Prevalência da imunodeficiência severa combinada em cavalos da raça Árabe em plantéis de Minas Gerais e São Paulo

Prevalence of the severe combined immunodeficiency disease in Arabian horses raised in Minas Gerais and São Paulo-Brazil

Prevalência da imunodeficiência severa combinada em cavalos da raça Árabe em plantéis de Minas Gerais e São Paulo

[Prevalence of the severe combined immunodeficiency disease in Arabian horses raised in Minas Gerais and São Paulo-Brazil]

C.S. Teixeira¹, D.A.A. Oliveira1^*, M.Y. Kuabara²

¹Escola de Veterinária da UFMG

Caixa Postal 567

30123-970 - Belo Horizonte, MG

2Colégio Brasileiro de Reprodução Animal - CBRA

Recebido para publicação, após modificações, em 24 de abril de 2001.

RESUMO

Neste estudo foram genotipados 205 cavalos da raça Árabe, criados nos estados de Minas Gerais e São Paulo, via DNA por meio de PCR, para determinação da presença do gene mutante SCID. Os resultados mostraram 98,5% de animais normais (202/205) e 1,5% de portadores (3/205). Pela análise da genealogia dos portadores identificados pode-se, ainda, confirmar a participação de um garanhão anteriormente identificado como provável disseminador da doença.

Palavras-chave: Eqüino, Árabe, defeito genético, SCID, DNA, PCR

ABSTRACT

In the present study, 205 Arabian horses raised in Minas Gerais and São Paulo states, Brazil, were genotyped using the PCR technique. The results showed 98.5% of normals (202/205) and 1.5% of SCID carriers (3/205). Checking the pedigrees of the three carriers was possible to confirm the participation of one stallion first identified as the possible disease disseminator.

Key words: Horse, Arabian, gene defect, SCID, DNA, PCR

INTRODUÇÃO

A imunodeficiência severa combinada ou SCID (severe combined immunodeficiency disease) está inserida em um grupo de raras deficiências congênitas, caracterizadas pela ausência de um sistema imunológico funcional. A doença associa-se a um aumento da susceptibilidade à infecções, ocorrendo, em geral, nos primeiros meses de vida e levando o indivíduo à morte. É ocasionada por uma mutação que afeta as células especializadas na defesa do organismo contra infecções por vírus, bactérias e fungos (Bowling, 1996; Reed & Bayey, 1998). Estudos mostram que a SCID está presente em várias espécies, sendo reconhecidos diferentes tipos que afetam eqüinos, cães, camundongos e o homem (Bosma et al., 1983; Custer et al., 1985; de Saint Basile et al., 1995; Somberg et al., 1995; McGuire & Poppie, 1973). A SCID foi descrita pela primeira vez em cavalos da raça Árabe por McGuire & Poppie (1973). Nessa espécie a doença apresenta herança autossômica recessiva (Poppie & McGuire, 1977; Perryman & Torbeck, 1980).

Os cavalos Árabe estão entre os poucos animais domésticos que devido ao seu considerável valor econômico permitem análise completa da mortalidade neonatal. Em 1977, Poppie & McGuire avaliaram a freqüência do gene SCID em 257 potros, utilizando como critério para coleta das amostras animais com menos de seis semanas de vida, provenientes de haras norte-americanos onde não havia ocorrência de casos da doença. Foram encontrados seis animais afetados (2,3%) e 66 portadores (25,7%). Esse valor de prevalência é alto para um defeito genético, e deve ter sido resultado da introdução inicial de um pequeno número de animais nos Estados Unidos, pois eles aparecem no pedigree de muitos animais contemporâneos (Thompson et al., 1975; Poppie & McGuire, 1977; Lew et al., 1980). Uma das últimas estimativas de freqüência foi feita por Bernoco & Bailey (1998), quando foram avaliados 250 animais e encontrados 8,4% de portadores. Potros afetados têm sido identificados em muitas partes do mundo, como Canadá, Inglaterra e Austrália, apresentando as mesmas incidências. Exceção deve ser feita à Polônia, onde até agora não houve casos de potros com SCID (Jones, 1997; Shin et al., 1997).

O diagnóstico durante muitos anos foi baseado na contagem de linfócitos, ausência de imunoglobulinas e infecção crônica sem resposta ao tratamento. Devido à sintomatologia ser semelhante à de outras imunodeficiências, sempre houve grande dificuldade para identificá-las corretamente. Hoje, o teste de diagnóstico por DNA proporciona segurança na determinação do genótipo do indivíduo, uma vez que tal metodologia possui alta sensibilidade e fidelidade (Shin et al.,1997; Willer et al., 1995).

Esta pesquisa teve como objetivo avaliar animais da raça Árabe criados nos estados de Minas Gerais e São Paulo, de modo a estabelecer a incidência do gene mutante nesta amostra do plantel nacional. Pela análise do pedigree dos indivíduos portadores, procurou-se identificar o animal que disseminou o problema no país.

