Influência da peritonite sobre a síntese de colágeno em anastomoses do cólon distal: estudo experimental em ratos

Influence of peritonitis on the synthesis of collagen of the distal colon: experimental study in rats

INFLUÊNCIA DA PERITONITE SOBRE A SÍNTESE DE COLÁGENO EM ANASTOMOSES DO CÓLON DISTAL

ESTUDO EXPERIMENTAL EM RATOS¹

Maria de Lourdes Pessole Biondo-Simões², Fernando Hintz Greca³, Agostinho Bryk Junior⁴, Maria Cláudia Gomes Komatsu⁴, Fabiano de Oliveira Bittencourt⁴, Letícia Maria Greca⁴

Biondo-Simões ML, Greca FG, Bryk Junior A, Komatsu MCG, Bittencourt FO, Greca LM. Influência da peritonite sobre a síntese de colágeno em anastomoses do cólon distal: estudo experimental em ratos. Acta Cir Bras 2000; 15(supl 3): 69-73.

RESUMO: Com o objetivo de verificar a relação entre a concentração de colágeno e a capacidade de suportar pressão em anastomoses de cólon quando existe peritonite, utilizaram-se 40 ratos machos, Wistar-TECPAR, com idade média de 120 dias e peso médio de 302 g, os quais foram divididos em 2 lotes de 20 animais que compuseram os grupos controle e peritonite. Sob anestesia inalatória e submetidos à laparotomia os ratos do grupo peritonite tiveram infecção induzida pelo método de Wichterman e col. e os do grupo controle laparotomia com manipulação dos segmentos intestinais envolvidos no experimento. Após 24 horas eram relaparotomizados, sofriam colotomia transversa total esquerda à 2,0 cm da reflexão peritoneal e anastomose em plano único, extra-mucoso. As aferições foram realizadas nop tereciro e sétimo dias de pós-operatório. Ressecava-se 4,0 cm do cólon esquerdo contendo a anastomose e media-se a pressão de ruptura. Realizou-se estudo histopatológico, empregando-se a coloração do Sirius-red e análise da concentração de colágeno através de método computadorizado. Verificou-se que a capacidade de suportar pressão aumentou com o tempo de evolução de forma semelhante nos dois grupos. A concentração de colágeno foi menor no grupo com peritonite no terceiro dia (p = 0,000168) e no sétimo dia (p = 0,0020). Os percentuais de colágeno I e III foram semelhantes no terceiro dia. Já no sétimo dia, no grupo peritonite predominou o colágeno tipo III ( p = 0,000079). Os resultados analisados demonstram que existe diminuição da concentração e da maturação do colágeno nas anastomoses colo-cólicas realizadas quando existe peritonite porém esta alteração não interfere na capacidade da anastomose suportar pressão.

DESCRITORES: Cicatrização de feridas. Cólon. Peritonite.

Biondo-Simões ML, Greca FG, Bryk Junior A, Komatsu MCG, Bittencourt FO, Greca LM. Influence of peritonitis on the synthesis of collagen of the distal colon: experimental study in rats. Acta Cir Bras 2000; 15(supl 3): 69-73.

SUMMARY: The purpose of the present study was to evaluate the burst strength and the collagen concentration in a left colonic anastomosis when peritonitis was present. Forty Wistar male rats were used, with a mean age of 120 days and a mean weight of 302 g. The animals were allocated in two groups of 20 animals each: a control group and an experimental group. Under ether anesthesia, the rats of the experimental group were submitted to a laparotomy and the abdominal sepsis was induced according to the Wichterman method, while those in the control group were submitted to laparotomy and manipulation of the intestinal segments involved in the experiment. Twenty four hours later, the animals underwent to a new laparotomy and a left colonic anastomosis, with a single layer of polypropilene interrupted suture, 2,0 cm above the peritoneal reflection. On the 3^rd and 7^th post-operative day, the colonic segment with the anastomosis was resected in order to evaluate the bursting strength . The Red Sirius dye was used to evaluate collagen concentration in the histopathological study. Results showed in both groups an increase in the bursting strength , relating to post-operative day. Collagen concentration was poorer in the peritonitis group on the 3^rd and 7^th post-operative days (p = 0.000168) (p = 0.0020) respectively. The percentages of collagen I and III were similar on the 3^rd post-operative day. On the 7^th day, however, collagen type III (p =0.000079) predominated in the peritonitis group. The results above showed that the concentration and maturation of collagen are reduced in a colonic anastomosis performed when peritonitis is present. These alterations does not interfere in the bursting strength.

