Toxina T-2 e alterações do crescimento endocondral em frangos de corte

T-2 toxin and disturbed endochondral bone growth in broiler chicken

Toxina T-2 e alterações do crescimento endocondral em frangos de corte

[T-2 toxin and disturbed endochondral bone growth in broiler chicken]

J.A.F.B. Nascimento, V.A. Nunes^*, R.M.C. Guedes, M.A. Rachid

Escola de Veterinária da UFMG

Caixa Postal 567

30123-970 – Belo Horizonte, MG

Recebido para publicação, após modificações, em 14 de maio de 2001.

RESUMO

Foi testada a habilidade da toxina T-2, produzida por Fusarium sporotrichioides Sherb e veiculada por milho experimentalmente contaminado, em induzir alterações da placa epifisária proximal do tibiotarso de frangos de corte. Pintos de um dia, todos machos e da linhagem Hubbard, foram alimentados com ração básica a base de milho e soja, na qual todo o milho foi substituído por milho contaminado, contendo exclusivamente T-2 na quantidade de 2,64mg/kg. Um outro grupo alimentado com milho não contaminado serviu como testemunha e ambos foram observados por três períodos (7, 14 e 21 dias). Independente do período e da quantidade de T-2 ingerida (0,3 a 1,9 mg/kg), o tibiotarso dos animais tratados mostrou maturação e diferenciação defectivas de condrócitos, lesões vasculares e penetração vascular da cartilagem, todas similares às da discondroplasia tibial. Conclui-se que a toxina T-2 oriunda de Fusarium sporotrichioides Sherb é capaz de induzir lesões básicas e iniciais da discondroplasia tibial em frangos de corte.

Palavras-chave: Frango de corte, toxina T-2, discondroplasia tibial

ABSTRACT

The ability of T-2 toxin from Fusarium sporotrichioides Sherb in corn culture to induce epiphyseal plate lesions in broiler chicks was tested. One group of day-old male broiler chickens (Hubbard) fed ad libitum balanced diet in which all corn was replaced by T-2 toxin (2.64mg/kg) contaminated autoclaved corn. Another group received the same diet with mycotoxin free corn, and was used as control. All groups were observed for 7, 14 and 21 days. Despite the different periods and amounts of ingested T-2 (estimated in 0.3 to 1.9 mg/kg), the tibia of treated animals presented defective maturation and poor differentiation of chondrocytes, severe vascular lesions and anomalous cartilage vascular invasion and retarded cartilage erosion with a picture similar to that of early tibial dyschondroplasia. The results indicated that the T-2 toxin produced by Fusarium sporotrichioides Sherb could induce tibial dyschondroplasia in broiler chickens.

Keywords: Broiler chicken, T-2 toxin, tibial dyschondroplasia

INTRODUÇÃO

Os tricotecenos são micotoxinas oriundas do gênero Fusarium que contaminam cereais, principalmente o milho, sendo responsáveis pela indução de intoxicações em animais domésticos e no homem (Chi et al., 1977; Khachatourians, 1990). Alguns tricotecenos já foram relacionados com alterações esqueléticas em aves, como a condrodistrofia e a acondroplasia da tíbia, mas a toxina T-2 ainda não o havia sido, embora existam suspeitas de campo de que ela possa induzir patologias do esqueleto imaturo. A literatura é farta em citações sobre a toxina T-2 provocando alterações cutâneas, pulmonares e imunossupressoras (Wyatt et al., 1973; Hoerr et al., 1981; Hoerr et al., 1982; Leesson et al., 1995), mas não locomotoras. O objetivo deste trabalho foi descrever a morfologia da placa de crescimento do tibiotarso de frangos de corte, submetidos a ração experimentalmente contaminada com toxina T-2 produzida pelo Fusarium sporotrichioides Sherb.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 30 pintos de um dia, todos machos e da linhagem Hubbard. As aves foram previamente vacinadas contra as doenças de Marek e Gumboro divididas ao acaso em dois grupos (controle e tratado) e avaliadas aos 7, 14 e 21 dias. Os animais foram alojados em baterias metálicas providas de comedouro linear, bebedouro de pressão e sistema de aquecimento, com os animais-controle ocupando o compartimento superior da bateria, afim de se evitar possível contaminação com a ração do grupo tratado.