MATERIAL E MÉTODOS

A amostra foi composta de 205 animais da raça Árabe, todos registrados de acordo com as exigências da Associação Brasileira de Criadores de Cavalo Árabe (ABCCA), pertencentes a diversos haras localizados nos estados de Minas Gerais e São Paulo.

Todos os indivíduos tiveram sua genealogia analisada por meio de pedigrees fornecidos pela ABCCA, ou cedidos por Domenico Bernoco (Stormont Lab. Inc. - Woodland – CA) quando não enviados pela Associação Brasileira, feita por consulta aos arquivos da Arabian Horse Registry of America (AHRA).

Amostras de sangue periférico e de pêlos retirados da região da cauda ou crina do animal foram coletadas em tubos a vácuo. Os testes de diagnóstico foram realizados no laboratório de genética do Departamento de Zootecnia da Escola de Veterinária da UFMG. A extração de DNA do sangue foi realizada utilizando-se a metodologia descrita por Lewin & Stewart-Haynes (1992). Para extração do DNA de amostras de pêlo utilizou-se a metodologia do Laboratório de Genética Veterinária da Universidade da California, modificada por Yves Amigues, INRA, Jouy-en-Josas.

Os "primers" usados nesta pesquisa foram provenientes do Maxwell H. Gluck Equine Research Center, Departamento de Ciência Veterinária da Universidade do Kentucky - Lexington, KY- EUA, cedidos gentilmente por Ernest Bailey. Os primers amplificam um fragmento de 179 pares de bases, correspondente ao alelo normal e outro de 166 pares de base de comprimento, correspondente ao alelo mutante SCID. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada em termociclo da marca MJ Research, modelo PTC 100 ^TM. As reações foram feitas utilizando-se 10ml de volume final contendo 8ml de tampão de PCR (50mM KCl; 10mM Tris-HCl pH 8,3; 1,5mM MgCl_2; 0,2mM DNTPs; 0,2mM de cada primer; 0,5U Taq DNA polimerase) e 2ml de DNA genômico. Em seguida levou-se ao termociclo com o seguinte programa: 30 segundos para denaturação a 94° C, 30 segundos para anelamento a 55° C e 30 segundos para alongamento a 75° C por 30 ciclos. Foram utilizados os controles negativo ou branco sem DNA a cada amplificação, para detecção de possíveis contaminações, e os controles homozigoto afetado, homozigoto normal e heterozigoto, fornecidos pelo Maxwell H. Gluck Equine Research Center da Universidade do Kentucky (EUA), para comparação com as amostras testadas. As amostras amplificadas foram diluídas em solução de Loading Buffer 2X e formamida 50%, aquecidas a 95° C por cinco minutos em termociclo e imediatamente resfriadas em banho de gelo. Em seguida foram submetidas a eletroforese em gel PAGE (10%) para análise conforme se segue: TBE 1X (Tris 0,089M; ácido bórico 0,089M; EDTA 0,008M); poliacrilamida 10% (acrilamida 9%; bis-acrilamida 1%); PSA 10%; TEMED (20 ml); água MilliQ (qsp 30ml). O gel polimerizado foi colocado em cuba de eletroforese, onde foram aplicadas as amostras e o padrão de peso molecular (pGEM - PROMEGA). A corrida eletroforética foi realizada a 100V por seis horas. Empregou-se o método de coloração por nitrato de prata. Após a coloração, o gel foi fotografado e em seguida analisaram-se os padrões de bandas obtidos para interpretação dos resultados.

Realizados os testes, foram analisados os alelos de cada amostra. Calcularam-se as freqüências alélicas para o loco estudado, segundo o teorema de Hardy-Weinberg. Nos resultados aplicou-se um teste de dispersão de freqüência (qui-quadrado), para observação do equilíbrio da população. O grau de significância estabelecido foi de 5% (P>0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram amplificados DNA de 205 animais, mostrando dois alelos no caso de animais heterozigotos (Ss) e uma única banda, mais intensa, correspondente aos alelos normais, para os homozigotos dominantes (SS), conforme exemplificado na Fig.1. Não foram identificados animais homozigotos recessivos (ss). Um dos motivos para este resultado provavelmente está relacionado à idade dos cavalos amostrados. Nos estudos realizados por Poppie & McGuire (1977) foram analisados indivíduos com até seis semanas de vida, e nas amostras coletadas por Bernoco & Bailey (1998), a idade era de até dois meses, período no qual os sintomas da doença não são ainda evidentes, induzindo o criador a não distinguir o animal sadio do doente. Os animais utilizados neste estudo tinham mais de quatro meses de vida na data da coleta, e nessa idade os afetados já apresentam os sintomas. Normalmente os criadores, por não compreenderem a importância de tais estudos, não permitem a coleta de indivíduos que não estejam saudáveis.

