Hemograma e proteinograma plasmático de eqüinos hígidos e de eqüinos acometidos por abdômem agudo, antes e após laparotomia

Hemogram and plasma proteins of healthy horses and horses with acute abdomen before and after laparotomy

Hemograma e proteinograma plasmático de eqüinos hígidos e de eqüinos acometidos por abdômem agudo, antes e após laparotomia

[Hemogram and plasma proteins of healthy horses and horses with acute abdomen before and after laparotomy]

J.J. Fagliari^I; S.L. Silva ^II

^IFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da UNESP

IIPós-Graduando da FCAV/UNESP, Jaboticabal

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Foram examinados 20 eqüinos adultos, 10 sadios e 10 acometidos por abdômen agudo, submetidos à laparotomia. O exame clínico e a colheita de amostras de sangue foram realizados antes da laparotomia e diariamente, a partir da cirurgia, até o 10º dia após a intervenção. Constatou-se elevação da temperatura retal, das freqüências cardíaca e respiratória, do número de hemácias e de leucócitos, do volume globular e dos valores das proteínas plasmáticas após a cirurgia, em ambos os grupos, porém com valores mais elevados nos animais enfermos, especialmente do número de neutrófilos. O proteinograma plasmático dos eqüinos com abdômen agudo mostrou que houve elevação significativa nas concentrações de proteínas na fase aguda com maiores valores ao redor de 48 horas após a cirurgia. Os resultados indicaram que o padrão de elevação e decréscimo dessas proteínas pode ser útil na definição do prognóstico do quadro clínico de abdômen agudo e da recuperação cirúrgica dos eqüinos.

Palavras-chave: Eqüino, laparotomia, proteinograma plasmático, hemograma, abdômem agudo

ABSTRACT

Hemogram and plasma protein concentrations of healthy horses and horses affected with acute abdomen before and after laparotomy were determined to investigate if these determinations can be of help on the diagnosis and prognosis of the post-operative intercurrence. The body temperature, respiratory and heart rates, red blood cell, leukocyte and neutrophil counts, packed cell volume, and plasma protein concentrations increased after laparotomy, mainly in sick horses. Acute phase protein concentrations were higher in the horses affected with acute abdomen than in the healthy horses with the highest values detected at about 48 hours after surgery. The results suggest that determining the level of these proteins can be useful for the diagnosis and prognosis of post-operative recovery after laparotomy in healthy horses and in horses affected with acute abdomen.

Keywords: Horse, laparotomy, plasma proteins, hemogram, acute abdomem

INTRODUÇÃO

A síndrome abdômen agudo (cólica) é uma das principais causas de urgência cirúrgica em medicina veterinária. Sua patogenia pode envolver desde distúrbio discreto até mecanismos complexos que envolvem vários sistemas orgânicos (Alves, 1994). Apesar dos avanços nos métodos de diagnóstico, técnicas anestésicas e cirúrgicas e terapia pós-operatória intensiva, o índice de mortalidade permanece elevado. Considera-se que os distúrbios digestivos de eqüinos favoreçam a transferência de bactérias e endotoxinas do lúmen intestinal para a corrente sangüínea, contribuindo para a manifestação de sinais sistêmicos diversos (Krueger et al., 1986; Weiss et al., 1997).

Os estádios iniciais da reação inflamatória incluem várias alterações denominadas resposta de fase aguda (Gruys et al., 1994). No sítio inflamatório ocorrem modificações que favorecem a liberação de citocinas, resultando em respostas sistêmicas como febre, leucocitose e síntese de proteínas na fase aguda (Heindrich et al., 1990; Takiguchi et al., 1990; Godson et al., 1996). Ressalta-se a importância do proteinograma sérico em humanos para diagnóstico e monitoramento de várias enfermidades e para a identificação de focos infecciosos decorrentes de procedimentos cirúrgicos (Whicher & Dieppe, 1985).

O hemograma e o proteinograma, embora não forneçam informações específicas, podem auxiliar no diagnóstico e prognóstico de abdômen agudo (Orsini, 1991; Luna, 1994). Como a concentração plasmática de proteínas na fase aguda é diretamente proporcional ao grau de lesão tecidual ou de inflamação (Kent, 1992), espera-se que animais portadores de complicações pós-operatórias apresentem maior nível protéico (Whicher & Dieppe, 1985; Gruys et al., 1994). O fibrinogênio é a proteína plasmática mais freqüentemente analisada, porém não é a principal proteína na fase aguda dos animais (Godson et al., 1996). O fracionamento eletroforético representa um dos mais confiáveis métodos de identificação de proteínas sangüíneas (Kaneko et al., 1997). As técnicas de eletroforese mais utilizadas em medicina veterinária têm como matrizes fitas de acetato de celulose (Fagliari et al., 1983; Edinger et al., 1992) ou filmes de agarose (Keay & Doxey, 1982; Matthews, 1982), as quais apresentam valor limitado porque permitem o fracionamento de apenas cinco a sete grupos de proteínas. Gordon (1995) relatou que a técnica de eletroforese em gel de acrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) é relativamente simples e de baixo custo, possibilitando a visualização de concentrações protéicas extremamente baixas e a identificação de 20 a 30 proteínas, necessitando micro-quantidade de amostra. Utilizando essa técnica Fagliari et al. (1997) identificaram 19 frações no proteinograma sérico de eqüinos com laminite.

