OBTENÇÃO DE PLANTAS DE LIMÃO CRAVO (Citrus limonia Osbeck) E TANGERINA CLEÓPATRA (Citrus reshni Hort.) A PARTIR DO CULTIVO DE PROTOPLASTOS DE SUSPENSÃO CELULAR

PLANT REGENERATION OF 'RANGPUR' LIME (Citrus limonia Osbeck) AND 'CLEÓPATRA' MANDARIN (Citrus reshni Hort.) THROUGH PROTOPLASTS OF CELL SUSPENSION

OBTENÇÃO DE PLANTAS DE LIMÃO CRAVO (Citrus limonia Osbeck) E TANGERINA CLEÓPATRA (Citrus reshni Hort.) A PARTIR DO CULTIVO DE PROTOPLASTOS DE SUSPENSÃO CELULAR

Rodrigo Rocha Latado^1,4*; Fernando Berlink D'utra Vaz²; Augusto Tulmann Neto³

¹Pós-Graduando do Depto. de Genética - ESALQ-USP, C.P. 09 - CEP:13418-960 - Piracicaba, SP.

²Depto. de Agronomia - UFAL - CEP:57072-970 - Maceió, AL.

³Laboratório de Melhoramento de Plantas - CENA/USP, C.P. 96 - CEP:13400-970 - Piracicaba, SP.

⁴Bolsista do CNPq.

*e-mail: [e-mail]

RESUMO: Este trabalho descreve uma metodologia para a regeneração de plantas de tangerina 'Cleópatra' e limão 'Cravo', a partir do cultivo de protoplastos de suspensão celular. Para tal, calos nucelares foram induzidos em meio contendo BAP e cultivados em meio sem reguladores de crescimento. Protoplastos foram isolados de suspensões celulares e cultivados em gotas de agarose, com densidade de 2 X 10⁵ protoplastos.ml^-1. O meio MT, contendo ácido giberélico e água de coco, foi eficiente na germinação de embriões somáticos. Os métodos de aclimatação de plantas testados apresentaram baixa eficiência. Como resultado final, 17 plantas adaptadas de tangerina e 8 de limão foram obtidas.

Palavras-chave:Citros, protoplastos, in vitro, suspensão, porta-enxerto

PLANT REGENERATION OF 'RANGPUR' LIME (Citrus limonia Osbeck) AND 'CLEÓPATRA' MANDARIN (Citrus reshni Hort.) THROUGH PROTOPLASTS OF CELL SUSPENSION

ABSTRACT: The present research describes the regeneration of 'Cleópatra' mandarin and 'Rangpur' lime plants from cell suspension protoplasts. Nucelar calli were induced on a medium containing BAP and maintained on growth regulator free medium. Protoplasts were isolated from embryogenic suspension and plated at a concentration of 2 X 10⁵ protoplasts.ml^-1, on agarose droplets. The MT medium with gibberellic acid and coconut water was efficient to stimulate somatic embryo conversion. Rooted plants acclimation had low efficiency. Seventeen mandarin plants and eight lime plants were obtained.

Key words: Citrus, protoplasts, in vitro, suspension, rootstock

INTRODUÇÃO

A citricultura brasileira se situa numa posição de destaque, pois o Brasil é o primeiro país em termos de produção de laranjas, produção e exportação de suco de laranja concentrado. Na safra de 1995/96, a produção brasileira de suco de laranja concentrado correspondeu a aproximadamente 48% da produção mundial e as exportações de suco chegaram a 79,8% do total mundial (FNP Consultoria e Comércio, 1997). Isto resultou na entrada de recursos externos na ordem de centenas de milhões de dólares anuais.

A distribuição da produção brasileira por estados é bem desigual. Em 1995, o Estado de São Paulo teve uma participação de aproximadamente 82% da produção brasileira de laranja e 72,6% da área colhida de laranja do país (FNP Consultoria e Comércio, 1997).

