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Atividade antimicrobiana de bactérias lácticas isoladas de produtos cárneos frente a Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus

Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from meat products against Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus

Resumos

De seis amostras de pernil desossado curado e três amostras de salame tipo italiano artesanal foram isoladas 288 cepas de bactérias lácticas. Pelo teste de inibição direta 59 delas foram capazes de inibir in vitro o desenvolvimento de cepas de Listeria monocytogenes e de Staphylococcus aureus, o que demonstra que produzem compostos inibitórios.

Produto cárneo; bactérias lácticas; antagonismo


Two hundred eighty eight strains of lactic acid bacteria were isolated from six samples of deboned cured ham and from three samples of artisan italian type salami. The direct inhibition test identified that 59 strains were able to inhibit in vitro the growth of indicator organisms as Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus, showing their ability to produce inhibitory compounds.

Meat product; lactic acid bacteria; antagonism


Atividade antimicrobiana de bactérias lácticas isoladas de produtos cárneos frente a Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus

[Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from meat products against Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus]

A.C. Dabés., W.L.M. Santos*, E.M. Pereira

Escola de Veterinária da UFMG

Caixa Postal 567

30123-970 – Belo Horizonte, MG

Recebido para publicação, após modificações, em 13 de dezembro de 2000.

*Autor para correspondência

E-mail: wagner@vet.ufmg.br

RESUMO

De seis amostras de pernil desossado curado e três amostras de salame tipo italiano artesanal foram isoladas 288 cepas de bactérias lácticas. Pelo teste de inibição direta 59 delas foram capazes de inibir in vitro o desenvolvimento de cepas de Listeria monocytogenes e de Staphylococcus aureus, o que demonstra que produzem compostos inibitórios.

Palavras-chave: Produto cárneo, bactérias lácticas, antagonismo

ABSTRACT

Two hundred eighty eight strains of lactic acid bacteria were isolated from six samples of deboned cured ham and from three samples of artisan italian type salami. The direct inhibition test identified that 59 strains were able to inhibit in vitro the growth of indicator organisms as Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus, showing their ability to produce inhibitory compounds.

Keyword: Meat product, lactic acid bacteria, antagonism

INTRODUÇÃO

A carne e seus produtos derivados apresentam alta susceptibilidade às contaminações bacterianas, provocando redução de suas propriedades nutritivas, alterações organolépticas indesejáveis e risco à saúde do consumidor (Hugas, 1998) podendo veicular microrganismos patogênicos e/ou suas toxinas. Para impedir essas situações podem ser usados diversos métodos de conservação como salga, defumação, dessecação, refrigeração, radiação, uso adequado de embalagens e fermentação.

O efeito da fermentação sobre a conservação de alimentos é bem conhecido. Dessa forma, as bactérias lácticas têm desempenhado importante papel na produção da maior parte dos alimentos fermentados, dentre os quais incluem-se embutidos cárneos, (Salminen & von Wright, 1993). Tais bactérias possuem fundamental importância não só na obtenção desses produtos, mas também na sua preservação (Davidson & Hoover, 1993; Carolissen-Mackay & Wastings, 1997).

A redução de pH e a utilização de carboidratos disponíveis parecem constituir o principal mecanismo de antagonismo microbiano. Sabe-se também que as bactérias lácticas produzem, além dos ácidos orgânicos, outras substâncias antagonistas, como peróxido de hidrogênio, radicais livres, diacetil, acetaldeído, isômeros D de aminoácidos, pequenas moléculas não protéicas e bacteriocinas (Klaenhammer, 1988; Daeschel, 1989; Piard & Desmazeaud, 1991,1992). Tais características aumentam o interesse pelas bactérias lácticas e/ou seus metabólitos, pois eles podem ser usados como biopreservantes nos alimentos, o que confere maior segurança ao consumidor, que cada vez mais prefere produtos livres de conservantes químicos e microbiologicamente seguros (Davidson & Hoover, 1993; Santos, 1993; Holzapfel et al., 1995; Hugas, 1998).

O teste de atividade inibitória direta constitui o primeiro passo na avaliação do potencial antimicrobiano de bactérias lácticas. Diante do exposto, propõe-se isolar bactérias lácticas de produtos cárneos e avaliar sua atividade inibitória frente a microrganismos patogênicos.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizaram-se como fonte de cepas de bactérias lácticas produtos cárneos fermentados artesanais, produzidos sem a adição intencional de culturas iniciadoras e que, conhecidamente, apresentassem longo período de conservação, sem deterioração aparente, os quais permitiam especular sobre a participação da microbiota láctica na manutenção de sua qualidade.

