Atividade antimicrobiana de Senecio heterotrichius DC. (Asteraceae)

Antimicrobial activity of Senecio heterotrichius DC.

TRABALHOS ORIGINAIS

Atividade antimicrobiana de Senecio heterotrichius DC. (Asteraceae)

Antimicrobial activity of Senecio heterotrichius DC.

Leandro Nicolodi Francescato^I; Regis Augusto Norbert Deuschle^I; Carlos Augusto Mallmann^II; Sydney Hartz Alves^{I, III}; Berta Maria HeinzmannI, ^*

^IDepartamento de Farmácia Industrial, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria

^IIDepartamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria

^IIIDepartamento de Microbiologia, Universidade Federal de Santa Maria

RESUMO

Neste trabalho é relatada a avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos diclorometânico e etanólico, obtidos por maceração das partes aéreas de S. heterotrichius pelo método de microdiluição em caldo, frente a patógenos bacterianos e fúngicos. O extrato diclorometânico evidenciou boa atividade inibitória frente a Candida krusei (CIM de 0,25 mg/mL) e moderada atividade frente a Staphylococcus aureus (CIM de 2,5 mg/mL). O extrato etanólico mostrou-se inativo frente aos microrganismos testados. Também foi isolado o constituinte majoritário do extrato diclorometânico, cuja análise espectroscópica indicou tratar-se de um sesquiterpeno, identificado como germacreno D.

Unitermos: Senecio heterotrichius DC./atividade antimicrobiana. Germacreno D.. Asteraceae

ABSTRACT

This work describes the evaluation of the antimicrobial activity of CH₂Cl₂ and EtOH extracts obtained by the maceration of the aerial parts of Senecio heterotrichius DC. against bacterial and fungal pathogens by broth microdilution method. The CH₂Cl₂ extract showed the best activity against Candida krusei (MIC 0.25 mg/mL) and a moderate activity against Staphyllococcus aureus (MIC 2.5 mg/mL). The EtOH extract was inactive against the tested microorganisms. Besides, one of the main constituents of CH₂Cl₂ extract was isolated, and its spectroscopic analysis indicated the presence of a sesquiterpene identified as germacrene D.

Uniterms:Senecio heterotrichius DC/antimicrobial activity. Germacrene D. Asteraceae.

INTRODUÇÃO

O gênero Senecio (tribo Senecioneae, família Asteraceae) constitui um grupo de plantas cosmopolitas, não muito homogêneo (Jeffrey et al., 1977), presente em regiões frias e tropicais, principalmente na Europa, África, Américas Central e do Sul. Das mais de 2000 espécies amplamente distribuídas pela superfície terrestre, cerca de 85 crescem no Brasil (Cabrera, Klein, 1975).

Embora espécies de Senecio apresentem hepatotoxicidade reconhecida devido à presença de alcalóides pirrolizidínicos (Smith, Culvenor, 1981), várias delas são utilizadas na medicina popular de diferentes países, sendo em alguns casos, empregadas no tratamento de infecções (Kelmanson, Jäger, Van Staden, 2000; Portillo et al., 2001; Navarro García et al., 2003).

A utilização de plantas pertencentes ao gênero Senecio como medicinais pode ser explicada pela presença de diferentes classes de metabólitos secundários, uma vez que são ricas em monoterpenóides (Pérez, Agnese, Cabrera, 1999), sesquiterpenóides (Dupré et al., 1991; Bohlmann, Ziesche, 1981), triterpenóides (Abdo et al., 1992) e flavonóides (Dupré et al., 1991; Mansour, Saleh, 1981), entre outros. As atividades biológicas já comprovadas para estas espécies são as mais variadas, como, por exemplo, propriedades inseticidas (Pascual-Villalobos, Robledo, 1998), atividades antimicrobiana (Cos et al., 2002; Navarro García et al., 2003; Loizzo et al., 2006), citotóxica (Loizzo et al., 2006), antiviral (Fortin et al., 2002) e antioxidante (Liu, Ng, 2000).

Senecio heterotrichius DC., popularmente conhecido como "catião-melado", cresce como um arbusto no sul do Brasil, Uruguai e nordeste da Argentina. Floresce nos meses de outubro e novembro (Cabrera, Klein, 1975) e comporta-se como invasora de culturas e pastagens nativas.

O presente trabalho descreve a avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos diclorometânico e etanólico de S. heterotrichius, bem como o isolamento de um dos principais constituintes do primeiro.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

Partes aéreas frescas de Senecio heterotrichius DC. foram coletadas em abril de 2002 no município de Porto Alegre, RS, Brasil, e identificadas no Laboratório de Botânica da Faculdade de Farmácia da UFRGS. Material testemunha encontra-se depositado no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM sob o número SMDB 8935.