A partir da década de 60, mais de 90% das plantas cítricas comerciais eram plantadas sobre um único porta-enxerto, o limão 'Cravo' (Citrus limonia Osbeck) (Pompeu Junior, 1991). O limão 'Cravo' apresenta ótimas características agronômicas de porta-enxerto, no entanto, apresenta suscetibilidade a uma importante doença, o declínio dos citros. Esta doença, anualmente, tem levado à morte milhões de plantas cítricas no Brasil, principalmente nas combinações de laranja doce enxertadas sobre limão 'Cravo' (Guirado et al., 1991).

Para a solução deste problema, tem sido avaliada no Brasil a diversificação de porta-enxertos, com o plantio de variedades de copa sobre outras espécies do gênero Citrus e de gêneros afins, tais como: tangerina 'Cleópatra', tangerina 'Sunki', limão 'Rugoso', Poncirus trifoliata e outros. Entretanto, os resultados experimentais demonstram que nenhum destas apresenta, em número e grau, as excepcionais características do limão 'Cravo' (Pompeu Junior, 1991).

Segundo Grosser et al. (1990), a tangerina 'Cleópatra' (Citrus reshni Hort.) é o porta-enxerto comercial mais importante da Flórida (EUA), devido à sua tolerância a tristeza, exocorte, xiloporose, salinidade, frio e a solos calcáreos, além de apresentar pouca suscetibilidade ao "blight" do citros (declínio). Segundo os mesmos autores, os problemas que limitam o seu uso são a suscetibilidade a nematóides, Phytophtora e baixa produtividade em plantas jovens.

Limitações devido à presença de alta heterozigosidade, esterilidade de pólen e óvulos, incompatibilidade sexual, sementes poliembriônicas, baixo vigor de híbridos sexuais e fase juvenil longa dificultam, e às vezes impedem, o melhoramento de porta-enxertos de citros via cruzamento controlado. Uma alternativa ao melhoramento tradicional tem sido a hibridação somática, por meio de fusão de protoplastos. Vários trabalhos descrevem a obtenção de híbridos somáticos (alotetraplóides artificiais) entre espécies de Citrus e também envolvendo espécies de gêneros próximos, com o objetivo de combinar características complementares de porta-enxertos, numa mesma planta (Grosser et al., 1990; Grosser & Gmitter Junior, 1990).

Os protoplastos de citros podem ser isolados a partir de vários tecidos, tais como calos nucelares, calos de hipocótilo, suspensões celulares e folhas. Entretanto, nem todos estes possuem capacidade embriogênica. Para trabalhos de hibridação somática, é necessária a obtenção de, pelo menos, uma fonte de protoplastos embriogênicos para que se consiga regenerar plantas (Grosser & Gmiter Junior, 1990; Grosser, 1994). As fontes de protoplastos embriogênicos mais utilizadas são calos nucelares ou suspensões celulares, derivadas de calos nucelares.

O objetivo deste trabalho foi o de estabelecer condições adequadas de isolamento e cultivo de protoplastos de limão 'Cravo' e tangerina 'Cleópatra', por meio de cultivo em gotas de agarose, de forma a obter plantas das duas espécies. Foram avaliados: meio de indução de calos, eficiência de isolamento da solução enzimática, eficiência de cultivo, meio de germinação de embriões e métodos de aclimatação de plantas.

MATERIAL E MÉTODOS

Os calos embriogênicos foram obtidos pelo cultivo de nucelos, extraídos de frutos imaturos, em meio semi-sólido (8,0 g.L^-1 de ágar, Sigma Chemical Co.) composto por sais e vitaminas de MT (Murashige & Tucker, 1969), suplementado com 10 mg.L^-1 de BAP (6-benzilaminopurina) (TABELA 1). O pH foi ajustado para 5,8. Cerca de 30 ml de meio foram distribuídos em placas de Petri, após a autoclavagem à 121°C, por 18 minutos.

