Estudo anatomopatológico e imunoistoquímico da pitiose em eqüinos naturalmente infectados

Anatomopathological and immunohistochemical study of pythiosis in naturally infected horses

Estudo anatomopatológico e imunoistoquímico da pitiose em eqüinos naturalmente infectados

[Anatomopathological and immunohistochemical study of pythiosis in naturally infected horses]

J.L. Reis Jr.^1,2, R. H.G. Nogueira²

¹Escola de Veterinária da UFMG

Caixa Postal 567

30123-970 - Belo Horizonte-MG

2Bolsistas do CNPq

Recebido para publicação em 22 de maio de 2001

Recebido para publicação, após modificações, em 13 de dezembro de 2001

E-mail [e-mail].

RESUMO

O trabalho teve como objetivo comparar a técnica de Grocott metanamina de prata (GMS) com o método imunoistoquímico de streptavidina-biotina marcada (LSAB) no diagnóstico da pitiose. Fragmentos de feridas cutâneas suspeitas de pitiose provenientes de 55 eqüinos foram processados pelas técnicas de hematoxilina/eosina, GMS e imunoperoxidase (LSAB). Trinta e quatro casos foram positivos pelo GMS, dos quais 28 apresentaram imunomarcação (LSAB) positiva para Pythium insidiosum. Os seis casos restantes apresentaram diagnóstico compatível de zigomicose. Foram diagnosticados como tecido de granulação com infiltração de eosinófilos sem áreas de necrose (nove casos), tecido de granulação com infiltrado de eosinófilos e presença de áreas de necrose (sete), habronemose (quatro) e sarcóide (um). Concluiu-se que a imunoperoxidase pelo método LSAB apresenta maior especificidade no diagnóstico de infecção pelo P. insidiosum do que pelo método GMS.

Palavras-chave: Eqüino, pitiose, Pythium insidiosum, imunoistoquímica, pele

ABSTRACT

The main goals of this study were to perform an anatomopathological evaluation of equine tissue naturally infected with Pythium insidiosus and to compare the reliability of Grocott methenamine silver nitrate (GMS) and the labeled streptavidin-biotin (LSAB) techniques for the diagnosis of pythiosis. Samples of cutaneous wounds suggestive of pythiosis obtained from 55 horses were histologically studied using hematoxylin-eosin and GMS stains, and LSAB. Twenty eight, out of 34 GMS-positive samples, were LSAB-positive for Pythiuminsidiosum. The six LSAB-negative samples were apparently cases of zygomicosis. The remaining samples were diagnosed as follow: granulation tissue with eosinophilic infiltration without necrotic areas (nine cases); granulation tissue with eosinophilic infiltration and necrotic areas (seven); habronemiasis (four); sarcoid (one). In conclusion, the LSAB method was more specific for the diagnosis of P. insidiosum when compared to GMS.

Keywords: Equine, pythiosis, Pythium insidiosum, immunohistochemistry, skin

INTRODUÇÃO

A pitiose é uma enfermidade relativamente comum em eqüídeos que permanecem em contato direto com água represada como pântanos, charcos e alagados (Miller & Campbell, 1982a; Carvalho et al., 2000). Pode também acometer bovinos (Miller et al., 1985; Santurio et al., 1998), cães (Miller, 1985; Patton et al., 1996), gatos (Bissonnette et al., 1991), peixes (Khulbe et al., 1995) e humanos (Thianprasit et al., 1996; Thitithanyanont et al., 1998).

Os primeiros casos diagnosticados no Brasil foram no estado do Rio Grande do Sul (Santos & Londero, 1974). Mais tarde foram relatados no Rio de Janeiro (Carvalho et al., 2000), Paraíba (Tabosa et al., 1999), Mato Grosso (Carvalho et al., 1984), Minas Gerais (Guedes et al., 1998) e Bahia (dados não publicados), indicando que a doença está amplamente distribuída por todo o território brasileiro. Em todos os relatos há associação entre ambiente úmido e temperatura elevada, que são as condições ideais para o desenvolvimento do agente etiológico, o Pythium insidiosum (Bridges & Emmons, 1961; Miller & Campbell, 1982a; Mendoza et al., 1996).

A pitiose caracteriza-se por desencadear um processo inflamatório granulomatoso cutâneo ulcerado em mamíferos, além de desenvolver lesões arteriais (Thianprasit et al., 1996), intestinais (Purcell et al., 1994) e, menos freqüentemente, pulmonares (Goad, 1984) e ósseas (Mendoza et al., 1988). Devido à evolução rápida, os animais acometidos, caso não sejam tratados no início da afecção, geralmente entram em debilidade progressiva, que culmina com a morte (Bridges & Emmons, 1961).

