Imunodifusão em gel de ágar com polissacarídeos de membrana de Brucella abortus 1119-3 no diagnóstico da brucelose bovina

Membrane polysaccharides of Brucella abortus 1119-3 in agar gel immunodifusion test in diagnosis of bovine brucellosis

Imunodifusão em gel de ágar com polissacarídeos de membrana de Brucella abortus 1119-3 no diagnóstico da brucelose bovina (Membrane polysaccharides of Brucella abortus 1119-3 in agar gel immunodifusion test in diagnosis of bovine brucellosis)

J. Megid¹, M.G. Ribeiro¹, J.V.B. Agottani², G. Marcos Jr³.

¹

Caixa Postal 560

18618-000 - Botucatu, SP

²Instituto de Tecnologia do Paraná -TECPAR, Curitiba, PR

³Mestrado em Vigilância Sanitária - FMVZ - UNESP/Campus de Botucatu

Recebido para publicação, após modificação, em 4 de agosto de 1999.

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Comparou-se a prova de imunodifusão em gel de ágar (IDGA), utilizando extrato polissacarídico (POLI O), obtido da amostra de B. abortus 1119-3, com os testes de soroaglutinação rápida em placa, de soroaglutinação lenta em tubos, de antígeno acidificado e de 2-mercaptoetanol para o diagnóstico da brucelose bovina. O IDGA mostrou alta especificidade, porém sensibilidade inferior aos métodos convencionais.

Palavras-chave: Bovino, brucelose, imunodifusão, antígeno polissacarídeo, soroaglutinação

ABSTRACT

An agar gel immunodiffusion (AGID) test using the polysaccharide (POLIO O) extract obtained from Brucella abortus strain 1119-3, was compared to plate agglutination, tube agglutination, rose bengal plate and mercaptoethanol tests in the diagnosis of bovine brucellosis. The AGID assay with B. aborturs polysaccharide antigens, presented a greater specificity but lower sensitivity for detecting brucellosis infected animals as compared to the conventional methods of antibody detection.

Keywords: Bovine, brucellosis, immunodiffusion test, polysaccharide antigen, agglutination test

INTRODUÇÃO

A brucelose bovina é uma enfermidade causada principalmente pela Brucella abortus, de distribuição mundial, que acarreta prejuízos de ordem sanitária e econômica (Joint..., 1986; Corbel, 1997).

Em virtude das limitações dos procedimentos laboratoriais para o isolamento de microrganismos do gênero Brucella, os métodos sorológicos têm se constituído na principal metodologia de diagnóstico (Alton et al., 1976; Sutherland, 1980, Joint..., 1986).

Embora vários componentes antigênicos do gênero Brucella tenham sido caracterizados, considera-se que sejam constituídos basicamente por antígenos polissacarídicos e principalmente de natureza lipopolissacarídica (LPS), o qual é constituído nas cepas lisas por diferentes proporções de antígenos denominados A e M, responsáveis pela síntese de diferentes classes de imunoglobulinas (Ig) anti-Brucella, detectáveis em testes sorológicos convencionais (Center..., 1997).

Vários autores vêm se dedicando à purificação dessas estruturas antigênicas de Brucella, localizadas principalmente na membrana celular, obtendo distintos extratos ou frações lipo ou polissacarídicas, incluindo as denominadas hapteno nativo e polissacarídeo B (POLY B), seguido da utilização delas em testes de imunodifusão radial ou dupla (Diaz et al., 1980, 1981; Sá, 1989).

Segundo Diaz et al. (1979), Jones et al. (1980) e Moriyon & Diaz (1985), ao contrário do LPS, esses polissacarídeos de Brucella sp. atuariam como haptenos, ou seja, não induziriam a formação de Ig frente a antígenos vacinais, detectáveis em testes sorológicos convencionais, diferentemente do observado em animais infectados com Brucella sp., em que se observam Ig antipolissacarídeos de membrana, sugerindo que a síntese dessas Ig seria dependente de alguma condição particular relacionada à infecção natural pelo microrganismo, diferenciando, portanto, animais vacinados dos infectados.

Diferentes protocolos de extração de polissacarídeos de membrana de Brucella sp. e sua aplicação na técnica de imunodifusão em gel de ágar no sorodiagnóstico da brucelose em animais têm sido relatados (Moreno et al., 1987; Zygmunt & Dubray, 1987; Brundle et al., 1988).