Os nucelos foram retirados de frutos com idade média de 12 semanas após a antese, coletados de apenas uma planta de cada espécie: limão 'Cravo' (acesso N° 326) e tangerina 'Cleópatra' (acesso N^o 199), no banco de germoplasma do Centro de Citricultura "Sylvio Moreira" do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), em Cordeirópolis, SP.

Após desinfecção superficial dos frutos, em câmara de fluxo laminar, as sementes imaturas foram excisadas, cortadas ao meio na posição longitudinal, os nucelos foram retirados e colocados com a face abaxial em contato com o meio de cultivo. A placas foram colocadas no escuro, à temperatura de 27 ± 1^oC. Os calos obtidos foram subcultivados a cada 30 dias, em meio MT solidificado, sem reguladores de crescimento (TABELA 1).

As suspensões celulares das duas espécies foram iniciadas adicionando-se 1,0 g de calo fresco e 50 ml de meio MT líquido, sem reguladores de crescimento (TABELA 1), em "erlenmeyer" esterilizado de 250 ml. As suspensões foram colocadas sob agitação constante (100 rpm), à temperatura de 27 ± 1^oC e no escuro. O intervalo de subcultivo foi de 7 dias.

Os protoplastos foram isolados a partir de suspensões celulares com 8 ou mais semanas de idade, utilizando um método semelhante ao descrito por Oliveira (1993). Para tal, 0,5 g de suspensão celular filtrada (subcultivada 2-4 dias antes) de cada uma das duas espécies foi colocada em placas de Petri de 6 cm de diâmetro. A primeira etapa foi a da pré-plasmólise. Para tal, 10 ml da solução CPW 13M, composta por sais de CPW (Power et al., 1989) e manitol a 13% (p/v) foram adicionados e mantidos por 1 hora. A seguir, a solução CPW foi substituída por 6 ml de solução enzimática e as placas foram seladas com Parafilme (American Can. Ltd.).

A solução enzimática era composta por cellulase R10 (Yakult Honsha Ltd.) a 1% (p/v), macerozyme R10 (Yakult Honsha Ltd.) a 0,2% (p/v), driselase (Kyowa, Ltd.) a 0,1 % (p/v), 5 mM de MES (ácido 2-[N-morfolino] etanosulfônico) (Sigma Chemical Co.), 0,02 % (p/v) de soro bovino albumina em pó (Sigma Chemical Co.) e 0,7 M de manitol, dissolvidos em sais de CPW. O pH da solução foi ajustado para 5,7 e a seguir, a solução foi filtro-esterilizada.

O tratamento enzimático foi realizado por 8 horas, no escuro, à temperatura de 27 ± 1^oC, sob agitação constante (50 rpm).

A purificação dos protoplastos iniciou-se com uma filtragem em peneira plástica esterilizada (malha de nailon de 58 mm), colocada sobre uma placa de Petri de 9 cm de diâmetro. O filtrado foi coletado com pipeta Pasteur e transferido para tubos de vidro com tampa. A seguir, os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 700 rpm, sendo o sobrenadante descartado e o "pellet" ressuspenso em 8 ml de CPW 13M. O rendimento total foi avaliado por meio de contagem em câmara de Neubauer, em microscópio ótico. A viabilidade dos protoplastos foi determinada de acordo com a metodologia descrita por Otoni (1995), com DAF (diacetato de fluoresceína) e observação sob luz ultra-violeta.

Os protoplastos foram cultivados na forma de gotas de agarose, com densidade de 2 x 10⁵ protoplastos por ml de meio. O meio de cultivo usado na gota de agarose foi o KM8P (Kao & Michayluk, 1975, modificado por Gilmour et al., 1989), preparado na seguinte forma: uma alíquota de 4 ml do meio KM8P 2x (dupla concentração) foi misturada a 4 ml de solução quente de 1,2% de agarose tipo VII (previamente esterilizada por autoclavagem) num tubo, resultando em 8 ml de solução KM8P-agarose 0,6%. Antes da solidificação, o meio foi transferido para o tubo contendo o "pellet" de protoplastos previamente centrifugado e sem a solução de lavagem CPW 13M. Após misturar levemente, os protoplastos foram transferidos com pipeta Pasteur para placas de Petri de 6 cm (diâmetro).