Amostras de pernil desossado curado, provenientes de Formiga, MG, foram adquiridas no Mercado Central em Belo Horizonte, entre março e abril de 1998. As amostras de salame tipo italiano artesanal, produzidas em Tangará, SC, foram adquiridas em mercados na cidade de Videira, oeste catarinense, no mês de janeiro de 1999.

As amostras de pernil desossado curado (PDC) foram levadas para o laboratório de bactérias lácticas do Departamento de Tecnologia e Inspeção de Produtos Origem Animal da Escola de Veterinária da UFMG. As amostras de salame tipo italiano artesanal (SIA) foram processadas no laboratório de microbiologia do Centro de Tecnologia de Carnes da Perdigão Agroindustrial S/A.

De cada amostra foram colhidos assepticamente 20 gramas das porções centrais e transferidos para bolsas plásticas estéreis (Stomacher), com 180ml de meio composto por água peptonada 1% e cloreto de sódio 0,85%. A bolsa foi colocada no Stomacher 300 onde procedeu-se a homogeneização por três minutos. As amostras foram submetidas a diluições decimais até 10-6. De cada uma das diluições, alíquotas de 100ml foram semeadas em sistema de dupla camada do meio DeMan, Rogosa & Sharpe (MRS) com ágar a 1,5% em placas de Petri e incubadas em estufa bacteriológica a 34ºC por 48 horas (Santos, 1993).

Após o crescimento, as colônias escolhidas, preferencialmente as maiores, lisas e com bordas definidas, avaliadas quanto a coloração pelo método de Gram e prova da catalase, foram transferidas para outras placas com MRS ágar 1,5%, sendo uma delas mantida como estoque (placa-mãe) e as demais destinadas à prova de inibição direta, num total de 24 colônias por placa. A transferência foi realizada com palitos roliços de madeira previamente esterilizados. A placa mãe foi incubada em jarra com atmosfera modificada (Anaerobic System – DIFCO), por 24 horas a 35ºC. As outras placas foram levadas à estufa por duas horas a 35ºC, permitindo fixação das colônias (Santos, 1993).

Os seguintes microrganismos, com as respectivas origem e numeração, foram utilizados na prova de inibição direta: L. monocytogenes ATCC 7644 (American Type Culture Collection), L. monocytogenes FVM Scott A (Facultad Veterinária Madrid). Alíquotas de 10ml do meio de cultivo contendo os microrganismos indicadores foram transferidas para tubos de ensaio com 10ml de caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) e incubados a 35ºC por 12 horas. A partir dos tubos com os cultivos iniciadores dos microrganismos indicadores, foram pipetados 100ml e transferidos para um tubo com 5ml de caldo BHI. Deste, pipetou-se 1ml que foi transferido para outro tubo, também com 5ml do mesmo caldo. Em seguida, 750ml do volume desse último tubo foram pipetados e transferidos para um tubo com 15ml de BHI ágar a 0,87% (ágar semi-sólido), pré-preparado e mantido liqüefeito em banho-maria a 45ºC. Seu conteúdo foi vertido sobre uma das placas de MRS ágar, onde havia sido realizada a transferência das colônias de bactérias lácticas isoladas das amostras. Após completa solidificação da sobrecamada de BHI ágar semi sólido, as placas foram reconduzidas à estufa de cultura, onde permaneceram por mais 24 a 48 horas (Santos, 1993).

As placas foram minuciosamente observadas e aquelas colônias de bactérias lácticas que promoveram algum tipo de inibição, detectada formação de halos, foram recuperadas a partir da placa-mãe correspondente.

De cada uma das seis amostras de pernil desossado, foram repicadas 24 cepas de bactérias lácticas, totalizando 144 colônias. De cada uma das três amostras de salame tipo italiano artesanal foram repicadas 48 colônias, provendo um total de 144. As 288 colônias foram submetidas a coloração de Gram e à atividade da catalase. Foram consideradas como pertencentes ao grupo das bactérias lácticas as Gram positivas e catalase negativas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As colônias isoladas a partir das amostras de produtos cárneos apresentaram formato arredondado, cor branca e aspecto cremoso, com diâmetro aproximado de dois a três milímetros, bordas delimitadas e localizadas sempre na região interna da dupla camada de MRS-ágar. A atividade inibitória direta foi detectada pela formação de halos de inibição definidos, periféricos às cepas de bactérias lácticas isoladas (Fig. 1).