Obtenção dos extratos

As partes aéreas frescas (1193,5 g) foram divididas e extraídas por maceração, sucessivamente com diclorometano e etanol, duas vezes cada, por 8 dias. Após a concentração dos macerados sob pressão reduzida, foram obtidos os extratos diclorometânico (CH₂Cl₂) e etanólico (EtOH) com rendimento de 12,054 g (1,01%) e 43,3 g (3,63%), respectivamente.

Atividade antimicrobiana

A avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos CH₂Cl₂ e EtOH foi realizada através do método de microdiluição em caldo, previamente descrito por Deuschle et al. (2006), com base nos documentos M27-A2 (NCCLS, 2002) para fungos leveduriformes e M100-S12 (NCCLS, 2002) para bactérias.

Previamente aos testes, os cultivos bacterianos foram ativados através de subcultivos em ágar Mueller-Hinton durante 24 h a 35 °C, enquanto que os fungos foram subcultivados em ágar Sabouraud dextrose, 30-35 °C/48 h. Após a ativação, padronizou-se o inóculo, que consistiu na preparação de uma suspensão bacteriana em solução fisiológica esterilizada a 0,9%, com turvação similar ao tubo 0,5 da Escala Mac Farland (1 x 10⁸ UFC/mL). A seguir, esta suspensão foi diluída a 1:10 (1 x 10⁷ UFC/mL) em solução fisiológica esterilizada a 0,9%, e volumes de 10 µL foram então transferidos para as cavidades de microplaca esterilizada, contendo 200 µL de caldo Mueller-Hinton acrescido das diferentes concentrações finais do extrato a ser testado, resultando num inóculo final de aproximadamente 5 x 10⁵ UFC/mL. As placas com patógenos bacterianos foram incubadas a 37 °C/24 h. A suspensão de microrganismos leveduriformes foi preparada de modo similar. Após a padronização da turvação (equivalente ao tubo 0,5 da escala Mac Farland), foram preparadas diluições sucessivas de 1:50 e 1:20 em caldo RPMI 1640 tamponado; volumes de 100 µL foram transferidos para as cavidades de uma microplaca estéril, contendo 100 µL do caldo RPMI acrescido das diferentes concentrações intermediárias do extrato a ser testado. As placas foram incubadas a 35 °C/48 h. As CIMs (concentrações inibitórias mínimas) foram determinadas com base na menor concentração do extrato que inibiu completamente o crescimento microbiano.

Para a preparação da solução estoque do extrato EtOH, este foi solubilizado em mistura de dimetilsulfóxido:polissorbato 80 a 0,5% (1:4), a fim de obter-se solução na concentração de 25 mg/mL. Para a preparação da solução estoque do extrato CH₂Cl₂, o polissorbato 80 a 0,5% foi substituído por polissorbato 80 a 10%. As concentrações intermediárias dos extratos foram preparadas diluindo-se a solução estoque no meio apropriado, caldo Mueller-Hinton para bactérias e caldo RPMI 1640 para fungos. As concentrações finais testadas foram de 0,025; 0,05; 0,25; 0,5; 1; 2,5 e 5 mg/mL. Os testes foram executados em triplicata.

Os microrganismos testados incluíram isolados clínicos e cultivos padrões de bactérias e fungos patogênicos, sendo estes listados na Tabela I.

Isolamento

O fracionamento preliminar do extrato CH₂Cl₂ (11,7 g) foi realizado por cromatografia em coluna (CC) flash sobre sílica-gel (60 x 4 cm) utilizando diclorometano como fase móvel, sendo coletadas 17 frações de 250 mL. As frações 2 e 3 (4,68 g) foram reunidas, concentradas e submetidas novamente à CC flash (49,5 x 4 cm) utilizando hexano como fase móvel, sendo coletadas 27 frações de 100 mL. As frações 2 a 11 (3,03 g) foram reunidas, concentradas e submetidas a fracionamento por CC (52,5 x 4 cm) utilizando sílica-gel impregnada com solução de nitrato de prata à 10% (STAHL, 1969) e hexano:acetato de etila (98:2) como fase móvel, sendo coletadas 350 frações de 20 mL. As frações 116 a 145 foram reunidas e evaporadas sob pressão reduzida, resultando em 271,3 mg do composto 1.