Após a solidificação das gotas de agarose, adicionou-se em cada placa 2 ml de meio nutritivo (BH₃ 0,6 M), descrito por Grosser & Gmitter Junior (1990). As placas foram seladas com parafilme e colocadas no escuro e à temperatura média de 27 ± 1^oC.

A redução da osmolaridade do meio de banho foi realizada a cada 7 dias , utilizando-se para isto a mistura de meios BH₃ (0,6 M) X MT liquido (0,12 M), nas seguintes proporções: 3:1; 2:1; 1:1 e 0:1. Após 35 dias utilizou o meio MT como meio de banho.

A eficiência de cultivo foi avaliada aos 28 dias de cultivo, com a contagem do número de microcolônias em relação ao número de protoplastos inicialmente cultivados. O resultado foi expresso em termos de porcentagem.

Após 50 dias de cultivo, as microcolônias com mais de 1 mm de diâmetro foram sendo transferidas para o meio semi-sólido MT sem reguladores de crescimento, em placas de Petri de 9 cm de diâmetro. Aproximadamente 2 ml do meio MT líquido foi adicionado sobre o meio semi-sólido, para evitar a desidratação excessiva das colônias. As placas foram transferidas para condições de baixa intensidade de luz (16 W.m^-2) e fotoperíodo de 16 horas. Os calos foram subcultivados a cada 30 dias no mesmo meio (meio MT semi-sólido).

Os embrióides em estádio globular e com coloração verde, desenvolvidos a partir dos calos, foram sendo transferidos isoladamente para o meio MT semi-sólido acrescido de 1,5 g.L^-1de extrato de malte (TABELA 1), com o objetivo de acelerar o seu desenvolvimento.

Os embriões cotiledonares completamente desenvolvidos foram germinados no meio MT semi-sólido acrescido de 1 mg.L^-1 de GA₃ (ácido giberélico) e 20 ml. L^-1 de água de coco (TABELA 1).

As plantas com tamanho aproximado de 2 cm de comprimento foram transferidas para o meio MT semi-sólido acrescido de 0,02 mg.L^-1 de ANA (ácido naftalenoacético) e solidificado com 2 g.L^-1 de phytagel (Sigma Chemical Co.) (TABELA 1). As plantas com aproximadamente 5 cm de comprimento foram levadas para a aclimatação na casa de vegetação.

Dois métodos de aclimatação foram utilizados: o primeiro, composto por transplantio em copo plástico contendo vermiculita esterilizada e o segundo, composto por transplante em vidros contendo solução esterilizada de sais de MT (metade da concentração), sendo o pH ajustado para 5,8. No segundo caso, as plantas foram presas na altura do colo com discos de isopor. Os copos plásticos e os vidros foram cobertos com saco plástico transparente. As plantas foram colocadas em estufa sombreada por aproximadamente duas semanas, sendo a cobertura plástica retirada gradativamente. Após este período, a cobertura foi retirada totalmente e as plantas, mantidas no local sombreado por mais duas semanas. A adaptação se completou com a passagem das plantas para uma estufa com maior luminosidade (sombrite de 50%).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A frequência de obtenção de calos aos 45 dias foi de 28 % em tangerina 'Cleópatra' e 19 % em limão 'Cravo' (TABELA 2). Os calos de tangerina apresentavam coloração branca, os calos de limão tinham coloração amarelo-claro e ambos eram altamente friáveis (Figura 1a). Não se observou a indução de calos compactos neste experimento.

