Bases para um programa de controle da artrite encefalite caprina em rebanho leiteiro

[Bases for a program of control of caprine arthritis encephalite in dairy flock]

RESUMO

Objetivou-se avaliar um programa de controle da artrite encefalite caprina (AEC), por meio de testes diagnósticos sensíveis, separação de mãe e cria após o parto e medidas de manejo, com o intuito de formar rebanho livre do vírus. Utilizou-se um total de 47 cabritos da raça Saanen, mantidos isoladamente até o resultado dos primeiros testes de reação em cadeia de polimerase nested (PCR nested) e Western Blotting (WB), com base na coleta de sangue no momento do nascimento (M0). No PCR nested, quatro animais foram positivos, no M0, e foram eutanasiados. Posteriormente, os demais 43 cabritos foram submetidos à coleta de sangue aos 60 (M60) e 270 (M270) dias de vida para realização de novos testes de WB e PCR nested, que não detectaram animais positivos. Pode-se afirmar que a metodologia adotada neste estudo foi efetiva no controle da doença, nas fases de aleitamento e pós-aleitamento, e que a combinação do sistema de manejo, a fim de propiciar diminuição de risco de transmissão horizontal, com técnicas de diagnóstico mais apuradas, como o WB e a PCR nested, é relevante para elaboração de plano estratégico de controle da enfermidade.

Palavras-chave:
manejo; lentivírus; caprino

ABSTRACT

We aimed to evaluate a program to control Caprine Arthritis Encephalitis (CAE), using diagnostic tests, separation of the mother and postpartum and other management measures, in order to form a free flock of the virus. We used a total of 47 Saanengoats in isolation until the results of the first nested Polymerase Chain Reaction (nested PCR) and Western Blotting (WB) tests, based on blood collection at the time of birth (M0). In the nested PCR, 4 animals were positive, at M0, and were eliminated. Later, the other 43goats were submitted to blood collection at 60 (M60) and 270 (M270) days of life to perform new tests of WB and nested PCR, which did not detect positive animals. We can affirm that the methodology adopted in this study was effective in the control of the disease, in the phase of breastfeeding and post-breastfeeding, and that the combination of the management system, which allows a reduction of risk of horizontal transmission, with more accurate diagnostic techniques, such as WB and nested PCR, is relevant for the elaboration of a strategic plan for the disease control.

Keywords:
management; lentivirus; caprine

INTRODUÇÃO

A artrite encefatite caprina (AEC) é enquadrada como uma das lentiviroses de pequenos ruminantes (LVPR) e tem como agente etiológico um vírus da família Retroviridae, subfamília Orthoretovirinae, gênero Lentivirus (International Committee on Taxonomy of Viruses, 2017), conhecido como o vírus da AEC ou CAEV. As medidas de controle e erradicação da AEC são complexas, onerosas e laboriosas, principalmente pela ocorrência de animais infectados assintomáticos, pela detecção tardia de animais soropositivos, pela inexistência de vacinas eficazes, pela presença de animais nos rebanhos falso-negativos e pela ampla disseminação da enfermidade nos rebanhos, principalmente em rebanhos leiteiros (Lara, 2008). Por essas razões, a importância do diagnóstico precoce é ressaltada (Pinheiro et al., 2003).

Uma medida de controle e acompanhamento do status sanitário do rebanho é a realização de testes sorológicos para diagnosticar a AEC. Esses devem ser preferencialmente repetidos a cada semestre, devendo ser realizados em animais com mais de quatro meses de idade (Souza, 2014). No entanto, mesmo com a realização periódica de testes sorológicos, a presença de animais falso-negativos no rebanho é um grande entrave para a consolidação de programas de controle da enfermidade (Castro et al., 2002). Por isso, há a necessidade do uso de testes diretos, como a reação em cadeia de polimerase (PCR) (Konishi et al., 2011), que é capaz de estabelecer um diagnóstico precoce e ampliar a sensibilidade de detecção de animais positivos (Pinheiro et al., 2012).

Considerando-se que não há tratamento nem vacina para essa enfermidade (Callado et al., 2001), é importante impedir a disseminação do CAEV nos rebanhos, mediante a realização periódica de testes de diagnóstico, os quais são essenciais para a implantação e a manutenção de programas de controle (Pinheiro et al., 2003). O objetivo deste estudo foi avaliar um programa de controle da AEC, a partir da utilização de testes diagnósticos sensíveis, da separação de mãe e cria imediatamente após o nascimento e de outras medidas de manejo, com o intuito de formar rebanhos livres do vírus.