Composto 1. Ressonância magnética nuclear de ¹H (400 MHz, CDCl₃): d (ppm) 0,82 e 0,87 (d, J 6,8; 6,72 Hz,12-H e 13-H), ~1,44 (m, 11-H), ~1,45 (m, 8-H), 1,52 (s, 14-H), 2,00 (m, 7-H), ~2,00 (m, 2-H), 2,10 (ddd, J ~5,0; ~7,8; ~12,8 Hz, 3-H), 2,25 (m, 9-H), ~2,35 (m, 2-H'), ~2,43 (m, 3-H'), 4,75 (d, J 2,4 Hz, 15-H), 4,80 (d, J ~2,0 Hz, 15-H'), 5,14 (dd, J 4,8 e 11,6 Hz, 1-H), 5,26 (dd, J 10 e 16,0 Hz, 6-H), 5,79 (d, J 15,6 Hz, 5-H); Ressonância magnética nuclear de ¹³C (100 MHz, CDCl₃): d (ppm) 15,9 (C-14), 19,3, 20,8 (C-12, C-13), 26,5 (C-8), 29,2 (C-2), 32,8 (C-11), 34,5 (C-3), 40,7 (C-9), 52,9 (C-7), 109,0 (C-15), 129,6 (C-1), 133,5 (C-6), 134,0 (C-10), 135,5 (C-5), 148,8 (C-4); Espectrometria de massas (IE, 70 eV, TR = 30,7 min) m/z(%): 204(M+, 12), 161(100), 147(6), 133(21), 119(42), 105(66), 93(27), 91(66), 79(40), 77(38), 67(20), 55(22), 41(59).

Procedimentos experimentais gerais

Ressonância magnética nuclear de ¹H e de ¹³C: BRUCKER DPX-400 (¹H: 400 MHz; ¹³C: 100 MHz, em CDCl₃). CC: sílica-gel 60, tamanho de partícula 63 a 200 mm (Merck). CCD: cromatofolhas de sílica-gel (Merck) GF₂₅₄; detecção: anisaldeído-H₂SO₄. Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas: Sistema hifenado AGILENT 5973 equipado com um detector seletivo de massas 5973 e um injetor automático; parâmetros: split inlet 1:100; gás carreador: He (1 mL/min); coluna capilar de sílica fundida HP-5MS (Hewlett Packard, fenilmetilpolisiloxano 5%, 30 m de comprimento, 0,25 mm d.i., espessura do filme: 0,25 mm); programa de análise: 40 °C (Ti) por 4 min, 40-260 °C, 4 °C/min; temperatura do injetor: 220 °C; energia de ionização: 70 eV; banco de dados: NIST, 1998.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados da atividade antimicrobiana dos extratos CH₂Cl₂ e EtOH de S. heterotrichius encontram-se na Tabela I.

Os resultados da Tabela I indicam para o extrato CH₂Cl₂ de S. heterotrichius moderada atividade antifúngica frente a Candida krusei (CIM de 0,25 mg/mL). Cabe ressaltar que Candida krusei tem evidenciado problemático perfil de suscetibilidade a antifúngicos poliênicos e azólicos; sua resistência ao fluconazol é notória e estende-se a triazólicos como o itraconazol (Sanglard, Odds, 2002). A atividade antibacteriana frente a Staphylococcus aureus (CIM de 2,5 mg/mL) também deve ser considerada devido aos elevados percentuais de resistência que esta espécie apresenta diante de toda classe dos beta-lactâmicos. Os isolados de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) têm sido desafiadores e a constatação da resistência à vancomicina tem tornado o espectro de suscetibilidade de S. aureus crítico, contribuindo com elevadas taxas de mortalidade (Liu, Chambers, 2003). Neste contexto, a busca por novas moléculas que o inibam tanto in vivo como in vitro tem importância visando futuras aplicações, sejam clínicas ou mesmo na desinfecção de ambientes hospitalares. Portanto, estes valores de CIM, embora elevados, podem ser considerados relevantes devido às propriedades patogênicas destes microrganismos. Já o extrato EtOH não demonstrou atividade antimicrobiana nas concentrações testadas.

A atividade do extrato CH₂Cl₂ sobre um microrganismo Gram-positivo (S. aureus) e ausência de atividade frente ao Gram-negativo testado (E. coli) estão de acordo com as informações contidas na literatura, que relatam maior sensibilidade dos primeiros frente aos metabólitos vegetais (Burt, 2004). Segundo Holley e Patel (2005), a membrana dual apresentada pelas bactérias Gram-negativas forma um envelope complexo, sendo responsável pela menor sensibilidade destes microrganismos frente aos extratos vegetais.

Atividade antimicrobiana já foi comprovada para várias espécies de Senecio, entre elas, Senecio maranguensis O. Hoffm. (Cos et al., 2002), S. desiderabilis Vellozo (Deuschle, 2006) e S. graveolens Wedd. (Pérez, Agnese, Cabrera, 1999).

