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Avaliação de ensaios analíticos para detecção de coliformes fecais em queijo Minas

Evaluation of analytical methods for detecting of fecal coliforms in Minas cheese

Resumos

Foram submetidas à pesquisa de coliformes fecais, utilizando-se a técnica do número mais provável (NMP/g), 168 amostras de variedades de queijo Minas (20 frescal, 48 canastra e 100 padronizado) coletadas em Belo Horizonte. Para a comparação de diferentes ensaios em temperatura elevada, utilizou-se o caldo EC isoladamente, e caldos EC e triptofano em paralelo. Visando à pesquisa de indol foi realizado ensaio para confirmação de produção de beta-D-glucuronidase e indol em caldo fluorocult lauril sulfato. Os resultados demonstraram não haver diferença estatística significativa entre as três metodologias utilizadas para a pesquisa de coliformes fecais, considerando os índices de aceitação definidos pelos padrões legais de inspeção de queijo Minas. A facilidade de execução do ensaio da beta-D-glucuronidase em caldo fluorocult lauril sulfato, associada à confiabilidade dos resultados e demanda de tempo (redução de 96 para até 48h), permitem sugeri-lo como método de escolha para enumeração de coliformes em queijo Minas.

Queijo Minas; coliformes fecais; Escherichia coli


There were submitted to fecal coliforms enumeration, according to the most probable number (MPN/g) method, 168 samples of "Minas" cheese varieties (20 white, 48 "canastra" and 199 standardized), collected in Belo Horizonte, Brazil. In order to comparing different assays under high temperature, there was used EC broth isolated, and EC broth and tryptophane broth in parallel. With the aim of indol search, it was carried out an assay for beta-D-glucuronidase in indol production in fluorocult lauryl sulphate broth. The results did not show significant statistical difference among the three approaches used for fecal coliforms research, considering the acceptance indexes established by legal standards for "Minas" cheese inspection. The feasibility for beta-D-glucuronidase assay in fluorocult lauryl sulphate broth, coupled with results’ confidence and time required (reduction from 96 to up to 48h), suggest it as a preference method for fecal coliforms enumeration in "Minas" cheese.

Minas cheese; fecal coliforms; Escherichia coli


Avaliação de ensaios analíticos para detecção de coliformes fecais em queijo Minas

(Evaluation of analytical methods for detecting of fecal coliforms in Minas cheese)

M.L. Pereira1, M.C.A. Gastelois1, E.M.A.F. Bastos1, W.T.Caiaffa1, E.S.C. Faleiro2

1

Caixa Postal 26

30610-970 Belo Horizonte, MG

2Coordenadoria de Vigilância Sanitária, DRS - MG

Recebido para publicação, após modificação, em 15 de março de 1999.

Apoio financeiro FAPEMIG, conforme Projeto CBS-376/90

Colaborador: E. Hofer

E-mail: funed@mail.prodemge.gov.br

RESUMO

Foram submetidas à pesquisa de coliformes fecais, utilizando-se a técnica do número mais provável (NMP/g), 168 amostras de variedades de queijo Minas (20 frescal, 48 canastra e 100 padronizado) coletadas em Belo Horizonte. Para a comparação de diferentes ensaios em temperatura elevada, utilizou-se o caldo EC isoladamente, e caldos EC e triptofano em paralelo. Visando à pesquisa de indol foi realizado ensaio para confirmação de produção de b-D-glucuronidase e indol em caldo fluorocult lauril sulfato. Os resultados demonstraram não haver diferença estatística significativa entre as três metodologias utilizadas para a pesquisa de coliformes fecais, considerando os índices de aceitação definidos pelos padrões legais de inspeção de queijo Minas. A facilidade de execução do ensaio da b-D-glucuronidase em caldo fluorocult lauril sulfato, associada à confiabilidade dos resultados e demanda de tempo (redução de 96 para até 48h), permitem sugeri-lo como método de escolha para enumeração de coliformes em queijo Minas.

