Fitossanidade da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Jaboticabal -SP, em câmaras climatizadas a 25 ± 1ºC, 70 ± 10% de UR e 12 horas de fotofase. Os genótipos de algodão utilizados foram: CNPA Precoce 1, CNPA Precoce 2, GL2 GL3, CNPA 9211-21, CNPA 9211-41, CNPA 94/139, CNPA 9211-18, CNPA 9211-20, CNPA 9211-31, CNPA 9211-29 e CNPA 9211-25, obtidos junto à EMBRAPA - Algodão, Campina Grande - PB.

Criação de Manutenção de A. argillacea. Os adultos do curuquerê foram mantidos em gaiolas de PVC de 20 cm de altura e 19,5 cm de diâmetro, sendo a extremidade inferior vedada com polietileno e a superior com tela de náilon. Internamente as gaiolas foram revestidas com papel branco para a obtenção das posturas. Foram mantidos dez casais por gaiola, alimentados com solução de mel e água (1:1) embebida em algodão hidrófilo acondicionado em tampa plástica. Diariamente, os papéis com posturas foram retirados e transferidos para gaiolas iguais àquelas utilizadas para os adultos. Próximo à eclosão das lagartas, foram oferecidas folhas de algodoeiro cultivar IAC 22, retiradas do terço superior das plantas, lavadas em solução de hipoclorito de sódio a 0,15% e enxaguadas com água. Posteriormente retirou-se o excesso de umidade das folhas e seus pecíolos foram acondicionados em vidros contendo água, objetivando a conservação das folhas. Para as lagartas de primeiro e segundo ínstares, as folhas foram trocadas a cada dois dias, para as lagartas de ínstares mais avançados, devido ao maior consumo de folhas, estas foram trocadas diariamente. As pupas foram separadas por sexo e mantidas em tubos de PVC até a emergência dos adultos.

Aspectos Biológicos de A. argillacea em Diferentes Genótipos de Algodoeiro. Lagartas de A. argillacea recém-eclodidas provenientes da geração F2 foram individualizadas em tubos de vidro de 2,5 x 8,5 cm vedados com filme de polietileno (Rolopac ®). As lagartas foram alimentadas com seções de folhas de algodoeiro dos diferentes genótipos com 80 dias após a emergência. Estas foram mantidas nestes recipientes até a fase de pupa, quando então foram separadas por sexo.

Os seguintes parâmetros foram avaliados: a) fase larval: número e duração de cada ínstar; duração e viabilidade do estágio larval e peso de lagartas aos cinco dias de idade; b) fase de pré-pupa: duração e viabilidade; c) fase de pupa: duração, viabilidade e razão sexual; d) fase larva-adulto: duração e viabilidade. Na avaliação das fases jovens utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado, com 11 tratamentos constituídos pelos genótipos de algodoeiro, cada um com 30 repetições, totalizando 330 parcelas.

As pupas foram separadas em casais e mantidas em gaiolas de PVC de 10 cm de altura x 10 cm de diâmetro até a emergência dos adultos. A extremidade inferior destas gaiolas foram vedadas com placas de Petri e forradas com discos de papel filtro, a extremidade superior com voil e as laterais revestidas internamente com papel filtro para obtenção das posturas. Cada parcela foi constituída por um casal num total de 10 repetições cada genótipo. Os adultos foram alimentados com solução de mel e água (1:1). Foram avaliados os períodos de pré-oviposição, oviposição, pós-oviposição, capacidade total de oviposição e a longevidade de machos e fêmeas.

Em ambos os experimentos, os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Resultados e Discussão

Fase Larval. As lagartas de A. argillacea apresentaram cinco ínstares (Tabela 1), concordando com os valores relatados por Johnson (1984) à temperatura de 27ºC. No entanto, Kasten Júnior & Parra (1984) observaram seis ínstares a 25ºC.

De acordo com Kasten Júnior & Parra (1984) o número de ínstares do curuquerê-do-algodoeiro pode ser alterado pela temperatura.

A duração dos ínstares (exceto o quarto) foi influenciada pelos genótipos de algodoeiro oferecidos como alimento às lagartas de A. argillacea. A duração do primeiro ínstar foi significativamente maior quando as lagartas se alimentaram dos genótipos CNPA 94/139 e CNPA Precoce 1 (3,6 dias), quando comparada com os demais genótipos. Lagartas de primeiro ínstar alimentadas com folhas do genótipo CNPA 9211-31 apresentou 79,3% de sobrevivência enquanto que o valor deste parâmetro para aquelas alimentadas com CNPA 9211-29 foi de 96,4% (Tabela 1).