Uma vez que a literatura descreve o gênero Senecio como sendo rico em terpenóides, compostos que freqüentemente apresentam atividade antimicrobiana, e o extrato CH₂Cl₂ mostrou-se ativo contra dois dos microrganismos testados, partiu-se para o seu fracionamento, visando isolar a(s) substância(s) ativa(s).

O composto 1 (Figura 1), isolado do extrato CH₂Cl₂ de S. heterotrichius_, foi identificado como sendo o germacreno D por comparação de seus dados espectroscópicos com os da literatura (Rostelien et al., 2000; Steliopoulos et al., 2002; Deuschle, 2007). Este sesquiterpeno já foi isolado de várias espécies de Senecio, mas até o momento sua presença não havia sido descrita em S. heterotrichius. A ocorrência freqüente do germacreno D no gênero Senecio pode ser explicada pelo fato deste composto ser um intermediário comum na biossíntese de outros hidrocarbonetos sesquiterpênicos, que por sua vez, dão origem a derivados de estruturas mais complexas (Büllow, König, 2000). O germacreno D é biossintetizado a partir do precursor difosfato de farnesila, através da catálise por sesquiterpeno-sintases (ciclases). Assim como a maioria dos sesquiterpenóides existentes na natureza, o composto isolado é uma molécula quiral, existindo na forma de dois enantiômeros, (+) e (-) (Koenig, 2001). Cada enantiômero do germacreno D é produzido por uma rota metabólica diferente, que requer diferentes enzimas (Huntington, Kinnel, 2006). Estudos visando a determinação e/ou quantificação do(s) enantiômero(s) do germacreno D isolado(s) de S. heterotrichius, não foram realizados. Para este composto é relatada atividade inibidora do apetite de insetos (Petrakis et al., 2005), tripanossomicida in vitro e ausência de citotoxicidade frente a Artemia salina (Biavatti et al., 2001). Frente a patógenos humanos, a atividade antimicrobiana do germacreno D já foi avaliada por dois métodos distintos: difusão em ágar (Biavatti et al., 2001) e microdiluição em caldo (Deuschle et al., no prelo). Em ambos os casos, o germacreno D mostrou-se inativo contra Bacillus subtilis, B. cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Micrococcus roseus, M. luteus, Candida albicans, C. dubliniensis, C. krusei e Saccharomyces cerevisiae nas concentrações testadas (até 5 mg/mL). Portanto, estes resultados indicam que o composto isolado não é o responsável pela atividade antimicrobiana do extrato CH₂Cl₂ detectada neste ensaio. No entanto, o germacreno D é um dos constituintes majoritários de óleos essenciais com atividade antimicrobiana comprovada, extraídos de diferentes espécies vegetais (Juteau et al., 2002; Gonzaga et al., 2003; Iacobellis et al., 2005; Chavan, Shinde, Nirmal, 2006) e pode estar contribuindo para a atividade antimicrobiana dos(s) constituinte(s) ativo(s) do extrato CH₂Cl₂ de S. heterotrichius. Segundo Cowan (1999), a lipofilia de hidrocarbonetos de estrutura terpênica permite a sua partição nos lipídeos da membrana celular, aumentando a permeabilidade desta. Esta propriedade pode facilitar a penetração de agentes antimicrobianos no interior celular e assim proporcionar aumento de atividade, constituindo-se numa explicação plausível para as interações positivas de constituintes de natureza sesquiterpenóide com antibióticos de uso convencional (Brehm-Stecher, Johnson, 2003; Ríos, Recio, 2005).

A atividade inibitória do extrato CH₂Cl₂ frente a Candida krusei e Staphylococcus aureus poderia ser de responsabilidade dos alcalóides pirrolizidínicos (APs), constituintes comuns no gênero Senecio, já descritos para S. heterotrichius (Krebs, Carl, Habermeh, 1996; Trigo et al., 2003). A atividade antimicrobiana já foi comprovada para esta classe de constituintes (Reina et al., 1995; Singh, Sahu, Singh, 2002), sendo conseqüência de sua capacidade em reagir com componentes nucleofílicos celulares como ácidos nucléicos (DNA) e proteínas, após sofrer desidrogenação catalisada por monooxigenases do sistema citocromo P450, e assim, interromper o ciclo celular do microrganismo (Prakash et al., 1999).

AGRADECIMENTOS

Ao botânico Marcos Sobral, pela identificação e auxílio na coleta do material vegetal. Apoio financeiro: CAPES e CNPq.

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Recebido para publicação em 02 de janeiro de 2007.

Aceito para publicação em 17 de maio de 2007.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Set 2007
• Data do Fascículo
  Jun 2007

Histórico

• Recebido
  02 Jan 2007
• Aceito
  17 Maio 2007