Das 288 cepas de bactérias lácticas isoladas, 59 (20,5%) apresentaram atividade direta frente a um ou mais microrganismos indicadores usados, sendo 35 cepas isoladas do pernil (12,2%) e 24 (8,3%) isoladas do salame tipo italiano) (Tab. 1).

Resultados semelhantes foram obtidos por Carvalho (1996), que isolou 336 cepas de bactérias lácticas (BAL) de lingüiça frescal, das quais 98 (29,2%) apresentaram atividade inibitória frente a cepas de Staphylococcus aureus. Prado et al. (2000) obtiveram resultados ligeiramente superiores ao avaliar o potencial antimicrobiano de BAL frente a duas cepas de Listeria monocytogenes, no qual 109 de 336 (33,4%) foram capazes de inibir o indicador.

Os resultados encontrados mostram grande variação na sensibilidade dos microrganismos indicadores frente às substâncias produzidas e secretadas pelas bactérias lácticas em meio sólido. Essa variação na sensibilidade dos indicadores pode influenciar o percentual de cepas que apresentam atividade inibitória direta. De 960 BAL isoladas de embutidos curados, Santos (1993) encontrou 780 cepas (82%) capazes de inibir diretamente Lactobacillus fermentum CECT 285. De 300 cepas isoladas de produtos cárneos espanhóis, apenas 25 (8,3%) apresentaram atividade inibitória direta quando Listeria monocytogenes Scott. A foi usada como indicador (Cintas et al., 1997). Este resultado é ligeiramente inferior quando comparado ao do presente estudo, no qual 13,9% das BAL isoladas inibiram esse mesmo indicador.

Entre os indicadores testados e diante de todas as cepas isoladas, Listeria monocytogenes Scott A demonstrou ser mais sensível à ação antagonista direta. Esse resultado está de acordo com os de Parente & Hill (1992) e Prado et al. (2000) que também demonstraram alta sensibilidade de Listeria monocytogenes Scott A às substâncias antimicrobianas produzidas por BAL. DeMartinis et al. (1998) também relataram grande sensibilidade de cepas de Listeria monocytogenes quando usadas como indicador nos testes de atividade inibitória direta. Staphylococcus aureus FRI 184 demonstrou também alta sensibilidade. O resultado desta pesquisa se aproxima daquele encontrado por Carvalho (1996), no qual 11,9% das cepas de bactérias lácticas isoladas inibiram esse mesmo indicador. Os resultados desses autores demonstraram maior resistência de S. aureus FRI 184 em relação a S. aureus ATCC 25923, sendo aquela inibida por menor número de bactérias lácticas.

A atividade antimicrobiana direta deve-se a vários fatores como, por exemplo, a produção de ácidos orgânicos, de peróxido de hidrogênio, de diacetil, de dióxido de carbono, de acetaldeído e de bacteriocinas, entre outros. Além desses, como a cepa de bactéria láctica a ser testada e o microrganismo indicador se desenvolvem ao mesmo tempo, a inibição pode ser provocada por competição pelos nutrientes presentes no meio (Holzapfel et al., 1995).

O isolamento e seleção de bactérias lácticas produtoras de substâncias antimicrobianas confirmam os resultados de diversos trabalhos que notificam a ocorrência desses microrganismos em produtos cárneos (Santos, 1993; Cintas et al., 1995; Coventry et al., 1997; Brashears et al., 1998; Prado et al. 2000). Apesar da inibição in vitro de microrganismos patogênicos, não se pode inferir sobre a inibição in loco desses e de outros microrganismos, pois fatores como pH e conteúdo de nutrientes podem influenciar não apenas a dinâmica bacteriana como a produção de compostos inibitórios (Hugas, 1998). Assim, são necessários mais estudos para que se avalie o potencial uso das bactérias com atividade inibitória direta isoladas no presente trabalho na manutenção da qualidade higiênica de carnes e produtos cárneos.

CONCLUSÕES

Bactérias ácido lácticas capazes de produzir compostos com atividade inibitória frente a Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes podem ser isoladas de pernil desossado curado e salame tipo italiano artesanal, produtos fabricados sem adição de cultura iniciadora. Sugere-se estudo da inibição direta de bactérias patogênicas em produtos cárneos fermentados utilizando como culturas iniciadoras os microrganismos usados neste estudo.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    26 Jun 2001
  • Data do Fascículo
    Fev 2001

Histórico

  • Recebido
    13 Dez 2000
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