Figura 1.
a - Calos de limão 'Cravo' após 5 meses de cultivo. b- Suspensão celular de tangerina 'Cleópatra' após 3 meses de cultivo. c- Primeira divisão celular de protoplastos de tangerina 'Cleópatra' após 8 dias de cultivo. d- Microcolônias de limão 'Cravo' após 45 dias de cultivo. e- Placa de Petri contendo embriões somáticos de tangerina 'Cleópatra' em fase de germinação. f- Planta de tangerina 'Cleópatra' regenerada a partir de protoplastos, já aclimatada em vaso.

Oliveira (1993) relata ter obtido 16,25 % de calos de tangerina 'Cleópatra' com o cultivo de nucelos no meio MT contendo 10 mg.L^-1 de 6-benzilaminopurina (BAP). Segundo o mesmo autor, os calos de tangerina 'Cleópatra' obtidos neste meio contendo BAP e subcultivados em meio MT (sem reguladores de crescimento), foram os que tiveram a maior taxa de desenvolvimento após 7 subcultivos mensais. O autor não conseguiu obter calos de limão 'Cravo' usando o BAP no meio.

Ling & Iwamasa (1994) induziram calos embriogênicos de tangerina 'Ponkan' usando o meio MT acrescido de 5 mg.L^-1 de BAP. Já Kobayashi et al. (1984) concluíram que o melhor meio de indução de calos embriogênicos em 11 variedades de citros foi o meio MT suplementado com 10 mg.L^-1 de BAP.

Alguns trabalhos descrevem a manutenção de calos de citros por vários anos no meio MT semi-sólido sem reguladores de crescimento (Grosser et al., 1988; Ling & Iwamasa, 1994) ou acrescido com 10 mg.L^-1 de BAP (Kobayashi et al., 1983, 1985), sem perda da capacidade embriogênica.

Após o início do cultivo das suspensões celulares, foi necessário um período mínimo de 7-8 semanas com subcultivos semanais para se atingir o estádio ideal, qual seja, suspensões celulares com agregados finos, pequeno número de células por agregado e com células de formato arredondado. Em alguns frascos, observou-se a presença de agregados maiores e embrióides globulares, neste caso foi necessária uma filtragem com peneira de malha 100 mm, seguida da eliminação dos agregados maiores.

Oliveira (1993) recomenda o intervalo de 12 dias entre subcultivos de suspensão de tangerina 'Cleópatra' e 16 dias para o limão 'Cravo'. Entretanto, Grosser et al. (1990) relatam a ocorrência de uma rápida acidificação do meio de cultura, quando subcultivadas suspensões celulares de tangerina 'Cleópatra' em intervalos de 14 dias. A opção dos autores foi por acrescentar 240 mg.L^-1 de MES (substância tamponante de pH) ao meio líquido.

No presente trabalho, a opção foi por reduzir o tempo entre subcultivos para 7 dias. Após atingir o estádio ideal de cultivo, foi observado que as suspensões celulares apresentavam alta taxa de crescimento, pois dobravam o volume celular em 7 dias de cultivo (Figura 1b).

Os experimentos de isolamento, com 8 horas de incubação na solução enzimática, possibilitaram a obtenção de aproximadamente 1,2 ± 0,2 x 10⁷ e 0,8 ± 0,1 x 10⁷ protoplastos (em 0,5 g de células/6 ml de solução enzimática) de tangerina e limão e com viabilidade, medida com DAF, de aproximadamente 83,1 ± 3,7 % para tangerina e 81,4 ± 4,1 % para limão, respectivamente (TABELA 2). A partir de duas horas de isolamento, já se podia observar protoplastos isolados, mas em pequena quantidade.

Em geral, as suspensões celulares permitem o isolamento de maior número de protoplastos, em comparação com calos. Segundo Ammirato (1984), isto se deve a maior uniformidade da cultura de células, o que permite um maior controle do desenvolvimento celular e também uma ação mais eficiente das enzimas. Oliveira (1993) conseguiu um máximo de 4,7 X 10⁶ protoplastos por grama de calo, em isolamentos com tangerina 'Cleópatra'.