SUBJECT HEADINGS: Wound healing. Colon. Peritonitis.

INTRODUÇÃO

Diversos fatores, locais ou sistêmicos, entre eles a peritonite podem influenciar adversamente o processo de cicatrização de anastomoses intestinais. A diminuição da resistência mecânica da parede intestinal, medida através da tensiometria ou da manometria, quando existe infecção peritoneal, tem sido relatada por muitos pesquisadores^{1,6,10,11,15,24} .

A sepsis continua a ser o maior problema em pacientes cirúrgicos e a maior responsável pela morte em pacientes com trauma e que sobrevivem ao período de ressuscitação.

Bohnen e col. (1983) apresentaram 176 pacientes com peritonite. Destes, 67 (38%) morreram. A peritonite pós-operatória foi descrita em 60 pacientes (34,1%). A taxa de mortalidade nestes pacientes foi de 60%. A presença de peritonite fecal levou 73% dos pacientes à morte⁴.

Golub e col. (1997) relatam 6,8% de mortalidade em pacientes sem deiscência de anastomose contra 37% em pacientes com deiscência (p<0,0001), ou seja a chance do paciente morrer por deiscência de anastomose aumentou nesta experiência em 5,4 vezes⁷.

Existe o conceito, geralmente aceito, de que a diminuição da resistência está relacionada à diminuição da concentração de colágeno^3,6,11,18. Contudo, alguns pesquisadores argumentam que a concentração pode não ser tão importante quanto a organização do colágeno^9,18,21.

Há mais de um século sabe-se que a resistência mecânica da anastomose intestinal reside na rede de fibras colágenas localizadas na submucosa. Graham e col. (1992) demonstraram através de análise bioquímica que na parede intestinal normal, 68% deste colágeno é do tipo I, 20% do tipo III e 12 % do tipo V².

Muitos mecanismos são postulados para explicar a diminuição da resistência e da concentração do colágeno nas situações sépticas. O colágeno é solubilizado pela enzima colagenase⁵. Enzimas colagenolíticas derivadas das bactérias participam da degradação do colágeno e contribuem para a rápida perda da estrutura do colágeno¹². A reação inflamatória é potencializada pelas proteases dos neutrófilos e pelos radicais livres derivados do oxigênio^16,23.

Para Ahrendt e col. (1994) a sepsis enfraquece a cicatrização e isto é refletido pela diminuição da capacidade da anastomose suportar pressão e pela diminuição do conteúdo de colágeno¹. Estes mesmos autores, em 1996 observaram que a regulação da expressão dos genes que regulam a síntese dos colágenos tipo I e III está alterada em situações de sepsis intra-peritoneal e que esta alteração contribui para enfraquecer a síntese do novo colágeno e diminuindo a resistência mecânica dos cólons².

O objetivo do presente estudo foi verificar a relação entre a concentração de colágeno e a capacidade de suportar pressão, nas anastomoses feitas no cólon esquerdo de ratos quando existe infecção peritoneal.

MÉTODOS

Utilizaram-se 40 ratos machos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia) da linhagem Wistar-TECPAR, com idade entre 110 e 130 dias e peso médio de 302 g divididos em dois grupos de 20 animais que compuseram os grupos controle e peritonite.

Sob anestesia inalatória de éter etílico, pesavam-se e identificavam-se os animais. A seguir depilava-se a parede abdominal ventral e realizava-se laparotomia mediana de 4 cm. Nos ratos do grupo peritonite obteve-se infecção através do método de Wichterman e col. (1980)²⁵ que consiste em uma ligadura parcial do cecum imediatamente abaixo da prega triangular íleo-cecal com o objetivo de aumentar a pressão dentro deste segmento do intestino, sem provocar isquemia e permitindo o livre trânsito do conteúdo do untestino delgado para o intestino grosso. Realizava-se a ligadura com fio de polipropileno 5-0. Em seguida perfurava-se o cecum em 10 pontos aleatórios com agulha de punção venosa 40 x 13. Realizava-se a síntese da parede abdominal com sutura em chuleio contínuo de fio monofilamentar de nylon 4-0, em 2 planos: peritônio-músculo-aponevrótico e pele. Após a recuperação anestésica devolviam-se os ratos às suas gaiolas onde recebiam água e ração padrão comercial à vontade.

Nos animais do grupo controle rrealizou-se laparotomia, manipulação do cecum e laparorrafia conforme a descrita para o grupo peritonite.