Cherwonogrodzky & Nielsen (1988) avaliaram o emprego dos extratos POLY B e polissacarídeo O (POLI O), obtidos, respectivamente, da membrana de amostras de B. melitensis e de B. abortus na prova de imunodifusão em gel de ágar, em relação ao emprego de outras provas sorodiagnósticas convencionais, em amostras de soro de bovinos vacinados (B19) e infectados. Não foram observadas reações positivas no teste de imunodifusão em gel de ágar no soro dos animais vacinados, contrariamente aos infectados, nos quais se verificaram resultados positivos em 18 dos animais testados, caracterizando 75% de positividade no teste.

Lord & Cherwonogrodzky (1992) avaliaram a imunodifusão radial, utilizando polissacarídeo O como antígeno, frente à soroaglutinação rápida, soroaglutinação em tubo, aglutinação com 2-mercaptoetanol, fixação de complemento e card-test em soros de bovinos infectados, vacinados e procedentes de rebanhos negativos. Nos soros de animais infectados observaram-se 85% de associação entre reações positivas na imunodifusão, fixação de complemento e card-test, em animais com títulos superiores a 100UI/ml. No mesmo estudo, nenhum dos animais vacinados apresentou reações precipitantes na prova de imunodifusão.

Diaz-Aparicio et al. (1993) compararam as provas de fixação de complemento, de rosa bengala e de imunodifusão radial empregando diferentes extratos polissacarídicos, em bovinos infectados com B. abortus, vacinados e procedentes de áreas livres de brucelose. Os autores verificaram associação positiva entre a imunodifusão radial utilizando como antígeno o polissacarídeo O de B. abortus e a prova de fixação de complemento nos bovinos infectados. Verificaram também ausência de reação na prova de imunodifusão nos animais procedentes de área livre e reação negativa dois meses após a vacinação na imunodifusão radial, diferentemente da fixação de complemento, onde se observaram resultados positivos em 52% dos animais vacinados nesse mesmo período.

Considerando os resultados obtidos relacionados com a utilização da técnica de imunodifusão em animais vacinados e a possibilidade de sua utilização dentro da rotina diagnóstica de brucelose bovina, pretendeu-se avaliar e comparar a prova de imunodifusão em gel de ágar utilizando extrato polissacarídico POLI O, obtido da amostra B. abortus 1119-3, com as provas sorodiagnósticas convencionais para brucelose bovina.

MATERIAL E MÉTODOS

Processaram-se por meio de diferentes técnicas sorológicas, soros bovinos de diversas raças e idades, procedentes de várias propriedades e regiões, encaminhados para diagnóstico de brucelose ao Laboratório de Imunologia Aplicada às Enfermidades Infecciosas dos Animais do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP-Botucatu, SP.

Todos os soros foram testados pela prova de imunodifusão em gel de ágar (Mancini et al., 1965; Fahey et al., 1965), utilizando-se como antígeno extrato polissacarídico (POLI O) obtido de amostra de Brucella abortus 1119-3, produzido pelo Instituto de Tecnologia do Paraná - TECPAR, de acordo com a técnica descrita por Cherwonogrodzky & Nielsen (1988), com interpretação das reações de precipitação baseadas em leituras com 24, 48 e 72h.

Paralelamente, os soros foram testados nas provas de soroaglutinação rápida em placa (SAR), soroaglutinção lenta em tubos (SAT) e 2-mecaptoetanol, segundo Alton et al. (1976), e aglutinação rápida em placa com antígeno acidificado tamponado, corado com rosa bengala (ATA), conforme Alton et al. (1975), utilizando antígenos produzidos pelo Instituto de Tecnologia do Paraná - TECPAR.

RESULTADOS

Os resultados obtidos na prova de imunodifusão em gel de ágar (IDAG) comparados às demais provas utilizadas são apresentados nas Tab. 1, 2, 3 e 4.

A associação de resultados negativos nas provas de soroaglutinação e a ausência de reações precipitantes na IDAG foram observadas em soros de animais com títulos inferiores a 50 nas provas de SAR (Tab. 1), SAT (Tab. 2) e 2-ME (Tab. 3) e resultados negativos no ATA (Tab. 4).

Reações de precipitação na IDAG foram verificadas, predominantemente, em soros com títulos iguais ou superiores a 200 nas provas de soroaglutinação. Dos soros com título 200 na SAR, SAT e 2-ME resultaram positivos na IDAG, respectivamente, 88,2% (Tab. 1), 60,0% (Tab. 2) e 68,5% (Tab. 3) das amostras. Nas diluições superiores a 1:200 nas provas do SAR, SAT e 2-ME, acima de 90% dos soros também apresentaram reações precipitantes na IDAG (Tab. 1, 2, 3).