Um fator que afetou a eficiência de isolamento foi a fase de crescimento da cultura de células em suspensão. Isolamentos realizados em suspensões subcultivadas 2-3 dias antes resultaram em isolamentos limpos, com poucos protoplastos estourados e pequena quantidade de "debris", dando-se o contrário para isolamentos de suspensões subcultivadas 7-8 dias antes, que apresentavam grande número de protoplastos estourados.

A viabilidade dos protoplastos, analisada com DAF, está de acordo com os resultados encontrados por Oliveira (1993) e Cristofani (1991) que obtiveram viabilidades entre 73 e 92 %, para protoplastos de limão 'Cravo', tangerina 'Cleópatra' e laranja 'Pera'.

As primeiras divisões celulares foram observadas 7 dias após o início do cultivo (Figura 1c). Grosser & Gmitter Junior (1990) relatam que normalmente as primeiras divisões celulares são observadas após 10-14 dias, entretanto Sim et al. (1988) observaram as primeiras divisões ocorrerem aos 3 dias, em cultivo de protoplastos de Citrus mitis.

A eficiência de cultivo de protoplastos foi satisfatória para o objetivo da pesquisa, em torno de 8,6 ± 1,6 % para tangerina 'Cleópatra' e 5,9 ± 1,2 % para limão 'Cravo', aos 28 dias de cultivo (TABELA 2). Estes resultados encontram-se dentro dos limites citados por Grosser & Gmitter Junior (1990) entre 0 e 35 %. Oliveira (1993), trabalhando com as mesmas espécies deste trabalho, obteve eficiência de 9 % para tangerina e 5 % para limão, em avaliações aos 14 dias.

Para Grosser (1994), no cultivo de protoplastos, uma alta densidade inicial de protoplastos pode ocasionar uma redução na eficiência de cultivo. Além disto, Grosser (1994) afirma que uma alta eficiência de cultivo também não é desejável, pois pode inibir a posterior capacidade de embriogênese dos calos. Devido a isto, o autor sugere uma diluição da cultura ou transferência rápida para meio sólido, no caso de uma alta capacidade de divisão inicial.

O cultivo de protoplastos na forma de gotas de agarose e a redução da osmolaridade do meio de banho aos 28 dias, possibilitaram uma rápida obtenção de calos e embrióides. Em algumas placas, pequenos embrióides globulares e com coloração verde clara foram observados aos 35 dias de cultivo. Segundo Grosser (1994), a forma de cultivo (meio líquido, gotas de agarose ou camada de agarose) deve objetivar a maximização das trocas gasosas. D'utra Vaz et al. (1992) observaram que em atmosferas mais enriquecidas de oxigênio, a eficiência de cultivo de protoplastos e a capacidade de regeneração de plantas foram superiores.

Otoni (1995), comparando a eficiência de cultivo em gotas ou camada de agarose, também considerou que uma maior eficiência do cultivo em gotas estaria relacionada a um maior suprimento de oxigênio, ocasionando uma produção mais efetiva de ATP, com efeitos favoráveis nas divisões celulares. Enquanto no cultivo em camada de agarose, os protoplastos ficam completamente submersos sob uma lâmina de meio líquido.

As colônias com mais de 1mm de diâmetro (Figura 1d) foram transferidas para meio semi-sólido, em condição de baixa luminosidade. A adição de 2 ml de meio líquido MT sobre o meio semi-sólido, após a transferência das microcolônias para o meio semi-sólido, foi considerada importante, pois na sua ausência, observou-se uma oxidação na área de contato entre as colônias e o meio.

Os calos foram subcultivados em meio MT semi-sólido apenas duas vezes (em 60 dias). Após este período, placas que apresentavam calos com alta taxa de crescimento foram descartadas, restando somente aquelas que apresentavam a formação de embrióides. Os embrióides normalmente se originaram nas colônias na fase final de redução da osmolaridade do meio de banho (± 50 dias de cultivo) ou em calos já sendo cultivados no meio semi-sólido.