Em muitas regiões do Brasil, a pitiose ainda é erroneamente diagnosticada como habronemose, uma helmintose que determina lesões cutâneas em eqüinos, cujos aspectos macro e microscópicos guardam certa semelhança aos encontrados na pitiose (Miller & Campbell, 1984; Chaffin et al., 1995; Carvalho et al., 2000). Doenças micóticas da pele comumente observadas em eqüinos, como zigomicoses, por apresentarem semelhanças macro e microscópicas com pitiose, agregam dificuldades para o diagnóstico, daí a necessidade da utilização de técnicas com maior especificidade para a feitura do diagnóstico definitivo (Bissonnette et al., 1991; Mendoza, 1998).

O presente trabalho teve como objetivos realizar estudo anatomopatológico da pitiose em tecidos de eqüinos naturalmente infectados e comparar a técnica de imunoistoquímica (IHQ) com a de Grocott metanamina de prata para a detecção do P. insidiosum

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 55 casos de feridas em eqüinos, localizadas principalmente nas regiões ventrais, todos suspeitos de afecções cutâneas como pitiose, habronemose, zigomicose ou de tecido de granulação. Destes, 33 fazem parte do acervo do setor de patologia da Escola de Veterinária da UFMG, sendo provenientes da região de Belo Horizonte e municípios vizinhos, com exceção de quatro, oriundos da Bahia. Os outros 22 casos pertencem ao acervo existente no setor de patologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense, tendo como origem cidades da região Norte Fluminense (Campos dos Goytacazes e Quissamã).

Os fragmentos de tecidos colhidos das lesões suspeitas foram fixados em formalina tamponada a 10%, desidratados e incluídos em parafina (Prophet et al., 1991). Os blocos foram cortados com espessura de 4µm corados pela HE e pela coloração especial de Grocott metanamina de prata (GMS). O uso do GMS teve o objetivo de visualizar formas inespecíficas de estruturas filamentosas (hifas) de P. insidiosum e de fungos zigomicetos.

As lâminas destinadas a IHQ foram previamente untadas com solução de 3-aminopropyltricthoxy-silane (Silane – Sigma (n^o A-3648)) a 2% diluída em acetona, cuja função era formar uma película sobre a lâmina para aumentar a aderência dos cortes. Utilizou-se a imunoperoxidase, método streptavidina biotina marcada (Large volume Dako LSAB2 kit Peroxidase Universal K675. Dako Corporation Carpinteria, CA 90013 USA) (LSAB) de acordo com Gimeno et al. (1999). Todos os casos positivos ou negativos pelo GMS foram submetidos a LSAB, que marca especificamente as hifas do P. insidiosum (Brown et al., 1988).

O anticorpo primário (Cedido pelo Dr. Joe Newton, Ausburn, Alabama, USA) foi diluído em solução tampão (PBS) acrescido de albumina sérica bovina a 0,1%. Nas primeiras baterias foram testadas diluições de 1:400, 1:200, 1:100 e 1:50. O tempo de revelação em solução diaminobenzidina (Peroxidase substrate Kit DAB Sk – 4100. Vector Laboratories, Icc. Burlingame, CA 94010) (DAB) foi inicialmente testado e avaliado ao microscópio óptico com 2 min, 1,5min, 1,0min e finalmente 45s. Nas baterias subseqüentes passou-se a utilizar o anticorpo primário na diluição de 1:50 e o tempo de revelação no DAB de 45s. O protocolo para a LSAB utilizado neste trabalho foi adaptado de Gimeno et al. (1999).

Neste trabalho foram utilizados dois casos com marcação positiva para anticorpos fluorescentes anti-P. insidiosum e negativos para anticorpos (imunoperoxidase) anti-zigomicetos Conidiobo-lus coronatus e Basidiobolus haptosporus, que serviram como controle positivo. Estas amostras foram processadas na Universidade Estadual de Michigan pelo Dr. Leonel Mendoza (Medical Technology Program, Michigan State University-USA).