Palavras-Chave: Queijo Minas, coliformes fecais, Escherichia coli

ABSTRACT

There were submitted to fecal coliforms enumeration, according to the most probable number (MPN/g) method, 168 samples of "Minas" cheese varieties (20 white, 48 "canastra" and 199 standardized), collected in Belo Horizonte, Brazil. In order to comparing different assays under high temperature, there was used EC broth isolated, and EC broth and tryptophane broth in parallel. With the aim of indol search, it was carried out an assay for b-D-glucuronidase in indol production in fluorocult lauryl sulphate broth. The results did not show significant statistical difference among the three approaches used for fecal coliforms research, considering the acceptance indexes established by legal standards for "Minas" cheese inspection. The feasibility for b-D-glucuronidase assay in fluorocult lauryl sulphate broth, coupled with results’ confidence and time required (reduction from 96 to up to 48h), suggest it as a preference method for fecal coliforms enumeration in "Minas" cheese.

Keywords: Minas cheese, fecal coliforms, Escherichia coli

INTRODUÇÃO

Os coliformes, representados pelos gêneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Hafnia e Citrobacter, fermentadores de lactose da família Enterobacteriaceae, são freqüentemente utilizados como indicadores higiênico-sanitários, em controle de qualidade de água e alimentos. Sabe-se, contudo, que o grupo coliforme não se comporta de maneira uniforme no que diz respeito à especificidade de habitat e tempo de sobrevida em outros ambientes que não o trato intestinal (ICMSF, 1983). As bactérias do grupo coliforme se distinguem, assim, em fecais e não fecais. As primeiras são encontradas no trato intestinal do homem e de mamíferos, sendo incapazes de persistir, por longo tempo, em outros ambientes que não as fezes. O grupo coliforme fecal, por definição, compreende população predominantemente constituída por Escherichia coli, muito embora a proporção de E. coli I (IMViC ++ --) não esteja concretamente estabelecida nesse universo (ICMSF, 1983).

A enumeração de coliformes fecais, indicação sumária de E. coli, e, conseqüentemente, de contaminação fecal em alimentos, constitui preceito normativo estabelecido pela Portaria 01/87 (Brasil, 1987). Os procedimentos analíticos de enumeração de coliformes fecais (ICMSF, 1983; ISO, 1991; FDA, 1992; Vanderzant & Spllitstoesser, 1992), adotados pela legislação em vigor (Brasil, 1987), baseiam-se, sobremaneira, na capacidade que tem a E. coli de desenvolver-se, após ensaio presuntivo em caldo lauril sulfato triptose, em caldo EC, em condições de temperatura elevada, o que privilegia o crescimento desta, em detrimento de outras enterais como Enterobacter e Citrobacter, conforme relatado por Hajna & Perry (1943).

Alternativamente, a pesquisa de enzimas constitutivas, como a ß-D-glucuronidase, a qual pode apresentar atividade independente das condições de crescimento bacteriano, foi inicialmente utilizada para a detecção de E. coli em amostras de água, por Feng & Hartman (1982), embora sua utilização para o isolamento e identificação já houvesse sido realizada por Killiann & Bullow (1979). Segundo esses autores, a enzima ß-D-glucuronidase (GUD), produzida essencialmente por E. coli, tem a capacidade de quebrar o 4-metilumbeliferil-ß-D-glucuronídio (MUG), especialmente adicionado ao meio de cultivo, formando a 4-metilumbeliferona que, por sua fluorescência, pode ser identificada em luz UV, a 280nm.

A aplicação de metodologia alternativa, baseada em provas específicas, para se confirmar a presença de E. coli, tendo em vista assegurar a identificação desta bactéria, aliando-se segurança e maior rapidez na obtenção de informações sobre a presença ou não desse indicador de contaminação fecal recente, de forma particularizada, em amostras de queijo Minas deve ser estudada.

Com base no acima exposto, amostras de queijo Minas, frescal, canastra e padronizado, comercializadas em Belo Horizonte, MG, foram analisadas quanto à presença de coliformes fecais com a finalidade de comparar a eficácia do caldo fluorocult lauril sulfato (Merk), que se baseia na detecção de ß-D-glucuronidase, produto metabólico de E. coli, com metodologias que empregam ensaios diferenciais de temperatura elevada.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram adquiridas no comércio de Belo Horizonte, MG, por fiscal da Coordenadoria de Vigilância Sanitária, Diretoria Regional de Saúde de Belo Horizonte, no período de março de 95 a março de 96, 168 amostras de queijo Minas, conforme se delineia na Tab.1. As amostras, semanalmente adquiridas em número de sete unidades, foram embaladas em saco plástico de primeiro uso e remetidas ao Laboratório, em condições isotérmicas, para pronta análise microbiológica.