A embriogênese somática nos calos ocorreu de forma espontânea. Os embriões somáticos, em estádio globular e com coloração verde, foram transferidos individualmente para o meio MT contendo 1,5 g.L^-1 de extrato de malte, com o objetivo de acelerar o desenvolvimento, tal como descrito por Vardi & Galun (1988). Entretanto, esta fase não pareceu ser essencial, pois embriões que não foram cultivados neste meio também tiveram um desenvolvimento normal.

Os embriões em estádio cotiledonar foram transferidos para o meio de germinação contendo ácido giberélico e água de coco. Este meio foi altamente eficiente na germinação de embriões; em torno de 85% dos embriões transferidos germinaram e resultaram em plantas (Figura 1e).

Aproximadamente 85 plantas de tangerina e 34 de limão foram obtidas "in vitro", a partir de quatro experimentos independentes (TABELA 2). Em dois experimentos com limão 'Cravo' foram obtidos calos, mas os mesmos não iniciaram o processo de embriogênese somática.

Os dois métodos de aclimatação foram considerados de baixa eficiência, ou seja, no primeiro método conseguiu-se aclimatar 65% das plantas, e no segundo método, 34% das plantas. Entretanto, o método de adaptação em vermiculita demonstrou duas vantagens adicionais: não requer ambiente esterilizado para fazer o transplantio e proporciona o crescimento mais rápido de caules e de raízes. O principal problema da aclimatação foi o aparecimento de fungos, talvez devido à excessiva umidade do ambiente.

Apenas 17 plantas de tangerina 'Cleópatra' (Figura 1f) e 8 plantas de limão 'Cravo' foram transferidas para vasos e estão sendo cultivadas em estufas (TABELA 2). Aparentemente, todas as plantas regeneradas apresentam morfologia semelhante às respectivas espécies parentais.

CONCLUSÕES

De acordo com a metodologia utilizada no presente trabalho, pôde-se concluir que:

• O cultivo de nucelos no meio MT acrescido de 10 mg.L^-1de BAP possibilitou a obtenção de calos friáveis de tangerina 'Cleópatra' e limão 'Cravo'.

• A incubação de suspensão celular das duas espécies durante 8 horas na solução enzimática, permitiu a obtenção de protoplastos em quantidade (total entre 0,8 e 1,2 X 10⁷ protoplastos) e com viabilidade (entre 81,4% e 83,4%) suficientes para o cultivo.

• Estabeleceu-se um sistema de isolamento e cultivo de protoplastos de suspensão celular de limão 'Cravo' e tangerina 'Cleópatra' capaz de regenerar plantas de ambas espécies.

• Os métodos de aclimatação usados apresentaram uma baixa eficiência (entre 34% e 65%), resultando num pequeno número de plantas aclimatadas das duas espécies.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AMMIRATO, P.V. Induction, maintenance and manipulation of development in embryogenic cell suspension cultures. In: VASIL, I.K. Cell culture and somatic cell genetics of plants. Orlando: Academic Press, 1984. v.1, p.139-151.

CRISTOFANI, M. Uso da cultura de tecidos no melhoramento de citros. Laranja, v.12, p.449-453, 1991.

D'UTRA VAZ, F.B.; SLAMET, I.H.; KHATUN, A.; COCKING, E.C.; POWER, J.B. Protoplast culture in high molecular oxygen atmospheres. Plant Cell Reports, v.11, n.8, p.416-419, 1992.

FNP Consultoria e Comércio. Agrianual 97. São Paulo, 1997. 435p.

GILMOUR, D.M.; DAVEY, M.R.; COCKING, E.C. Production of somatic hybrid tissues following chemical and electrical fusion of protoplasts from albino cell suspensions of Medicago sativa and M. borealis. Plant Cell Reports, v.8, p.29-32, 1989.

GROSSER, J.W. Observations and suggestions for improving somatic hybridization by plant protoplast isolation, fusion and culture. HortScience, v.29, n.11, p.1241-1243, 1994.