Durante o segundo ínstar, as lagartas que se alimentaram do genótipo CNPA 94/139 apresentaram um período significativamente menor, 1,7 dias para a duração deste estágio, enquanto aquelas que se alimentaram do genótipo CNPA 9211-21 apresentaram período mais longo (2,1 dias). A sobrevivência do curuquerê neste ínstar foi alta, com valores variando de 91,3 a 100% (Tabela 1).

O intervalo de variação para a duração do terceiro ínstar do curuquerê do algodoeiro foi de 1,7 a 2,1 dias (Tabela 1). As lagartas que consumiram folhas do genótipo CNPA Precoce 1 apresentaram um período significativamente menor (1,7 dias) para esse ínstar em relação àquelas que consumiram folhas do genótipo CNPA 9211-21 (2,1 dias). Durante esse ínstar o percentual de lagartas sobreviventes variou de 91,3 a 100%.

Não houve influência dos genótipos na duração do quarto ínstar, com valores variando entre 1,9 e 2,2 dias (Tabela 1). O percentual de sobrevivência das lagartas durante este ínstar foi alto, variando de 92,3 a 100%.

As lagartas de A. argillacea que se alimentaram da cultivar CNPA Precoce 2, apresentaram duração do quinto ínstar de 4,9 dias, não sendo estatisticamente diferente ao daquelas lagartas que se alimentaram dos genótipos CNPA Precoce 1 e CNPA 9211-18, no entanto, significativamente superior aos períodos das lagartas que se alimentaram de folhas dos demais genótipos. O percentual de lagartas sobreviventes durante este ínstar variou de 87,5 a 100% (Tabela 1).

O intervalo de variação para a fase larval foi de 13,1 a 14,7 dias (Tabela 2), valores superiores aos observados por Ferreira & Lara (1999), que verificou um intervalo de variação para esta fase de 8,8 a 9,8 dias para lagartas alimentadas com folhas de seis genótipos de algodoeiro. Quando alimentada com os genótipos CNPA Precoce 1, CNPA Precoce 2, CNPA 9211-18 e CNPA 9211-21, o período larval de A. argillacea, foi significativamente maior que o mesmos períodos daquelas alimentadas com o genótipo CNPA 9211-29 (13,1 dias) (Tabela 2). A sobrevivência durante o período larval variou de 62,1 a 86,2%; resultados próximos dos observados por Ferreira & Lara (1999), mas inferiores àqueles constatados por Kasten Júnior & Parra (1984) quando estudaram a mesma espécie em folhas de diferentes variedades de algodoeiro.

O peso das lagartas de A. argillacea aos cinco dias de idade alimentadas com o genótipo CNPA Precoce 1 foi significativamente menor (5,9 mg) que as alimentadas com o genótipo CNPA 9211-29, sendo, no entanto, semelhante aos demais genótipos (Fig. 1). Estes resultados, sugerem que provavelmente o genótipo que originou lagartas com pesos menores causaram efeito adverso sobre elas, devido à presença de alguma substância antibiótica (resistência do tipo antibiose) e/ou por ter sido menos preferido para alimentação (não-preferência). O gossipol é uma substância responsável pela promoção de resistência do tipo não-preferência (Bottger et al. 1964) e antibiose (Bottger & Patana 1966 e Lukefahr et al. 1966) promovendo redução no desenvolvimento das lagartas de alguns Lepidoptera.


O genótipo GL2 GL3 tem em sua constituição genes para a ausência de gossipol, o que proporciona suscetibilidade às lagartas de A. argillacea, explicando assim, o maior peso das lagartas que se alimentaram de suas folhas. No entanto, de acordo com Montandon et al. (1986), lagartas do curuquerê do algodoeiro não são afetadas seriamente quando alimentadas com folhas de algodoeiro com glândulas de gossipol.

O menor peso observado em lagartas alimentadas com determinados genótipos coincide com as observações de Bleicher (1982) que verificou um efeito deletério das linhagens CNPA sobre as lagartas de A. argillacea causando menores pesos. Este autor relaciona o menor peso observado em determinados genótipos, como consequência da não-preferência da lagarta pelo alimento ou devido à ingestão de substâncias presentes nas folhas (antibiose) que prejudicaram o seu desenvolvimento, ou ainda à ocorrência de ambos os fatores.