A comparação entre os métodos GMS e IHQ (LSAB) foi feita pelo teste do c² (Sampaio, 1998).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dos 55 casos estudados, 34 foram positivos pelo GMS, dos quais 28 apresentaram imunomarcação positiva (LSAB) para P. insidiosum. Os outros casos positivos (seis) provavelmente são de zigomicose, sendo a marcação com anticorpos anti-zigomicetos (C. coronatus e B. haptosporus) indicada para o diagnóstico definitivo. Os vinte e um casos restantes foram diagnosticados como tecido de granulação com infiltração de eosinófilos sem áreas de necrose (nove), tecido de granulação com infiltrado de eosinófilos e presença de áreas de necrose (sete), habronemose (quatro) e sarcóide (um).

Nos casos de diagnóstico definitivo de pitiose, as lesões, em geral, localizavam-se nos membros (Figs. 1-a, b), menos freqüentemente na região lateral (Fig. 1-c) e ventral do abdome (Fig. 1-d) e na face. O tamanho e o formato eram variados, não sendo observada predileção por raça, sexo e idade. Estes achados são compatíveis com as observações de Bridges & Emmons (1961), Miller & Campbell (1982a), Mendoza et al. (1996) e Carvalho et al. (2000).

Ao exame clínico de alguns casos, constataram-se sinais de prurido na região afetada, identificados pelo fato de os animais morderem o local ou se esfregarem contra obstáculos, o que geralmente provocava auto-mutilação. As lesões constituíam-se de extensas ulcerações cutâneas, com superfície de aspecto nodular, que drenavam exsudato serossanguinolento, geralmente acompanhadas por grande aumento de volume local (Figs. 1-a, b). Ao corte, a coloração das superfícies era esbranquiçada, a consistência firme, com presença de fístulas que se comunicavam com estruturas cavitárias lembrando "galerias" (Fig. 1-e), as quais continham concreções branco-amareladas de consistência firme com aspecto de coral ("kunkers") (Fig. 1-f), quase sempre envoltas por exsudato purulento. Essa caracterização morfológica foi também citada por Bridges & Emmons (1961), Miller & Campbell (1982a), Mendoza et al. (1996) e Carvalho et al. (2000). Em alguns casos a evolução foi rápida, e em torno de 15 a 20 dias as lesões atingiam grande tamanho. Bridges & Emmons (1961) também observaram casos com características semelhantes, os quais, em geral, resultavam em debilidade acentuada.

A coloração pela HE revelou reação inflamatória cutânea com áreas focais de necrose circundadas por infiltrado acentuado de eosinófílos (Fig. 2-a), alguns dos quais já desgranulados, infiltrado neutrófílico e mononuclear, este último composto por macrófagos (Fig, 2-b), linfócitos, plasmócitos e, em alguns casos, por células gigantes de Langerhans. Ainda associado ao processo inflamatório e de forma mais abundante na periferia, observou-se tecido de granulação com proliferação exuberante de fibroblastos, fibras colágenas e neovascularização acentuada. Bridges & Emmons (1961), Miller & Campbell (1982a) e Mendoza et al. (1996) fazem menção a achados semelhantes.

Os nove casos que apresentaram somente tecido de granulação com infiltração eosinofílica, áreas de necrose e negativos para pitiose pelo GMS e pelo LSAB não permitiram diagnóstico definitivo, pois segundo Bridges & Emmons (1961), Miller & Campbell (1982a) e Mendoza et al. (1996), na pitiose e nas zigomicoses as hifas são encontradas dentro ou na periferia das áreas de necrose. Em alguns casos, a ausência de hifas possivelmente seja explicada pela ocorrência de processo reparativo com proliferação excessiva de tecido cicatricial e infiltração de eosinófilos, situação comumente observada em eqüinos devido a estímulos diversos, como processos traumáticos ou inflamatórios prévios (Yager & Scott, 1993). Como grande parte das amostras foi proveniente de material de rotina, é possível que a colheita do material não tenha contemplado as áreas de necrose, local onde são visualizadas as hifas. Bridges & Emmons (1961), ao estudarem hifomicose, como era denominada na época, observaram que diversos casos apresentavam formações exuberantes de tecido de granulação, as quais tornavam as áreas focais de necrose ("kunkers") distantes umas das outras, dificultando a colheita de amostras para biopsia com os "kunkers". Essa é a razão de se recomendar a colheita de várias amostras em diferentes locais da área lesada.