O objetivo do presente estudo foi verificar possíveis alterações no hemograma e proteinograma plasmático de eqüinos sadios e de eqüinos acometidos por abdômen agudo submetidos à laparotomia, investigando se tais procedimentos podem auxiliar no diagnóstico e prognóstico de intercorrências no pós-operatório.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram examinados 20 eqüinos adultos, de diferentes raças e sexo, pertencentes ou atendidos no Hospital Veterinário Governador Laudo Natel, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias-UNESP-Campus de Jaboticabal, os quais constituíram dois grupos experimentais: grupo 1: eqüinos hígidos submetidos à laparotomia após jejum de 12 horas e manipulação cuidadosa de alças intestinais (controle, 10 animais); grupo 2: eqüinos acometidos por abdômen agudo, submetidos à laparotomia para correção de torção de cólon maior (três animais), compactação de cólon maior (cinco animais) e encarceramento nefro-esplênico de cólon maior (dois animais).

A incisão abdominal foi realizada na linha branca, após a tranqüilização do animal com 0,1mg de acepromazina (Acepran, Univet, São Paulo-SP)/kg de peso corporal (PC), via intravenosa (IV), provocação de decúbito com 110mg de éter gliceril guaicol (Eter Gliceril Guaiacol, Henrifarma, São Paulo-SP)/kg PC, via IV, indução anestésica com 12,5 mg de tiopental sódico (Tiopental sódico, Squibb, São Paulo-SP )/kg PC, via IV, e manutenção com halotano (Halotano, Cristália, Itapira-SP) diluído em oxigênio, administrado em circuito fechado a 1,5 concentração alveolar mínima. Ao longo da cirurgia os animais de ambos os grupos receberam infusão intravenosa contínua de solução fisiológica. Durante o pós-operatório de sete dias os animais receberam estreptomicina e penicilina (Agrovet, Squibb, São Paulo-SP), na dose de 22.000 UI de penicilina/kg PC/12h, via intramuscular (IM), e gentamicina (Gentocin, Schering-Plough, São Paulo-SP), na dose de 6,6 mg/kg PC/24h, via IM. Todos os animais foram submetidos ao exame clínico (Speirs, 1997) diário, às 8 e 17 horas. As características avaliadas incluíram temperatura retal, elasticidade cutânea, coloração das membranas mucosas ocular e oral, características das fezes, motilidade intestinal, tempo de preenchimento capilar, qualidade do pulso da artéria maxilar externa e freqüências cardíaca e respiratória.

As amostras de sangue foram obtidas mediante punção da veia jugular, em 11 momentos - imediatamente antes da laparotomia e diariamente a partir da cirurgia, até o décimo dia pós-operatório. No entanto, para a confecção das tabelas foram utilizados os resultados obtidos em apenas seis momentos – imediatamente antes da realização da laparotomia e 24 horas, 48 horas, 72 horas, 7 dias e 10 dias após, excluindo-se os demais momentos. Tal procedimento possibilitou a elaboração de tabelas com resultados mais objetivos e claros, sem prejuízo da análise geral. Para a realização do hemograma foram utilizadas amostras de sangue colhidas em frascos contendo ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA). As contagens de hemácias e leucócitos foram realizadas em hemocitômetro e os esfregaços sangüíneos foram corados pelo método de Wright (Jain, 1986) e utilizados para contagem diferencial de glóbulos brancos. A concentração plasmática de proteína total foi determinada por refratometria. Para o fracionamento das proteínas utilizou-se eletroforese em gel de acrilaminada contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), conforme técnica descrita por Laemmli (1970). Após fracionamento o gel foi corado durante 10 minutos em solução de azul de coomassie, constituída de metanol (50%), água (40%), ácido acético glacial (9,75%) e azul de coomassie (0,25%). Em seguida o gel foi colocado em solução de ácido acético a 7% para retirar o excesso de corante, até que as frações protéicas se apresentassem nítidas. As concentrações dessas proteínas foram determinadas em densitômetro computadorizado (Shimadzu CS 9301, Tóquio-Japão). Como referência utilizou-se uma solução marcadora (Sigma, St. Louis-MO, Estados Unidos) com pesos moleculares 29.000, 45.000, 66.000, 97.400, 116.000 e 205.000 daltons (D), além de proteínas purificadas⁸ – albumina, IgG, haptoglobina, a₁-antitripsina e transferrina.