Dentre os animais estudados 202 eram homozigotos dominantes e apenas três heterozigos, ou seja, portadores do gene mutante. As freqüências genotípicas observada e esperada e as freqüências gênicas na população estudada são apresentadas na Tab. 1.

Os resultados mostram que não houve diferença entre as freqüências genotípicas observada e esperada (P>0,05), portanto, a população estudada está dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg.

Em relação às freqüências obtidas por Poppie & McGuire (1977) em 257 animais, com 25,7% de portadores, neste trabalho observou-se acentuada redução na freqüência de portadores, e em comparação com os resultados de Bernoco & Bailey (1998) em um levantamento feito em 250 indivíduos, a redução foi de aproximadamente cinco vezes. Essa acentuada diferença pode estar relacionada à seleção praticada por alguns criadores, que ao detectarem o indivíduo afetado deixariam de utilizá-lo, tentando assim eliminar o problema em pontos isolados. Sem a genotipagem regular seria muito difícil estabelecer uma verdadeira barreira para a eliminação do problema até que fosse detectado o animal portador, o qual deixaria descendentes também portadores, contribuindo para a manutenção do gene mutante na população. Segundo Bernoco & Bailey (1998), esse tipo de seleção é improvável. Esses autores acreditam que as freqüências estimadas por Poppie & McGuire (1977) foram elevadas pelo fato de os criadores terem detectado o problema, apresentando voluntariamente seus animais para o estudo. Isso prejudicou a imparcialidade da amostra e, conseqüentemente, mostrou uma freqüência elevada errônea. A influência dos criadores pode também ter ocorrido nas amostras aqui analisadas, mas não se sabe se o criador deixou de enviar amostras de animais que poderiam apresentar, ou que apresentaram, algum tipo de problema. Essa hipótese pode alterar a baixa porcentagem de portadores encontradas (1,5%) neste trabalho.

No estudo realizado por Bernoco & Bailey (1998) envolvendo pedigrees de 21 cavalos Árabes norte americanos portadores do gene mutante SCID, os pesquisadores levantaram a hipótese da presença de um garanhão, muito popular nos anos 20, ao qual chamaram "sire A" (o nome do animal não pode ser divulgado a pedido da Arabian Horse Registry of America). Muito provavelmente seria ele o animal que disseminou o gene SCID. O pedigree desse animal está limitado a uma única geração, ou seja, não existem registros anteriores aos pais desse indivíduo no Registro de Cavalos Árabes Americano (AHRA). A partir dos pedigrees fornecidos pela ABCCA, procurou-se chegar ao animal que teria introduzido o problema no rebanho nacional. No pedigree dos três indivíduos identificados como portadores do gene mutante (Ss) foi possível identificar o mesmo cavalo ancestral reconhecido por Bernoco & Bailey (1998). No entanto, também por recomendação da ABCCA, o nome do animal não deve ser divulgado. Por esse motivo e apesar da pequena porcentagem de portadores identificados no presente estudo, ressalta-se a importância da implantação de um programa de controle da SCID no Brasil.

Na impossibilidade de divulgação do nome de tal animal, a ABCCA passa a ter a responsabilidade de controlar o problema no plantel nacional, recomendando, com base na análise do pedigree dos indivíduos submetidos a registro, o teste de genotipagem para todos os seus descendentes. Do mesmo modo, também é recomendável uma avaliação genética dos garanhões em atividade, especialmente aqueles aparentados com o "sire A" (ou garanhão A). Assim, poder-se-ia evitar o uso de reprodutores portadores do gene mutante, e em poucas gerações o problema praticamente desapareceria do rebanho nacional.

O custo do teste de DNA para genotipagem (aproximadamente R$100,00 por animal) é muito menor que o valor de um animal puro e, mais ainda, bem menor que as perdas econômicas devido à morte de potros afetados.

CONCLUSÕES

O gene mutante SCID (severe combined immunodeficiency disease) está presente no plantel brasileiro de cavalo Árabe, no qual foram observadas as freqüências de 98,5% para o genótipo SS (normal) e de 1,5% para o genótipo Ss (portador). Aparentemente o gene mutante SCID foi introduzido pelo mesmo ancestral já identificado em pesquisa feita nos Estados Unidos. Assim, considerando as perdas econômicas provenientes do uso inconsciente de garanhões portadores do gene mutante SCID, é recomendável a implantação de um programa de acompanhamento e controle da anomalia por parte da ABCCA, por meio de genotipagem dos descendentes do cavalo ancestral já identificado.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à valiosa colaboração da Associação Brasileira de Criadores de Cavalo Árabe (ABCCA), na pessoa do Dr. Jayme Ignácio Rheder Neto, pelas amostras e pedigrees fornecidos.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Jun 2001

Histórico

• Recebido
  24 Abr 2001