Partindo de pontos distintos da amostra, 25g foram pesados e homogeneizados em 225ml de água peptonada tamponada, (APT; Biobrás), para obtenção da diluição 1/10 (ISO, 1991). Essa diluição foi empregada para a determinação do número mais provável (NMP) de coliformes fecais em três ensaios que se seguem:

No ensaio em temperatura elevada utilizando meio EC, segundo Vanderzant & Splittstoesser (1992) a partir da diluição 1/10, procedia-se a inoculação em três séries de três tubos que continham caldo lauril sulfato triptose, (LST; Biobrás), com auxílio de 90ml de APT, até a diluição 1/1000. Após incubação a 35ºC, durante 48h, tubos de LST presuntivamente positivos, apresentando gases em tubos invertidos de Durham, foram semeados em caldo EC (Biobrás), e incubados em banho-maria a 44,5ºC, durante 48h. A expressão de coliformes fecais se deu de acordo com o NMP/g da amostra de queijo analisada, conforme leitura de tubos de caldo EC que apresentaram produção de gases (ICMSF, 1983; FDA, 1992).

No ensaio em temperatura elevada utilizando os caldos EC e triptofano, em paralelo, para confirmação de produção de indol, três séries de três tubos de LST foram, a partir da diluição 1/10, inoculados e incubados conforme descrito no ensaio anterior. Tubos de LST presuntivamente positivos, apresentando gases em tubos invertidos de Durham, foram, paralelamente, repicados em caldo EC e em caldo triptofano e incubados em banho-maria a 44,5ºC, durante 48h. Ao caldo triptofano, com intuito de se confirmar produção de indol, decorridos o tempo e condições de incubação, adicionou-se 0,5ml de reativo de Kovács para observação de aparecimento ou não de cor avermelhada.

A expressão de coliformes fecais se deu de acordo com o NMP/g da amostra de queijo analisada, conforme leitura de tubos de caldo EC que apresentaram produção de gases e que, concomitantemente, mostraram produção de indol, em caldo triptofano.

No ensaio para confirmação de produção de ß-D-glucuronidase, utilizando caldo fluorocult lauril sulfato (FLS; Merck), segundo Moberg et al. (1988), três séries de três tubos contendo caldo FLS foram, a partir da diluição 1/10, inoculados e incubados conforme descrito para os ensaio anteriores. Tubos de FLS presuntivamente positivos, apresentando gases em tubos invertidos de Durham, foram submetidos à leitura de presença ou ausência de fluorescência azul, em câmara escura, com auxílio de luz UV, a 280nm. Aos mesmos tubos que apresentaram gases e fluorescência, de forma a se confirmar produção de indol, verificou-se presença ou não de coloração avermelhada, após adicionado 0,5ml de reativo de Kovács. A expressão de coliformes fecais se deu de acordo com o NMP/g da amostra de queijo analisada, conforme leitura de tubos de caldo FLS que apresentaram, concomitantemente, produção de gases, fluorescência e produção de indol.

Para o procedimento estatístico, as amostras dos três ensaios foram comparadas a partir da análise microbiológica das 168 unidades de queijo Minas frescal, canastra e padronizado quanto à enumeração de coliformes fecais. Para avaliação dos resultados obtidos empregou-se o estudo de dispersão de freqüência.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados apresentados na Tab.2 demonstram que o número total de amostras de queijo Minas fora das especificações legais vigentes foi praticamente o mesmo para as três metodologias avaliadas com valores iguais a 109, 100 e 99, respectivamente para caldo EC, caldo EC e triptofano, em paralelo, e caldo FLS. Para queijo frescal todos os três ensaios rejeitaram 18 amostras, e para os queijo canastra e padronizado os valores de maior rejeição foram fornecidos pelo ensaio em caldo EC, e os menores, em caldo FLS e caldos EC e triptofano, em paralelo.

A análise de amostras diferenciadas de queijo Minas canastra, frescal e padronizado permitiu obter produtos com grau decrescente de contaminação, de 90,0%, 74,3% e 49,0%, respectivamente, e confirmar sobre a não interferência da densidade populacional de coliformes fecais diante do comportamento das três metodologias estudadas (dado não constante da Tab. 2). Por sua vez, os dados apresentados na Fig. 1 evidenciam que o queijo padronizado apresentou diferenciado grau de contaminação por coliformes fecais, em amostras com e sem SIF. Para o queijo frescal (dado não constante em tabela) esta mesma diferença de qualidade não foi observada.