Para análise estatística utilizou-se o programa de computador Statistical Analysis System (Statistical..., 1995). Optou-se por um delineamento inteiramente ao acaso, com dois grupos submetidos a avaliações em seis momentos. Quando se constatou significância entre grupos e momentos aplicou-se o teste Tukey para comparação das médias.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As causas incriminadas na etiologia do abdômen agudo dos eqüinos do grupo 2 foram torção de cólon maior (três animais), compactação de cólon maior (cinco animais) e encarceramento nefro-esplênico de cólon maior (dois animais). O período pós-operatório transcorreu sem intercorrência que fizesse supor infecção bacteriana secundária à doença ou ao ato cirúrgico.

Na Tab.1 são apresentados os valores relativos às freqüências cardíaca e respiratória, ao tempo de preenchimento capilar e à temperatura retal de eqüinos sadios e dos acometidos por abdômen agudo, ao longo de 10 dias após a laparotomia. Como não houve diferença significativa entre os valores obtidos durante os exames clínicos realizados de manhã e à tarde, decidiu-se pela apresentação dos dados obtidos no exame matinal. Todas as características dos eqüinos sadios elevaram-se a partir da cirurgia, retornando à faixa de normalidade inicial uma semana após o procedimento cirúrgico. Os maiores valores aferidos para as freqüências cardíaca e respiratória e para a temperatura retal foram constatados entre 48 e 72 horas após a laparotomia e devem-se, possivelmente, à liberação de mediadores inflamatórios em decorrência da cirurgia, como relataram Heindrich et al. (1990) e Gruys et al. (1994). A dor deve ter contribuído para os quadros de taquicardia e taquipnéia. Em comparação com os animais sadios essas características apresentaram valores mais elevados, provavelmente devido à ação de bactérias e endotoxinas presentes em maior quantidade no sangue, durante os episódios de abdômen agudo, como verificaram Krueger et al. (1986) e Weiss et al. (1997). Notou-se que após a laparotomia e correção da causa desencadeante do quadro clínico os valores diminuiram e alguns atingiram a faixa da normalidade.

Os resultados do eritrograma estão apresentados na Tab.2. Verificou-se que as maiores contagens de hemácias e do volume globular ocorreram nas primeiras 48 horas de estudo, sugerindo hemoconcentração decorrente de desidratação. O desequilíbrio hídrico foi verificado somente nos eqüinos acometidos por abdômen agudo. A partir de 72 horas após a laparotomia notou-se decréscimo do número de hemácias, possivelmente em virtude da perda sangüínea durante o ato cirúrgico e o restabelecimento da volemia. Os eqüinos sadios apresentaram leucocitose por neutrofilia, com desvio à esquerda, a partir de 24 horas após a laparotomia, com maior valor 48 horas após o procedimento (Tab. 3). Os animais doentes manifestaram leucocitose por neutrofilia, com desvio à esquerda, desde a fase pré-cirúrgica com diminuição gradativa e contínua a partir de 72 horas após a laparotomia indicando, à semelhança das características clínicas, que o controle ou eliminação da causa de abdômen agudo minimizou a disfunção orgânica associada à enfermidade. Comentários semelhantes são válidos para as contagens de neutrófilos segmentados, neutrófilos bastonetes e monócitos. Verificou-se que a contagem de linfócitos foi menor em eqüinos enfermos. Não é rara a ocorrência de linfopenia em casos de neutrofilia decorrente de infecção bacteriana ou toxemia (Jain, 1986), como acontece comumente em casos de abdômen agudo (Orsini, 1991; Alves, 1994; Luna, 1994).