Verificaram-se 58,9% de concordância de reações positivas entre as provas de IDAG e ATA ( Tab. 4).

DISCUSSÃO

A presença de reações de precipitação na prova de imunodifusão foi verificada em soros de animais com altos títulos de anticorpos. Resultados similares são relatados por Cherwonogrodzky & Nielsen (1988) que, ao avaliar a prova de imunodifusão em animais infectados, observaram 75% de positividade. Os autores consideraram que animais naturalmente infectados, com baixos títulos de anticorpos em provas como SAT, fixação de complemento (FC) e ELISA não apresentam reações de precipitação na prova de imunodifusão. De forma semelhante, Lord & Cherwonogrodzky (1992) relataram correlação de resultados entre a FC, card-test e IDAG, em animais com títulos de anticorpos superiores a 100UI/ml . Diaz et al. (1979), Jones et al. (1980) e Moriyon & Diaz (1985) citam que a síntese dessas Ig antipolissacarídicas de natureza precipitante em animais infectados, provavelmente, necessita de alguma condição particular relacionada ao processo infeccioso, que está ausente ou em menor intensidade em animais vacinados com B19. Cherwonogrodzky & Nielsen (1988) sugerem que haveria diferenças quantitativas e qualitativas (afinidade) na produção desses anticorpos precipitantes em animais vacinados e infectados.

A especificidade do teste de imunodifusão constatada no presente estudo, avaliada pela concordância de resultados negativos entre a prova de IDAG diante das provas de soroaglutinação, pode ser considerada superior a 96%. Resultados semelhantes foram observados por Diaz-Aparicio et al. (1993) que caracterizaram especificidade de 100% utilizando o teste de imunodifusão.

As dificuldades em diferenciar as reações oriundas de infecção das de origem vacinal, pelos métodos sorológicos convencionais (Macmillan, 1990; Nicoletti, 1993; Nielsen et al., 1996), decorrentes, principalmente, da persistência de Ig induzidas em animais vacinados com a amostra B19, são consideradas um dos maiores problemas no controle da brucelose, em países que adotam vacinas atenuadas aglutinogênicas (Placket et al., 1980; Joint..., 1986).

Vários autores, utilizando diferentes protocolos de extração de antígenos de parede de Brucella, têm relatado ausência de positividade da prova de imunodifusão em gel de ágar (Cherwonogrodzky & Nielsen, 1988; Pinochet et al., 1990; Lord & Cherwonogrodzky, 1992), sugerindo sua utilização como método complementar alternativo em bovinos vacinados.

Entretanto, os resultados do presente estudo, em soros procedentes de bovinos com histórico vacinal desconhecido, demonstraram baixa sensibilidade a despeito da alta especificidade no teste de imunodifusão, quando comparados às provas comumente utilizadas no sorodiagnóstico da brucelose bovina. Dessa forma, os resultados obtidos não estimulam o uso da prova de imunodifusão em gel de ágar, utilizando como antígeno extrato polissacarídeo de parede de Brucella (POLI O) como técnica diagnóstica de rotina, em virtude de sua baixa sensibilidade, o que possibilita manter animais infectados no rebanho e favorece a disseminação da doença.