MATERIAL E MÉTODOS

Esta pesquisa foi realizada após submissão dos protocolos experimentais e aprovação pela Comissão de Ética no Uso de Animais (Ceua) da Universidade Estadual Vale do Acaraú, com o número de protocolo 014.12. Os cabritos utilizados neste estudo foram provenientes de um rebanho leiteiro pertencente à Embrapa Caprinos e Ovinos, localizada no município de Sobral, região semiárida do sertão nordestino. No rebanho era adotado um programa de controle da enfermidade, no qual os animais eram submetidos aos testes de imunodifusão em gel de ágar (IDGA), ensaio imunoenzimático (ELISA) e Western Blotting (WB) quadrimestralmente, sendo separados em grupos de animais soropositivos e soronegativos conforme o diagnóstico. As cabras eram divididas em grupos distintos, de forma a ocorrer três estações de parição no rebanho anualmente. O sistema de acasalamento adotado no rebanho é a monta natural controlada, sendo as cabras soronegativas cobertas por reprodutores soronegativos e as cabras soropositivas por reprodutores soropositivos. Os animais soronegativos foram obtidos de dois resultados negativos seguidos, nas três provas de diagnóstico (IDGA, ELISA e WB).

Neste estudo, acompanhou-se um período de parição de cabritos da raça Saanen em agosto de 2013. Todos os procedimentos dos partos foram rigorosamente assistidos, realizando-se a separação imediata dos animais recém-nascidos das mães, no intuito de não permitir nenhum contato entre ambos. Todos os animais utilizados como progenitores foram soronegativos para AEC.

Imediatamente após o nascimento, foi coletada uma amostra de sangue dos 47 cabritos para realização dos testes de WB e reação em cadeia de polimerase nested (PCR nested). A coleta de sangue ocorreu antes de os animais mamarem o colostro termicamente tratado (56°C, por 60 minutos). Todos os cabritos permaneceram isolados individualmente até o resultado dos exames. Os animais que tiveram resultados positivos, em pelo menos um dos testes, foram eutanasiados, e somente os animais negativos, nos dois testes, foram agrupados, formando-se, assim, um rebanho, que foi acompanhado até os 270 dias de idade. Salienta-se que esse rebanho permaneceu totalmente isolado dos demais animais da fazenda no decorrer da pesquisa.

Durante todo o estudo, realizaram-se três coletas de sangue, sendo a primeira no nascimento (M0), a segunda aos 60 dias (M60) e a terceira aos 270 dias de idade (M270). A coleta foi realizada por meio da venipunção da jugular, usando-se tubos tipo Vacutainer^® de 10mL, com EDTA e sem anticoagulante. As amostras de sangue foram encaminhadas ao Laboratório de Imunodiagnóstico da Embrapa Caprinos e Ovinos, onde aquelas sem anticoagulante foram centrifugadas a 3000g, e os soros obtidos armazenados e congelados a -20°C até a realização do teste de WB.

As amostras de sangue com anticoagulante foram centrifugadas a 1500g, para obtenção das camadas de leucócitos, que foram tratadas com cloreto de amônio, segundo metodologia de Karanikolaou et al. (2005). A extração de DNA realizou-se por meio da metodologia de Grimberg et al. (1989). A quantificação e a avaliação da qualidade do DNA extraído foram realizadas por leitura da espectrofotometria a 260 e 280nm. Na sequência, as amostras foram armazenadas a -20ºC até o momento da realização do teste de PCR nested.

Para a realização da PCR nested, os iniciadores desenhados foram: CAEV1 = 5’CAAGCAGCAGGAGGGAGAAGCTG3’; CAEV2=5’TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC3 (posição genômica 1249 - 1226) descritos por Barlough et al. (1994), resultando na amplificação de um fragmento de DNA de 296pb. O produto dessa amplificação foi, então, reamplificado com iniciadores internos CAEV3=5’GTTCCAGCAACTCGAAACAGTAGCAA TG-3’ (posição genômica 997 - 1024) e CAEV4 = 5’ACCTT TCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC 3’ (posição genômica 1181 - 1154), a fim de obter-se um fragmento-alvo final de 185pb (Rimstad et al., 1993). As reações de PCR foram realizadas em volume total de 50µL, contendo 10mM de Tris-HCl (pH 8,0), 50mM de KCl, 1,5mM de MgCl2, 100µM de cada dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 20pmoles de cada iniciador, 2,0 U Taq DNA polimerase e 3µL do DNA molde. Os ciclos foram constituídos de uma desnaturação inicial a 94°C, por 5min, e 35 ciclos com desnaturação a 94°C, por 5min, hibridização a 63°C, por 1min, e extensão a 72°C, por 45 segundos. Realizou-se uma extensão final de 72ºC, por 7min (Andrioli et al., 2006).