Durante toda a fase experimental a concentração de proteínas plasmáticas foi significativamente maior em eqüinos doentes do que nos sadios, com maior valor 24 horas após a cirurgia (Tab.4). Notou-se que 72 horas após a laparotomia a proteinemia decresceu contínua e gradativamente até o final do estudo, em ambos os grupos de animais. A técnica SDS-PAGE permitiu o fracionamento de 24 proteínas plasmáticas de eqüinos hígidos, cujos pesos moleculares (PM) variaram de 24.000 a 340.000 daltons. Os animais acometidos por abdômen agudo apresentaram outras três proteínas de pesos moleculares 77.000, 63.000 e 58.000 D. Estudos nos quais foram utilizadas como matriz fitas de acetato de celulose (Edinger et al., 1992; Fagliari et al., 1983) ou filmes de agarose (Keay & Doxey, 1982; Matthews, 1982) relatam a identificação de apenas cinco a sete bandas de proteínas. A análise dos traçados obtidos em gel de acrilamida indica que as proteínas que mais precocemente se elevaram em eqüinos sadios, com valores significativamente superiores às demais, apresentaram pesos moleculares de 128.000 D (ceruloplasmina) e 105.000 D (proteína C-reativa), cujos percentuais de elevação 24 horas após a laparotomia, em relação ao momento anterior à cirurgia, foram 143,1% e 138,4%, respectivamente (Tab. 5 e Fig. 1). O mesmo ocorreu no caso de eqüinos acometidos por abdômen agudo, nos quais tais percentuais em relação aos eqüinos sadios não operados foram 274,7% e 349,8%, respectivamente (Tab. 6 e Fig. 2). A haptoglobina (PM= 47.000 D) apresentou o menor percentual de elevação dentre os animais sadios, com valor máximo de 7,4% 48 horas pós-cirurgia. A proteína com menor acréscimo em eqüinos doentes foi a glicoproteína ácida, cujo percentual máximo de 33,8% foi alcançado 24 horas após a laparotomia. Os acréscimos de fibrinogênio (PM= 340.000 D), a₁-antritripsina (PM=61.000 D ) e glicoproteína ácida (PM= 43.000 D) mostraram percentuais de elevação intermediário em animais sadios, porém, com valores máximos tão importantes quanto 56,3%, 35,0% e 20,5%, respectivamente. Os eqüinos doentes apresentaram percentuais de elevação intermediários de fibrinogênio, a₁-antitripsina e haptoglobina, com valores máximos de 100,1%, 122,1% e 87,9%, respectivamente. Os maiores percentuais de elevação constatados em eqüinos acometidos por abdômen agudo deveu-se, possivelmente, aos transtornos metabólicos já descritos.

Como citado anteriormente, ao se comparar os traçados eletroforéticos dos eqüinos sadios com os dos doentes constatou-se que todos os animais acometidos por abdômen agudo apresentaram três proteínas não encontradas no proteinograma dos sadios e que merecem estudo adicional para identificá-las mais claramente. Os pesos moleculares dessas proteínas foram 77.000, 63.000 e 58.000 D. Todas tenderam ao decréscimo ao longo do tempo, sugerindo que sua síntese requer a presença de mediadores inflamatórios, à semelhança das proteínas de fase aguda. Atualmente a indisponibilidade de várias proteínas específicas purificadas limita, como nesse caso, a interpretação do proteinograma em medicina veterinária. Fibrinogênio, ceruloplasmina, proteína C-reativa, a₁-antitripsina, haptoglobina, glicoproteína ácida e, possivelmente, as frações de pesos moleculares 77.000, 63.000 e 58.000 D são classificadas como proteínas de fase aguda (Takiguchi et al., 1990; Edinger et al., 1992; Gruys et al., 1994; Godson et al., 1996;), as quais são sintetizadas no fígado em resposta às citocinas inflamatórias (Heindrich et al., 1990; Whicher & Dieppe, 1985). Portanto, a elevação nas concentrações plasmáticas dessas proteínas indica que ocorreu resposta inflamatória estimulada pelo ato cirúrgico e, no grupo 2, pela própria doença. Há relato de que a concentração de tais proteínas se elevam em resposta à laminite induzida por dieta com alto teor de carboidratos (Fagliari et al., 1997).

Pode-se considerar que os resultados do hemograma e proteinograma apresentados sirvam como referências para eqüinos sadios e eqüinos acometidos por abdômen agudo submetidos à laparotomia, cujo pós-operatório evolui sem intercorrência. Desse modo, traçado eletroforético diferente ao apresentado, especialmente com alta concentração de proteínas de fase aguda, pode indicar presença de foco infeccioso durante o pós-operatório.

CONCLUSÃO

O hemograma e a eletroforese em acrilamida (SDS-PAGE) possibilitam detectar alterações durante o pós-operatório de eqüinos, especialmente elevação das concentrações de fibrinogênio, ceruloplasmina, proteína C-reativa, a₁-antitripsina, haptoglobina e glicoproteína ácida do plasma sangüíneo de eqüinos sadios e de eqüinos acometidos por abdômen agudo, submetidos a laparotomia. Os resultados mostraram que o padrão de elevação e decréscimo dessas proteínas de fase aguda pode ser útil na definição do prognóstico do quadro clínico de abdômen agudo e da recuperação cirúrgica dos eqüinos.

STATISTICAL analysis system: user’s guide version 6.2. Cary: SAS Institute, 1995.

Recebido para publicação em 26 de fevereiro de 2002

Recebido para publicação, após modificações, em 31 de julho de 2002

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Mar 2003
• Data do Fascículo
  Dez 2002

Histórico

• Recebido
  26 Fev 2002
• Revisado
  31 Jul 2002