As aves foram alimentadas com ração a base de milho e soja, formulada para atender às exigências nutricionais de frangos de corte de até 21 dias de idade (Rostagno et al., 1996). Para o grupo tratado, o milho da ração básica foi substituído por milho contaminado com toxina T-2 na concentração de 2,64 mg/kg (Nascimento, 2000). As rações e a água foram fornecidas ad libitum, medindo-se o consumo médio diário de ração. Os animais foram pesados no dia do alojamento e ao final de cada período experimental, quando cinco animais de cada grupo foram sacrificados para exame post-mortem. O tibiotarso direito colhido à necropsia foi, após fixação em formalina neutra e tamponada, descalcificado em ácido fórmico a 10%, tamponado com citrato de sódio para pH 4,5, sob vácuo moderado. Secções longitudinais da epífise-metáfise proximal foram processadas pela técnica rotineira de inclusão em parafina e coradas pela técnica de hematoxilina-eosina (HE). As secções coradas destinaram-se à descrição morfológica e à morfometria. A altura zonal e total da placa epifisária foi obtida por três medidas (central, medial e lateral), utilizando-se ocular micrométrica Olympus (SWH) e aumento de 40 . À média das três medidas obtidas foi aplicado um fator de correção, obtido com auxílio de escala micrométrica. A zona de transição (ZT) foi incluída na zona de proliferação e maturação (ZPM), dada a impossibilidade de sua mensuração isolada, e a altura total da placa foi obtida pela soma dos valores obtidos para a ZPM e para a zona de hipertrofia (ZH).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Sem provocar a morte das aves a toxina T-2 ingerida foi capaz de induzir alterações do peso e da conversão alimentar no grupo tratado (Tab. 1).

As aves do grupo tratado apresentaram ganho médio de peso numericamente menor em todos os períodos e, conseqüentemente, pior conversão alimentar. Como não era objetivo do trabalho analisar os dados de produção, a significância das diferenças entre os grupos não foi testada. Além disso, os dados foram obtidos como média, não permitindo a análise de variância.

A intoxicação crônica com doses subletais de 1, 2 e 3 mg/kg de toxina T-2 leva à perda de produtividade em frangos de corte e à indução de lesões em diversos órgãos (Sauver, 1984), sendo a severidade dose-dependente e variável com a idade dos animais (Wyatt et al., 1973; Chi et al., 1977; Richard et al., 1978; Hoerr et al., 1981; 1982).

Pelo consumo médio de ração estimou-se a ingestão de toxina T-2 (Tab. 2). A dose ingerida nos dois períodos iniciais ficou abaixo das consideradas tóxicas (Wu et al., 1991), e apenas para os animais mantidos até os 21 dias alcançou-se dose idêntica à considerada subletal. Entretanto, já no primeiro período experimental foi observada redução numérica do ganho de peso (Tab. 1), agravada nos períodos subseqüentes, o que pode ser interpretado como resposta a um efeito tóxico da T-2 mesmo em pequenas doses e por curto período de tempo.

Morfologicamente, foram discretas as diferenças entre tratamentos e entre períodos de observação. A cartilagem articular, por exemplo, apresentava características idênticas em todos os tratamentos e períodos, coincidindo com as descritas pela literatura (Wolbach & Hedgest, 1952; Wise & Jennings, 1973; Leesson & Summers, 1988). No entanto, a cartilagem hialina da epífise dos animais tratados, independentemente do período, mostrava perda da basofilia da matriz e alguns vasos epifisários apresentavam-se dilatados, com discreto espessamento hialino da parede e degeneração das células periteliais (Fig. 1). Os condrócitos circunvizinhos mostravam-se degeneradas (Fig. 1) e sem qualquer sinal de hipertrofia que sugerisse o início de formação do centro de ossificação secundário da epífise (COE). Assim, é possível que a lesão vascular induzida pela T-2 tenha contribuído para isso, pois a hipertrofia de condrócitos – início da formação do COE – depende da liberação de fatores difusíveis pelos vasos (Roach et al., 1998). Entretanto, a ausência do COE em grande parte das aves do grupo-controle, mesmo aos 21 dias, talvez seja apenas uma característica da linhagem (Coelho, 1982), sem qualquer ligação com a toxina T-2.

A afinidade tintorial da matriz cartilaginosa depende de sua constituição química (Viloria, 1980). Como seus precursores são carreados pelos vasos, é possível que a vascularização anormal também tenha alterado a composição da matriz a ponto de deixá-la menos basófila. Entretanto, é sugerido que a perda de basofilia se dá pela falta de hidratação e expansão e não por alterações químicas dos proteoglicanos (Cook et al., 1994). Isso poderia ter ocorrido frente às alterações vasculares observadas. O que ficou claro é que essas alterações precedem a todas as outras, demonstrando que a toxina T-2 é importante agente de lesões vasculares.