Para leitura dos resultados da PCR, realizou-se eletroforese em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio. Em todas as corridas, foram utilizados controles negativos (células de MSC não infectadas), controles positivos (células de MSC infectadas) e os controles de reagentes (H₂O bidestilada, autoclavada, livre de DNAse) (Andrioli et al., 2006). As amostras amplificadas por PCR foram purificadas após eletroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão ("low melting point") a 1%, por meio do kit de extração, conforme instruções do fabricante.

O teste de WB seguiu o protocolo de Pinheiro et al. (2011), realizando-se eletroforese SDS-PAGE com géis de concentração e separação a 4% e 12,5%, respectivamente. Em seguida, ocorreu a transferência passiva das proteínas contidas no gel para a membrana de nitrocelulose (Protan^® - 0,45µm - Amersham Cat. nº 10600002). A membrana foi previamente bloqueada com PBS Tween a 0,3%. O imunodiagnóstico foi realizado com diluições de soro de 1:50 e conjugado rabbit anti-goat IgG peroxidase (Sigma^® Cat. A5420) de 1:15000. A revelação das bandas de proteína ocorreu ao abrigo da luz, com os substratos 4-cloro-1-naftol e 3,3’ diaminobenzidina (DAB), com H₂O₂ a 30% e a reação inibida com adição de água destilada. Realizou-se estatística descritiva dos dados na forma de porcentagem simples, para demonstrar as quantidades de animais detectados como positivos e negativos, para cada teste diagnóstico realizado.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste estudo, um total de 47 animais foi inicialmente utilizado. Destes, 8,5% (4/47) foram positivos no M0, no teste de PCR nested, e eutanasiados. No M60 e no M270, nenhum dos 43 animais foi positivo pela técnica de PCR nested. Durante todo o experimento, o teste sorológico utilizado (WB) não detectou animais soropositivos (Tab. 1).

Tabela 1
Valores reais e percentuais de positividade e negatividade para os testes de diagnóstico da AEC (Western Blotting e PCR nested) do momento do nascimento (M0), aos 60 dias (M60) e aos 270 dias de vida (M270)

Idade	Western Blotting		PCR nested		Total de animais
	+	-	+	-
M0	0 (0%)	47 (100%)	4 (8,5%)	43 (91,5%)	47
M60	0 (0%)	43 (100%)	0 (0%)	43 (100%)	43
M270	0 (0%)	43 (100%)	0 (0%)	43 (100%)	43

O isolamento individual dos cabritos, imediatamente após o nascimento, e a retirada dos animais infectados (PCR positivo) possivelmente tenham evitado a disseminação do vírus. A técnica de PCR vem sendo utilizada com sucesso na detecção de LVPR, possuindo alta sensibilidade e especificidade (Zanoni et al., 1990). Wagter et al. (1998) afirmaram que essa técnica é bastante versátil e foi adaptada para amostras sanguíneas, de leite, sêmen e de outros tecidos, porém, em se tratando de animais em estágios iniciais da doença, as amostras de sangue são mais eficientes para a detecção do DNA pró-viral. Além disso, a PCR apresenta vantagem sobre métodos sorológicos de detecção de infecção em animais com anticorpos colostrais (Zanoni et al., 1990).

Em infecções por LVPR, diagnosticadas pela técnica de PCR, são frequentemente encontrados animais negativos nos testes sorológicos (Rimstad et al., 1993), o que demonstra uma menor sensibilidade desses métodos em comparação ao teste molecular (Cardinaux et al., 2013). Segundo Wagter et al. (1998), a técnica de PCR é capaz de detectar a infecção em 88,3% de ovinos e caprinos que são soropositivos e em 11% que são soronegativos na IDGA. No entanto, já foi demonstrada uma menor sensibilidade da técnica de PCR em comparação aos testes sorológicos (ELISA e IDGA), mesmo esse teste indicando animais infectados antes da soroconversão (Zanoni et al., 1996). A baixa carga viral no sangue é um grande desafio para a detecção de vírus pela PCR.