• ALTON, G.G., JONES, L.M., PIETZ, D.E. Las técnicas de laboratorios en la brucelosis Genebra: OMS, 1976. p.55-133
• ALTON, G.G., MAW, J., ROGERSON, B.A. et al. Serological diagnosis of bovine brucellosis: an evaluation of complement fixation, serum agglutination and Rose Bengal tests. Aust. Vet. J., v.51, p.57-63, 1975.
• BRUNDLE, D.R., CHERWONOGRODZKY, J.W., PERRY, M.B. Characterization of Brucella polysaccharide B. Infect. Immunol., v.56, p.1101-1106, 1988.
• CENTER OF DISEASES CONTROL. Brucellosis, an overview. J. Emerg. Infect. Dis., v.3, p.1-12, 1997.
• CHERWONOGRODZKY, J.W., NIELSEN, K.H. Brucella abortus 1119-3 O-chain polysaccharide to differentiate sera from B. abortus S-19-vaccinated and field-strain-infected cattle by agar gel immunodifusion. J. Clin. Microbiol., v.26, p.1120-1123, 1988.
• CORBEL, M.J. Recent advances in brucellosis. J. Med. Microbiol, v.46, p.101-103, 1997.
• DIAZ, R., GARATEA, P., JONES, L.M. et al. Radial immunodifusion test with a Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle. J. Clin. Microbiol., v.10, p.37-41, 1979.
• DIAZ, R., SALVO, M.D., LAGO, L.F. et al. Diagnóstico serológico de la brucelose bovina. Estudio comparativo de la prueba de imunodifusión radial com la reacción de fijaccción de complemento. Rev. Diag. Biol., v.29, p.433-438, 1980.
• DIAZ, R., TOYOS, J., SALVO, M.D. et al. A simple method for the extraction of polysaccharide B from Brucella cells for use in the radial immunodifusion test diagnosis of bovine brucellosis. Ann. Rech. Vet., v.12, p.35-39, 1981.
• DIAZ-APARICIO, E., ARAGÓN, V., MARÍN, C. et al. Comparative analysis of Brucella serotype A and M and Yersinia enterocolitica O:9 polysaccharides for serological diagnosis of brucellosis in cattle, sheep and goats. J. Clin. Microbiol., v.31, p.3136-3141, 1993.
• FAHEY, J.L., MCKELVEY, E.M. Quantitative determination of serum immunoglobulins in antibody-agar plates. J. Immunol., v.94, p.84-90, 1965.
• JOINT FAO/WHO Expert Commite on Brucellosis Genebra: World Health Organization, 1986. 132p. (Techinical Report, 740).
• JONES, L.M., BERMAN, D.T., MORENO, E. et al. Evaluation of a radial immunodiffusion test with polysaccharide B antigen for diagnosis of bovine brucellosis. J. Clin. Microbiol., v.12, p.753-760, 1980.
• LORD, V.R., CHERWONOGRODZKY, J.W. Evaluation of polysaccharide, lipopolysaccharide and b-glucan antigens in gel immunodiffusion tests for brucellosis in cattle. Am. J. Vet. Res., v.53, p.389-391, 1992.
• MACMILLAN, A. A conventional serologic tests. In: NIELSEN, K., DUNCAN, J.R. Animal brucellosis. Boca Raton: CRC Press, 1990. p.155-300.
• MANCINI, G., CARBONARA, A.O., HERMANS, F.J. Immunochemical quantitation of antigens by a single radial immunodifusion. Imunochemical, v.2, p.235-254, 1965.
• MORENO, E., MAYER, H., MORIYON, I. Characterization of a native polysaccharide hapten from Brucella melitensis Infect. Immunol., v.55, p.2850-2853, 1987.
• MORIYON, I., DIAZ, R. Polissacarideos haptécnicos de brucella. In: CONGRESSO NACIONAL DE MICROBIOLOGIA, 9, 1985, Valadolid. Proceedings... Valadolid: s.d., 1985. v.2, p.349-351.
• NICOLETTI, P., TANYA, V. Comparison of enzyme-labeled immunosorbent assay and particle concentration fluorescence immunoassay with standard serologic methods and bacteriologic culture for detection of Brucella sp. infected cows in herds with brucellosis. J. Am. Vet. Med. Assoc., v.202, p.1975-1977, 1993.
• NIELSEN, K.H., KELLY, L., GALL, D. et al. Comparison of enzyme immunoassays for the diagnosis of bovine brucellosis. Prev. Vet. Med., v.26, p.17-32, 1996.
• PINOCHET, L.V., ÁBALOS, P.P., STEPHENS, L.K. et al. Normalización de un antígeno soluble para descartar respuesta postvacunal a Brucella abortus cepa 19. Av. Cienc. Vet., v.5, p.119-123, 1990.
• PLACKET, P., ALTON, G.G., CARTER, P.D. et al. Failure of a single dose of Brucella abortus strain vaccine to protect cattle when given early in calfhood. Aust. Vet. J., v.56, p.409-412, 1980.
• SÁ, M.I.V.C.C. Avaliaçăo da prova de imunodifusăo radial com o antígeno hapteno nativo (HN) no diagnóstico serológico da brucelose em animais infectados e vacinados. Estudo comparativo com outras provas serológicas. Rep. Trab. Lab. Nac. Inv. Vet., v.21, p.11-44, 1989.
• SUTHERLAND, S.S. Immunology of bovine brucellosis. Vet. Bull., v.50, p.359-368, 1980.
• ZYGMUNT, M.S., DUBRAY, G. Prepartion by ultrafiltration and control by high-performance liquid chromatography of the native hapten of Brucella abortus for use in radial immunodiffusion diagnostic test. J. Clin. Microbiol., v.25, p.1860-1863, 1987.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Abr 2001
• Data do Fascículo
  Out 1999

Histórico

• Recebido
  04 Ago 1999