Dada a dinâmica da diferenciação e maturação celular, na placa epifisária (Brighton, 1978) são distinguíveis três zonas morfologicamente diferentes (Viloria, 1980; Coelho, 1982; Pessoa, 1995) e a mensuração da altura de cada uma delas e da altura total auxilia na compreensão dos processos patológicos que alteram o crescimento endocondral. A altura zonal e total da placa epifisária, expressa em valores médios, consta da Tab. 3. Embora sejam três as zonas, ZPM, ZT e ZH, a mensuração da ZT isoladamente é difícil, podendo levar à incursão de erros, daí a ZT ter sido incluída à ZPM, para efeito da morfometria.

A altura da ZPM não apresentou diferença significativa (Tab. 3) entre os tratamentos. Entretanto, à avaliação microscópica era aparente a maior altura da ZPM no grupo tratado, exceto aos sete dias. O alongamento da ZPM, segundo Huffer & Lacey (1982), ocorre por acúmulo de condrócitos proliferados. Embora o mecanismo desse acúmulo não seja bem conhecido, as perturbações na membrana celular provocadas pela interação da T-2 com o sistema de transporte ou de receptores (Middlebrook & Leatherman, 1989) poderiam afetar os fatores sistêmicos (hormônios) e locais (citocinas ou fatores de crescimento) de proliferação ou de diferenciação e maturação celular (Pines & Hurwitz, 1991). Outra possibilidade seria a malnutrição dos condrócitos, secundária às severas alterações observadas nos túneis vasculares descendentes, responsáveis pela nutrição da ZPM (Trueta & Amato, 1960). Esses túneis, oriundos dos vasos epifisários, mostravam alterações centradas nas células periteliais que mostravam graus variados de degeneração, com citoplasma basófilo e vacuolizado. Poucas referências são feitas a essas células (Poulos Jr., 1978; Lacey & Huffer, 1982) e nenhuma explicita sua função no crescimento endocondral das aves. Apenas Doherty et al. (1998) fazem referência ao potencial osteogênico dos pericitos microvasculares, considerando-os como reservatório local de células primitivas precursoras de múltiplas linhagens, incluindo condrócitos e osteoblastos, portanto extremamente sensíveis à toxina T-2 (Terão, 1983). Acompanhando as lesões vasculares, principalmente aos 14 e 21 dias, as células cartilaginosas apresentavam cariopicnose e cariorrexe e perda de basofilia da matriz circunjacente. Nos controle, a ZPM mostrava as mesmas características das descritas em aves normais (Riddell et al., 1983).

Thorp (1988) reafirma a importância da vasculatura no desenvolvimento e higidez da placa epifisária. É certo que as lesões vasculares alteram o ambiente celular, entretanto não se descarta a possibilidade de lesões concomitantes e independentes dos condrócitos. De acordo com Khachatourians (1990), a toxina T-2 é capaz de lesar a célula por sua interação com a membrana celular, sítio inicial de sua ação, modulação e regulação. Como as células indiferenciadas são o alvo preferencial da toxina T-2, é possível que a degeneração das células periteliais e dos condrócitos também ocorram independente das lesões vasculares.

Dilatação e/ou colapso de túneis descendentes, especialmente aos 14 e 21 dias, e sua progressão para a zona avascular, a ZT (Fig. 2), foram uma constante. Alguns túneis dilatados mostravam extravasamento de material amorfo intensamente acidófilo para o espaço peritelial (Fig. 3), sugerindo lise e extravasamento de eritrócitos, bem como de proteínas plasmáticas.

Igualmente importante e observada em todos os períodos foi a presença de fitas eosinofílicas dispostas perpendicularmente e, algumas vezes, atingindo até a ZH (Fig. 4). Muitas delas constituíam-se apenas de estreitas fitas de substância amorfa acidófila e outras, de vasos em franca degeneração e colapso. Essas faixas ou fitas eosinofílicas estavam também presentes no grupo-controle, mas em menor número e restritas à zona avascular da cartilagem e foram descritas por Wise & Jennings (1973) como conexões normais colapsadas entre os vasos descendentes e ascendentes. Duff (1989) acredita que elas estejam associadas à falência focal do crescimento endocondral em frangos de crescimento rápido e que são remanescentes de túneis vasculares comprimidos pelo rápido crescimento da cartilagem. Seu encontro poderia significar que a toxina T-2 altera a dinâmica do crescimento endocondral, talvez dificultando a maturação dos condrócitos da ZPM e permitindo que eles se acumulem e comprimam os vasos.

Apesar da ZT ser reconhecidamente uma área avascular, foi constatada sua invasão por túneis vasculares descendentes e/ou ascendentes. Como os condrócitos da ZT secretam fatores antiangiogênicos (Wise & Jennings, 1973), sua invasão por vasos indica mudanças fenotípicas das células ocorridas ou por degeneração ou por indiferenciação e imaturidade, o que ficou morfologicamente evidente tanto na ZT como na ZPM. Assim, a interferência da toxina T-2 na diferenciação morfológica e funcional dos condrócitos quebra a seqüência normal do crescimento endocondral – hipertrofia de condrócitos, mineralização e erosão da cartilagem, como se demostra a seguir.