Vinte e quatro horas após a primeira operação, sob anestesia, relaparotomizavam-se os ratos, procedendo-se à colotomia transversa total esquerda, distante 2 cm da reflexão peritoneal e anastomose término-terminal, com plano único extra-mucoso, com 8 pontos separados, utilizando-se fio de polipropileno 5-0. Fazia-se a laparorrafia em 2 planos como a feita na primeira operação e após a recuperação anestésica os animais retornavam às suas gaiolas onde permaneciam recebendo água e ração à vontade até a data prevista para a aferição. O ceco não era tratado para que se mantivesse o processo infeccioso.

Realizava-se a eutanásia no 3.º e 7.º dia de pós-operatório com dose letal de éter etílico. Procedia-se a nova laparotomia e ressecava-se 4 cm do cólon esquerdo, contendo a anastomose. Submetia-se o segmento retirado a teste manométrico conforme método descrito por Cronin e Dunphy (1968)⁶.

Abria-se a peça pela borda anti-mesenterial e estendia-se o segmento do cólon sobre papel de filtro, fixava-se em formalina tamponada e encaminhava-se para estudo histopatológico corando-se os cortes com 5 micrômetros de espessura pelo Sirius red.

Analisaram-se os cortes com o uso de microscópio da marca Olimpus^® com 40 aumentos, utilizando-se filtro polarizador. As imagens captadas por uma câmera Sony colorida, foram congeladas e transformadas em linguagen binária pelo aplicativo Optimas 6.2 para Windows da Bioscan Incorporated Institute em um computador Pentium II 400 Mhz Intel MMX com placa digitalizadora de imagem Oculus TCX (Coreco). Baseado na densidade óptica dos "pixels" que formam a imagem, selecionava-se um valor limite (Threshold) que inclui "pixels" dentro da área de interesse. Nos cortes histológicos analisados determinou-se o campo microscópico sobre a área de anastomose, lendo-se 4 campos por lâmina, obtendo-se uma média.

Analisaram-se todas as lâminas sob as mesmas condições de regulagem. Calculou-se a área ocupada por colágeno e a percentagem das fibras amarelo-avermelhadas (colágeno I) e das fibras esverdeadas (colágeno III).

Procurou-se verificar a relação existente entre a quantidade de colágeno e a capacidade de suportar pressão.

Submeteram-se os resultados à análise estatística utilizando-se o teste t de student e fixou-se p ­ 0,05 como nível de rejeição da hipótese de nulidade.

RESULTADOS

Houve perda de três animais durante o experimento. Dois desses faziam parte do grupo controle do terceiro dia e um do grupo com peritonite do sétimo dia. Estes ratos morreram por falha anestésica não sendo considerados para a análise.

Na laparotomia para a confecção das anastomoses, todos os ratos do grupo peritonite mostravam-se com secreção sero-purulenta e aderências na cavidade peritoneal.

No terceiro e no sétimo dia de pós-operatório aferiu-se a pressão de ruptura. Os dados são apresentados na tabelas 1.

Da análise microscópica dos cortes histológicos, obteve-se o percentual de área cicatricial ocupado por colágeno (colágeno total) nos dois tempos e nos dois grupos, segundo a tabela 2.

Demonstram-se as porcentagens de área ocupada pelas fibras amarelo-alaranjadas (colágeno I ou maturo) nos dois tempos e nos dois grupos na tabela 3. Analisou-se ainda o percentual do colágeno imaturo (verde) nos dois tempos e nos dois grupos, na tabela 4.

As figuras 1 e 2 mostram os aspectos histológicos nos dois grupos, no sétimo dia de pós-operatório.

DISCUSSÃO

A infecção peritoneal é a causa do insucesso das anastomoses colônicas ou a deiscência das anastomoses é a causa das infecções peritoneais? Esta questão parece ainda não Ter sido resolvida. Uma coisa é certa, a morbidade e a mortalidade nestes doentes é muito alta. Schrock e col. (1973) afirmaram que a infecção contribui para o aumento de deiscências de anastomoses²². Pacientes com peritonite, abscesso ou fistula apresentam 10,5% de deiscências contra 3,7% nos sem infecção, numa relação de 2,84:1. Golub e col. (1997) mostraram que esta relação, na experiência deles era de 5,4:1⁷. Em estudo multicêntrico notificado pelo Saint Mary's Hospital, registrou-se 22% de mortalidade nos pacientes com peritonite contra 7% nos sem peritonite, mostrando relação de 3 óbitos nos pacientes com infecção peritoneal para cada um dos óbitos nos pacientes sem infecção peritoneal.