GROSSER, J.W.; GMITTER JUNIOR, F.G. Protoplast fusion and Citrus improvement. Plant Breeding Reviews, v.8, p.339-374, 1990.

GROSSER, J.W.; GMITTER JUNIOR, F.G.; CHANDLER, J.L. Intergeneric somatic hybridization of Citrus sinensis cv. Hamlin and Poncirus trifoliata cv. 'Flying dragon'. Plant Cell Reports, v.7, p.5-8, 1988.

GROSSER, J.W.; GMITTER JUNIOR, F.G., TUSA, N.; CHANDLER, J.L. Somatic hybrid plants from sexually incompatible woody species: Citrus reticulata and Citropsis gilletiana. Plant Cell Reports, v.8, p.656-659, 1990.

GUIRADO, N.; MULLER, G.W.; PRATES, H.S. Declínio dos citros In: RODRIGUEZ, O.; VIÉGAS, F.; POMPEU JUNIOR., J.; AMARO, A.S. (Ed.) Citricultura brasileira. São Paulo: Fundação Cargill, 1991. v.2, p. 722-734.

KAO, K.N.; MICHAYLUK, M.R. Nutrient requirements for growth of Cicia hajastana cells and protoplasts at a very low population density in liquid media. Planta, v.126, p.105-110, 1975.

KOBAYASHI, S.; IKEDA, I; NAKATANI, N. Induction of nucellar callus from orange (Citrus sinensis Osb.) ovules, and uniformity of regenerated plants. Bulletin of the Fruit Tree Research Station, v.5, p.43-54, 1984.

KOBAYASHI, S.; IKEDA, I.; UCHIMIYA, H. Conditions for high frequency embryogenesis from orange (Citrus sinensis Osb.) protoplasts. Plant Cell Tissue and Organ Culture, v.4, p.149-159, 1985.

KOBAYASHI, S.; UCHIMIYA, H.; IKEDA, I. Plant regeneration from 'Trovita' orange protoplasts. Japan Journal of Breeding, v.33, n.2, p.119-122, 1983.

LING, J.T.; IWAMASA, M. Somatic hybridization between citrus reticulata and citropsis gabunensis through electrofusion. Plant Cell Reports, v.13, p.493-497, 1994.

MURASHIGE, T.; TUCKER, D.P.H. Growth factor requeriment of citrus tissue culture. In: Proceeding First International Citrus Symposium, Riverside, 1969. Anais. Riverside, 1969. p.1155-1161.

OLIVEIRA, R.P. Cultura de calos, células em suspensão e protoplastos de porta-enxertos de citros. Piracicaba, 1993. 117p. Dissertação (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Universidade de São Paulo.

OTONI, W.C. Hibridação e embriogênese somáticas e transformação genética em espécies de Passiflora. Viçosa, 1995. 198p. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Viçosa.

POMPEU JUNIOR., J. Porta-enxertos. In: RODRIGUES, O.; VIÉGAS, F.; POMPEU JUNIOR., J.; AMARO, A.S. (Ed.) Citricultura brasileira. São Paulo: Fundação Cargill, 1991. v.1, p.265-280.

POWER, J.B.; DAVEY, M.R.; McLELLAN, M.; WILSON, D. Laboratory manual: plant tissue culture. Nottingham:University of Nottingham, 1989. 138p.

SIM, G.E.; LOH, C.S.; GOH, C.J. Direct somatic embryogenesis from protoplasts of Citrus mitis Blanco. Plant Cell Reports, v.7, p.418-420, 1988.

VARDI, A.; GALUN, E. Recent advances in protoplast culture of horticultural crops: Citrus. Scientia Horticulturae, v.37, p.217-230, 1988.

Recebido para publicação em 06.02.98

Aceito para publicação em 17.08.98

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Jul 1999
• Data do Fascículo
  1999

Histórico

• Recebido
  06 Fev 1998
• Aceito
  17 Ago 1998