A semelhança de resultados de colimetria observada assegura confiabilidade às três metodologias empregadas, permitindo a livre conjectura sobre vantagens e desvantagens de cada uma delas. Assim, considerando-se o ensaio diferencial em temperatura elevada, em caldo EC, isoladamente, e em caldos EC e triptofano, em paralelo, Mossel et al. (1986) relataram crescimento de Klebsiella sp., indologênica e termotolerante, que pode mascarar o resultado para E. coli e, conseqüentemente, imputar valores mais elevados de coliformes fecais, além da real população presente na amostra. Somando-se a isto, o tempo requerido na execução desses dois ensaios pode ser de até 96h, o que causa transtornos quando se almejam resultados mais imediatos, como é o caso de análises fiscais, análises de controle pós-processamento e, sob o enfoque sanitário, análise para pronta confirmação do agente etiológico, em casos de elucidação de surtos.

Quanto ao ensaio de detecção da enzima GUD, diversos trabalhos já demonstraram a eficácia desse método e têm mostrado que E. coli apresenta valores na faixa de 94-97% de resultados positivos com esse teste, e que Shigella e Salmonella podem, também, mostrar resultados positivos, muito embora o façam em índices bastante reduzidos (Restaino et al., 1990; Rice et al., 1990; Kämpfer et al., 1991; Manafi & Rotter, 1991; Sarhan & Foster, 1991; Frampton & Restaino, 1993; Blood & Curtis, 1995). Essa situação é contornada à medida que, distintamente de Salmonella e Shigella, E. coli é fermentadora de lactose, e o caldo FLS, adicionalmente, lança mão da confirmação de produção de gases, a partir desse açúcar. Além disso, a produção de triptofanase, que gera indol, pode ser constatada no próprio caldo FLS, decorrido o tempo de incubação, não se fazendo necessária, portanto, inoculação paralela como ocorre nos ensaios em caldo EC e triptofano. Cumpre, todavia, salientar que o caldo FLS, entre os de baixo percentual de E. coli não produtoras de GUD, é incapaz de detectar E. coli enterohemorrágica (EHEC), fato que não deve ser negligenciado quando se busca, de forma específica, o isolamento e a identificação de linhagens de E. coli patogênicas, como em estudos de surtos (Doyle & Schoeni, 1984).

Partindo dessas premissas e retornando aos valores 109, 100 e 99 (Tab.2), índices condenatórios de coliformes fecais em amostras de queijo Minas analisadas, respectivamente para os ensaios em caldo EC, isoladamente, caldos EC e triptofano, em paralelo, e caldo FLS, é possível sugerir maior rigor de resultados para o último ensaio, pelo seu menor número de amostras fora das especificações legais quanto à detecção específica de E. coli. Por outro lado, existe também a possibilidade de se tratarem de resultados falso-negativos, em função da possível presença de células injuriadas de E. coli, não evidenciadas pela natureza seletiva de componentes do caldo FLS. Todavia, esta última hipótese irá também recair sobre os outros dois ensaios, em função da utilização de temperatura elevada, sabidamente um agente injuriante (Frampton & Restaino, 1993). Vale lembrar também que, para detecção da enzima GUD, apenas um meio de cultivo laboratorial é utilizado e a incubação, em estufa bacteriológica ajustada a 35-37ºC, prescinde da etapa de incubação em banho-maria a 44,5ºC, empregada nas duas outras metodologias. Isso vem proporcionar redução de meios de cultivo utilizados e maior facilidade e agilidade laboratorial para execução do teste. Quanto à demanda de tempo, a detecção da enzima GUD, por meio do caldo FLS, fornece resultados em tempo máximo de 48h, tempo que, em casos de elevada contaminação da amostra, pode ser reduzido para 18h, confrontando com as outras duas metodologias que atingem duração máxima de 96h.

CONCLUSÕES

A facilidade de execução do ensaio de detecção de ß-D-glucuronidase em caldo fluorocult lauril sulfato, aliada à confiabilidade dos resultados e à diminuição no tempo de detecção em até 24h, permite sugeri-lo como método de escolha para enumeração de coliformes fecais em queijo Minas frescal, canastra e padronizado, quando de análises fiscais e de controle pós-processo.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    05 Abr 2001
  • Data do Fascículo
    Out 1999

Histórico

  • Recebido
    15 Mar 1999
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