Irvin e Goligher (1973) não encontraram provas de que a infecção peritoneal contribuísse para a ocorrência de complicações anastomóticas¹⁴. Irvin e Hunt (1974) concluíram que a infecção era a causa imediata das falências das anastomoses¹⁵.

Nahai e col. (1977) observaram em experimento feito em cães que as deiscências eram precedidas de peritonite¹⁹. Mastboon e col. (1989) afirmaram que a atividade colagenolítica estaria aumentada nas anastomoses feitas em vigência de infecção¹⁷. Isto já havia sido descrito por Hawley (1973) em coelhos e por Irvin (1976) em ratos^8,13.

Minossi e col. (1994) demonstraram, em ratos, o efeito deletério da infecção peritoneal na cicatrização intestinal com o fenômeno de lise predominando sobre a síntese de colágeno no 4º, 7º e 10º dias de pós-operatório. Observaram tendência à diminuição da concentração de hidroxiprolina e da resistência¹⁸.

Infecções peritoneais localizadas parecem não afetar a evolução da cicatrização das anastomoses do cólon (4). Högströn e col. (1985) não encontraram diferenças na resistência das anastomoses ou no conteúdo de colágeno quando induziram sepsis peritoneal usando E. coli antes ou durante a operação¹¹. Van der Ham e col. (1993) produziram sepsis peritoneal com solução de fezes de rato e observaram 18,3% de mortalidade nos grupos com peritonite. O conteúdo e a resistência mostraram-se diminuídos no 4º e no 7º dia²⁴. Orlando e col. (1999) promoveram peritonite em ratos pelo método utilizado neste estudo e observaram, no 4º dia de pós-operatório que a tensiometria e o conteúdo de colágeno era semelhante nas anastomoses feitas nos animais com infecção peritoneal e nos controles. Para eles infecção peritoneal não é contra-indicação de anastomose primária²⁰.

No presente estudo, utilizou-se como modelo de sepsis peritoneal o descrito por WICHTERMAN e col. (1980). Este modelo apresenta 2 fases distintas: uma fase inicial, representada pelas primeiras 16 horas, quando o animal apresenta-se tipicamente hiperdinâmico seguida por uma fase hipodinâmica²⁵. As anastomoses foram realizadas nesta segunda fase e o foco infeccioso não foi removido para que a infecção se mantivesse.

Pode-se constatar que embora houvesse sepsis peritoneal a resistência das anastomoses foram semelhantes nos 2 grupos. A concentração média de colágeno nestas anastomoses foi maior no grupo controle no terceiro dia (p = 0,000168) e no 7º dia (p = 0,002000). Quando se analisou o tipo de colágeno, concordando com Orlando e col (1999), no 3º dia o percentual de colágeno maturo é semelhante nos dois grupos. Já no 7º dia, no grupo controle é significantemente maior ( p = 0,000079) Neste tempo o percentual da concentração de colágeno imaturo no grupo peritonite é maior ( p= 0,000079), mostrando, portanto, um atraso na maturação do colágeno. Este atraso como vimos e a menor concentração de colágeno total, não são suficientes para modificar a resistência das anastomoses ou o número de deiscências.

CONCLUSÃO

Os resultados analisados demonstram que existe diminuição da concentração e da maturação do colágeno nas anastomoses colo-cólicas realizadas quando existe peritonite porém esta alteração não interfere na capacidade da anastomose suportar pressão.