Fases Pré-Pupal e Pupal. Os genótipos avaliados influenciaram os períodos de pré-pupa e pupa de A. argillacea. O período pré-pupal quando as lagartas de A. argillacea alimentaram-se dos genótipos CNPA 9211-31, CNPA 9211-29, CNPA 9211-20, CNPA 9211-25 e CNPA Precoce 2 foi significativamente maior (Tabela 2). O prolongamento do estágio pré-pupal pode ser conseqüência dos genótipos apresentarem resistência do tipo antibiose. A maior duração da fase pré-pupal poderá favorecer o controle do curuquerê por predadores, pois nesta fase a lagarta fica mais suscetível a esses inimigos naturais.

As lagartas que se alimentaram dos genótipos CNPA 9211-20, 9211-18, 9211-21 apresentaram período pupal significativamente superior àquele período das lagartas que consumiram folhas do genótipo CNPA 9211-41 (Tabela 2). A sobrevivência durante esta fase de desenvolvimento foi elevada variando de 84 a 100%.

Fase Larva-Adulto. O período de larva-adulto de A. argillacea nos genótipos CNPA Precoce 1, Precoce 2, 9211-18 e 9211-21 foi significativamente maior que nos genótipos CNPA 9211-29 e CNPA 9211-41 (Tabela 2).

O percentual de adultos emergidos originados das lagartas alimentadas com os diferentes genótipos variou de 58,6 a 85,7% (Tabela 2). O percentual de sobrevivência de formas jovens de insetos constitui importante parâmetro para a avaliação da resistência da planta (Lara 1991). Durante as fases larval e larva-adulto, lagartas de A. argillacea que se alimentaram dos genótipos CNPA 9211-41 e CNPA 9211-31 apresentaram percentuais de sobrevivência inferiores a 65%. Baseando-se neste parâmetro poder-se-ia considerar que esses dois genótipos não são adequados ao desenvolvimento de A. argillacea por causarem alta mortalidade, comportando-se, portanto, como resistentes a A. argillacea. Ferreira et al.(1999), avaliando a resistência de A. argillacea a alguns genótipos de algodoeiro, determinou maior percentual de mortalidade das lagartas que alimentaram-se do genótipo CNPA 9211-31, concluindo que este material apresenta resistência do tipo antibiose.

Pela análise dos parâmetros avaliados durante as fases jovens, verificou-se que os genótipos CNPA Precoce 1, CNPA Precoce 2, CNPA 9211-31 e CNPA 9211-41 causaram o prolongamento da fase imatura e/ou reduziram a sobrevivência, apresentando resistência do tipo não-preferência e/ou antibiose enquanto que os suscetíveis foram GL2 GL3 e CNPA 9211-29 (Tabelas 1, 2 e Figura 1).

Fase Adulta. Os genótipos oferecidos como alimento às lagartas de A. argillacea não influenciaram os períodos de pré-oviposição e pós-oviposição dos adultos, apresentando estes um intervalo de variação de 4,0 a 9,3 dias e 1,7 a 6,8 dias, respectivamente. No entanto, observou-se influência dos genótipos sobre o período de oviposição. As fêmeas originadas de lagartas que se alimentaram do genótipo CNPA 9211-20 apresentaram período de oviposição (16,5 dias) significativamente maior que àquelas originadas do tratamento CNPA Precoce 1 (7,0 dias), ocorrendo período intermediário nos demais genótipos utilizados (Tabela 3).

Fêmeas originadas de lagartas alimentadas com folhas do genótipo CNPA Precoce 1 apresentaram menor capacidade de oviposição, indicando a resistência deste genótipo em função da ocorrência de redução na fecundidade. As fêmeas provenientes de lagartas alimentadas com folhas dos genótipos CNPA 9211-31, CNPA 9211-41, CNPA 9211-25 e CNPA 9211-21 apresentaram valores intermediários. Estes resultados são significativamente menores que os observados para fêmeas de A. argillacea originadas de lagartas que se alimentaram dos demais genótipos (fig02).


A longevidade de A. argillacea nos diferentes tratamentos, variou de 17,1 a 22,7 dias e 18,6 a 31,4 dias, respectivamente para fêmeas e machos, não sendo esta variável influenciada pelos genótipos de algodoeiro (Tabela 4). A razão sexual variou de 0,3 a 0,7. Esses valores estão próximos dos resultados (0,5 a 0,6) observados, por Kasten Júnior & Parra (1984).

Agradecimentos

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão de bolsa ao primeiro autor e ao Conselho Nacional De Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, pela bolsa de Produtividade em Pesquisa ao segundo autor, e, ao Dr. José Janduí Soares pelo fornecimento das sementes dos genótipos de algodão.

Literatura Citada

Recebido em 27/12/99. Aceito em 21/03/01.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    13 Ago 2004
  • Data do Fascículo
    Jun 2001

Histórico

  • Aceito
    21 Mar 2001
  • Recebido
    27 Dez 1999
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