Além disso, como foi mostrado em cabras experimentalmente infectadas com CAEV, pode ocorrer variação da carga viral, podendo existir diferenças de resultados entre indivíduos (Zhang et al., 2000). Outrossim, uma diminuição no nível de sensibilidade da técnica de PCR foi demonstrada pelo tipo de amostra biológica utilizado no teste (Extramiana et al., 2002). Esses autores evidenciaram níveis de detecção de 83,5% para leucócitos no sangue periférico, 66,7% nas células do leite e 88% nos tecidos. Observaram, ainda, que a técnica de PCR apresentou uma especificidade de até 100% quando comparada com a IDGA. Karanikolaou et al. (2005), demonstraram que a uso da técnica de PCR em diferentes amostras biológicas manteve a especificidade em 100%.

Quanto ao fato da ocorrência de nascimento de animais positivos para a infecção, Cavalcante et al. (2013) demonstraram a presença do pró-vírus em ovócitos e no fluido uterino de três animais infectados experimentalmente, que reagiam negativamente às provas sorológicas. Isso pode ter ocorrido neste estudo, uma vez que os animais utilizados como progenitores eram soronegativos para AEC, no entanto poderiam abrigar o vírus no sistema reprodutor, e não na corrente sanguínea, favorecendo a transmissão intrauterina.

Já foi demonstrado que animais positivos representam uma importante fonte de infecção do vírus da AEC para animais sadios em um rebanho (East et al., 1993). O isolamento de animais imediatamente após o parto e a eliminação dos positivos, diagnosticados por meio de testes sorológicos e/ou moleculares, são fundamentais para um controle efetivo dessa enfermidade. Essas medidas previnem a transmissão vertical e horizontal da doença, impossibilitando a contaminação dos animais nascidos negativos (Konishi et al., 2011).

O isolamento individual dos cabritos foi muito importante, pois um comportamento muito comum nessa fase de vida dos animais e que favorece a ocorrência da transmissão horizontal relaciona-se ao hábito de cabritos jovens ficarem aglomerados e simularem o movimento de sucção de leite em diversas partes do corpo de outros animais, favorecendo a troca de secreções (Gufler et al., 2007). Souza et al. (2015) já comprovaram a presença do CAEV na saliva, o que reforça a hipótese da transmissão entre animais, principalmente nessa faixa etária, por ocasião do comportamento descrito acima. A adoção de testes diagnósticos no momento do nascimento, associados à separação dos animais positivos, possivelmente pode ter bloqueado essa rota de transmissão do CAEV.

O sucesso parcial de vários programas de controle da AEC indica que os testes disponíveis para diagnóstico dessa doença e as medidas de contenção comumente adotadas são úteis para reduzir a prevalência da infecção (Peterhans et al., 2004), mas não para a sua erradicação. Pérez et al. (2013), Rodrigues et al. (2018) e Tavella et al. (2018), com a implementação de programas estratégicos de controle das LVPR em ovinos e caprinos, conseguiram reduzir significativamente os níveis de animais soropositivos e eliminar os sintomas clínicos no rebanho, mas não conseguiram zerar a incidência sorológica.

Um caso de sucesso na erradicação do CAEV foi obtido por Konishi et al. (2011), por meio de um programa de erradicação do vírus da AEC, similar ao deste estudo, o qual consistiu em diversas medidas de manejo, como: separação imediata entre mãe e cria após o parto; fornecimento de colostro bovino; abate de animais positivos; segregação dos animais positivos e negativos; segregação de outros que tiveram contato com o rebanho com status positivo ou desconhecido; separação dos animais de forma a evitar o contato entre animais de diferentes idades; e uso de testes molecular e sorológico periodicamente.

Os resultados deste estudo mostraram um forte indicativo de que esse conjunto de estratégias de controle evitou a contaminação nos cabritos pelo vírus da AEC, pois, nos dois momentos (M60 e M270) e em ambos os testes (WB e PCR nested), nenhum dos 43 animais foi positivo. Entretanto, para confirmar o desaparecimento do vírus desse rebanho, seria necessária uma pesquisa com mais análises diagnósticas e um tempo mais prolongado, como foi descrito por Konishi et al. (2011).

CONCLUSÃO

A metodologia adotada neste estudo foi efetiva no controle da doença, na fase de aleitamento e pós-aleitamento. Salienta-se que a combinação de medidas de manejo que propiciem diminuição de risco de transmissão horizontal, com técnicas de diagnóstico mais apuradas, como o Western Blotting e a PCR nested, é relevante para elaboração de plano estratégico de controle da enfermidade.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Nov 2020
• Data do Fascículo
  Nov-Dec 2020

Histórico

• Recebido
  05 Set 2019
• Aceito
  04 Jun 2020