A altura da ZH também não apresentou diferença significativa entre períodos e entre tratamentos (Tab. 3), embora a avaliação microscópica tenha indicado o contrário. No grupo tratado, as colunas cartilaginosas eram alongadas (Fig. 5) e a densidade de células maior, fazendo com que as colunas cartilaginosas entre os túneis vasculares ascendentes fossem mais espessas (Fig. 6), mesmo aos 21 dias de idade. A desorganização dos condrócitos na ZH, reflexo da diferenciação e maturação defectivas da célula, é freqüente em frangos alimentados com milho infectado por fungos do gênero Fusarium (Chu et al., 1995). Na discondroplasia tibial é marcante a imaturidade das células cartilaginosas na ZH e acredita-se que a discondroplasia tibial é resultante dessa imaturidade celular, que não permite a erosão normal da cartilagem (Poulos 1978; Poulos et al., 1978). Embora não se conheça o mecanismo pelo qual a T-2 atua no osso, é possível que ela, como outros tricotecenos, interfira com a diferenciação da cartilagem. Sabe-se que com a invasão vascular são liberados fatores que influenciam a diferenciação dos condrócitos e que o processo requer uma comunicação mútua entre eles e as células endoteliais, bem como sinalização e ação sinérgica dos hormônios tireoidianos (Bittner et al., 1998). Tendo em vista as alterações vasculares observadas, não surpreende a deficiência de maturação celular ocorrida na ZH. Além disso, a ação lesiva da T-2 sobre a tireóide já foi aventada (Rachid et al., 1996). Com o pouco amadurecimento dos condrócitos, a ZH tende a estender-se longitudinalmente em direção à metáfise e a sofrer menor erosão. A erosão é dependente da penetração vascular e a atividade da colagenase nos condrócitos hipertróficos facilita isso, pela degradação da matriz pericelular. Os condrócitos maduros também produzem fatores angiogênicos que facilitam a penetração vascular (Orth & Cook, 1994). Assim a intrincada relação vaso-cartilagem parece ser rompida pela T-2.

Nas aves, a erosão da cartilagem inicia-se antes da zona de calcificação, no topo e nas laterais dos túneis vasculares ascendentes desprovidos de membrana basal que penetram a ZH proximal. A erosão acontece pela ação de macrófagos mono e multinucleados. Tal como ocorre na discondroplasia tibial induzida pela cisteína (Cook et al., 1994), é possível que a toxina T-2 possa inibir também a função macrofágica, contribuindo para a deficiência de erosão da cartilagem (Fig. 7). Também a ação direta da T-2 sobre as células-tronco do sistema imune (Watkins, 1992) poderia comprometer a função dos macrófagos.

Os túneis vasculares metafisários ascendiam de forma irregular e mostravam-se, às vezes tortuosos, bifurcados e dilatados (Fig. 8), tal como observado por Walser et al. (1980) na discondroplasia tibial induzida por Fusarium roseum. Além disso, pequenas faixas eosinofílicas, geralmente estreitas e localizadas na porção proximal da ZH, foram freqüentes (Fig. 7). Sabe-se que a taxa de invasão vascular e de erosão da cartilagem depende da taxa de hipertrofia dos condrócitos (Thorp, 1988) Como a ZH mostrava hipertrofia irregular dos condrócitos, alguns deles degenerados, com núcleos picnóticos e circundados por matriz levemente acidófila (Fig. 6), a taxa de erosão era baixa.

O primeiro sinal da discondroplasia tibial (DT) é a incompleta hipertrofia dos condrócitos seguida de degeneração ou necrose por depleção energética (Haynes & Walser, 1986; Orth & Cook, 1994) e inibição da liberação de bFGF, importante fator angiogênico. A intrincada relação entre condrócitos maduros e vasos sangüíneos está rompida na DT e, conseqüentemente, a dinâmica do crescimento endocondral. Respostas morfológicas idênticas à DT e outras condrodistrofias são imputadas a vários fatores, incluindo algumas micotoxinas (Thorp, 1992; Cook et al., 1994; Pessoa; 1995) e poderia, agora, ser imputada à toxina T-2.

CONCLUSÃO

A toxina T-2, na dose de 2,64 ppm, é capaz de induzir alterações do crescimento endocondral em frangos de corte, semelhantes àquelas descritas para os primeiros estágios da discondroplasia tibial, mesmo quando administrada por curto espaço de tempo.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Jun 2002
• Data do Fascículo
  Jun 2001

Histórico

• Recebido
  14 Maio 2001