Nos sete casos que apresentaram tecido de granulação com infiltração de eosinófilos, com áreas de necrose e negativos para pitiose pelo GMS e pelo LSAB, o diagnóstico de habronemose não pôde ser descartado porque, em muitos casos, as áreas de necrose estavam presentes mas as larvas dos helmintos não foram vistas. Nos quatro casos de habronemose cutânea, o diagnóstico definitivo foi possível porque as larvas do helminto foram facilmente observadas nas áreas de necrose nos cortes corados pelo HE, achados coincidentes com os descritos por Chaffin et al. (1995) e Mathison (1995).

O caso diagnosticado como sarcóide apresentou características histológicas semelhantes às descritas por Fadok (1995). Esse tumor se inclui no diagnóstico diferencial, pois segundo Chaffin et al. (1995), apresenta características macroscópicas semelhantes, especialmente quando ocorre crescimento rápido com necrose e ulceração.

Nos 34 casos positivos pelo GMS, nas áreas de necrose evidenciaram-se estruturas filamentosas cilíndricas (hifas) de coloração verde-escura (Fig. 2-c), dispostas em sentido longitudinal, ou arredondadas quando se apresentavam transversais ao sentido de corte. Algumas hifas apresentavam-se ramificadas formando ângulos retos (Fig. 2-d) as quais, segundo Mendoza (1998) e Miller & Campbell (1982a), constituem uma característica morfológica sugestiva de P. insidiosum.

A LSAB dos 28 casos positivos revelou maior afinidade para as camadas mais superficiais da parede das hifas (Figs. 2-e, f). A diluição do anticorpo primário que apresentou melhor marcação foi de 1:50, com incubação em câmara úmida por 45min à temperatura ambiente. O tempo na solução cromógena (DAB) que mostrou melhor revelação com menor "background" foi de 45s. Brown et al. (1988) utilizaram a diluição do anticorpo primário de 1:10 com incubação em câmara úmida por uma hora à temperatura ambiente e 40min em solução cromógena.

O estudo comparativo entre os métodos GMS e LSAB foi realizado utilizando-se a técnica de comparação entre variáveis (c²) segundo Sampaio (1998) (Tab. 1). O valor calculado do c² foi de 8,08 e o valor tabelado para um grau de liberdade foi de 6,64 (P=0,01%).

Com base no teste c², pode-se dizer que a técnica de imunoperoxidase apresentou maior especificidade para a detecção do P. insidiosum em comparação com a coloração pelo GMS, achado também mencionado por Brown et al. (1988). A probabilidade de falso positivo na IHQ é pequena, uma vez que as hifas P. insidiosum apresentam moléculas antigênicas com epitopos específicos do reino Chromista, que não são encontrados nas hifas dos fungos zigomicetos conforme citam Mendoza et al. (1997). Apesar da maior especificidade observada nas técnicas de imunoistoquímica, o resultado positivo pelo GMS pode auxiliar no diagnóstico de pitiose ou zigomicose.

Anteriormente o único meio de se fazer o diagnóstico definitivo era o isolamento. Para tal, Mendoza (1998) recomenda a colheita e o envio rápido das amostras de tecidos ao laboratório porque P. insidiosum é extremamente sensível à refrigeração prolongada (4°C). Caso isso não seja possível, no campo, deve-se colher somente os "kunkers", submetê-los a várias lavagens com água destilada esterilizada e uma última com água destilada adicionada de estreptomicina para evitar contaminação bacteriana, cortá-los em fragmentos menores e incuba-los em ágar sabouraud dextrose (SDA) a 37°C, durante 24-48h. Colônias planas e claras, com cerca de 20mm de diâmetro deverão crescer em aproximadamente 24h. O diagnóstico é feito observando-se zoosporos móveis, o que requer minucioso exame da cultura ao microscópio. Brown et al. (1988) mencionam que para o sucesso do diagnóstico de rotina faz-se necessário conhecer o organismo, uma vez que as hifas do P. insidiosum assemelham-se muito com as dos zigomicetos. Outro fator limitante no diagnóstico pelo isolamento é que a produção de oogônia em cultura é extremamente rara, daí serem os métodos sorológicos (Miller & Campbell 1982b; Mendoza et al.,1997) e imunoistoquímicos (Brown et al., 1988) os mais indicados pela rapidez e eficácia na identificação do agente. A IHQ é mais vantajosa porque pode ser usada em tecidos previamente fixados. Concluindo, pode-se afirmar que o LSAB apresenta maior especificidade no diagnóstico de infecção pelo P. insidosum do que pelo método GMS.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Dez 2002
• Data do Fascículo
  Ago 2002

Histórico

• Recebido
  22 Maio 2001
• Aceito
  13 Dez 2001