NOTAS

• 01. Ahrendt GM, Gardner K, Barbul A. Loss of colonic structural collagen impairs healing during intra-abdominal sepsis. Arch Surg 1994;129:1179-83.
• 02. Ahrendt GM, Tantry US, Barbul A. Intra-abdominal sepsis impairs colonic reparative collagen synthesis. Am J Surg 1996; 171:102-8.
• 03. Berman IR, Grosfeld JL, Adelman BA, Rapp RJ. Influence of local and systemic factors on survival with fecal peritonitis. Surg Forum 1974; 25:367-9.
• 04. Bohnen J, Boulanger M, Meakins JL, McLean Ap. Prognosis in generalized peritonitis. Relation to cause and risk factors. Arch Surg 1983; 118:285-90.
• 05. Chowcat NL, Savage fj, Hembry RM, Boulos PB. Role of collagenase in colonic anastomoses a reappraisal. Br J Sur 1988; 75:330-4.
• 06. Cronin K, Dunphy JE. Specific activity of hydroxyproline-tritium in the healing colon. Surg Gynecol Obstet 1968; 126:1061-5.
• 07. Golub R, Golub RW, Cantu Jr R, Stein HD. A multivariate analysis of factors contributing to leakage of intestinal anastomoses. J Am Col Surg 1997; 184:364-72.
• 08. Hawley PR. Causes and prevention of colonic anastomotic breakdown. Dis Colon Rectum 1973; 16:272-6.
• 09. Hendriks T, Mastboom WJB. Healing of experimental intestinal anastomoses: parameters for repair. Dis Colon Rectum 1990; 33:891-901.
• 10. Hesp FLEM, Hendriks TL, Lubbers EC, DeBoer HHM. Wound healing in the intestinal wall. Effects of infection on experimental ileal and colonic anastomoses. Dis Colon Rectum 1984; 27:462-7.
• 11. Högström H, Haglund U. Post-operative decrease in suture holding capacity in laparotomy wounds ans anastomoses. Acta Chir Scand 1985; 151:533-5.
• 12. Högström H, Bondeson L, Haglund U. Neutrophil-induced decrease in wound margin strength after intestinal anastomosis: influence on collagen and mechanisms of granulocyte action. Eur Surg Res 1988; 20:260-6.
• 13. Irvin TT. Collagen metabolism in infected colonic anastomoses. Surg Gynecol Obstet 1976; 143:220-4.
• 14. Irvin TT, Goligher JC. Etiology of disruption of intestinal anastomoses. Br J Surg 1973; 60:461-4.
• 15. Irvin TT, Hunt TK. Pathogenesis and prevention of disruption of colonic anastomoses in traumatized rats. Br J Sur 1974; 61:437-9.
• 16. Jönsson T, Högström A. Neutrophil-dependent decrease in early wound margin strength. Arch Surg 1991; 126:1423-6.
• 17. Mastboom WJ, Hendriks T, DeBoer HH. Collagen changes around intestinal anastomoses in germ-free rats. Br J SURG 1989; 76:797-801.
• 18. Minossi JG, Naresse LE, Leite CUS, Rodrigues MAM, Angeleli MAY, Curi PR, Kobayasi S. Fecal peritonitis in the rat alterations of the distal colon wall. A biomechanical and anatomopathologic study. Acta Cir Bras 1994; 9:12-5.
• 19. Nahai F, Lamb JM, Havican RG, Stone HH. Factors involved in disruption of intestinal anastomoses. Am Surg 1977; 43:45-51.
• 20. Orlando MD, Chendrasekhar A, Bundz S, Burt ET, Moorman DW, Timberlake GA. The effect of peritoneal contamination on wound strength of small bowel and colonic anastomoses. Am Surg 1999; 65:673-6.
• 21. Ryan GP. The effect of surrounding infection upon the healing of colonic wounds. Experimental studies and clinical exoeriences. Dis Colon Rectum 1970; 13:124-6.
• 22. Schrock TR, Deveney CW, Dunphy JE. Factors contributing leakage of colonic anastomoses. Ann Surg 1973; 137:13-8.
• 23. Shandall AA, Williams GT, Hallett MB, Young HL. Colonic healing: a role for polymorphonuclear leucocytes and oxygen radical production. Br J Surg 1986; 73:225-8.
• 24. Van der Ham CA, Kort WJ, Weijma IM, Van der Ingh HF, Jeekel H. Effect of fibrin sealant on the integrity of colonic anastomoses in rats with faecal peritonitis. Eur J Surg 1993; 159:425-32.
• 25. Wichterman KA, Baue AAAE, Chaudry IH. Sepsis and septic shock - a review of laboratory models and a proposal. J Surg Res 1980; 28:189-201.

1

. Estudo realizado na Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR)

2. Professora Adjunta de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da PUCPR, Coordenadora da Disciplina de Técnica Cirurgica e Cirurgia Experimental da UFPR e Titular de Experimentação em Clínica e Cirurgia da FEMPAR. Doutora em Cirurgia Experimental pela UNIFESP-EPM.

3. Professor Titular de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da PUCPR e Professor Adjunto de Técnica Cirurgica e Cirurgia Experimental da UFPR. Doutor em Cirurgia Experimental pela UNIFESP-EPM

4. Alunos de Iniciação Científica da Disciplina de Técnica Operatória e Cirurgia Experimental da PUCPR.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Abr 2001
• Data do Fascículo
  2000