Efeitos do cádmio sobre o crescimento das leveduras Saccharomyces cerevisiae PE-2 e Saccharomyces cerevisiae IZ-1904, e a capacidade da vinhaça em atenuar a toxicidade

Effect of cadmium on the growth of two Saccharomyces cerevisiae strains, and the vinasse capacity to atenuate the toxicity

Efeitos do cádmio sobre o crescimento das leveduras Saccharomyces cerevisiae PE–2 e Saccharomyces cerevisiae IZ–1904, e a capacidade da vinhaça em atenuar a toxicidade

Effect of cadmium on the growth of two Saccharomyces cerevisiae strains, and the vinasse capacity to atenuate the toxicity

Samuel Mariano–da–Silva, S.I, ^*; Luiz Carlos Basso^II

^IUniversidade Federal de Goiás, Instituto de Ciências Biológicas, Campus Avançado de Jataí, Centro de Ciências Agrárias (UFG/ICB/CAJ/CCA). Br.364, Km. 192, Zona Rural, Cx. postal 03, CEP: 75.800–000, Jataí, Goiás. E–mail: [e-mail]

^IIUniversidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Departamento de Ciências Biológicas (ESALQ/USP) Av. Pádua Dias, n.11, Cx. postal.09, CEP.13.418–900 — Piracicaba, São Paulo. E–mail: [e-mail]

RESUMO

O presente trabalho teve por finalidade estudar os efeitos do cádmio sobre a levedura Saccharomyces cerevisiae, bem como avaliar a possibilidade de se utilizar a vinhaça como fornecedora de agentes ligantes, visando minimizar os efeitos deletérios do mesmo. Primeiramente montou–se um ensaio visando observar a ação tóxica de diferentes concentrações de cádmio (0; 0,05; 0,1 e 0,5mM), avaliada pelo crescimento de duas cepas da levedura S. cerevisiae (PE–2 e IZ–1904) em meio YED. O meio foi inoculado com 1mL de uma suspensão a 1% (m/v) das respectivas cepas e incubado por 18 horas. Em tempos determinados durante o crescimento anaeróbio, alíquotas da suspensão de células foram retiradas e a concentração celular foi determinada. No final do ensaio, foram determinadas a viabilidade celular, a taxa de brotamento e a contaminação bacteriana. Os teores de trealose para cada tratamento, de ambas as cepas, foram dosados no início e no final do ensaio. Em uma segunda etapa, montou–se um ensaio visando avaliar a capacidade da vinhaça (0,15 e 30% do volume do meio) em atenuar os efeitos tóxicos de duas doses de cádmio (0,1 e 0,5mM), empregando–se a levedura S. cerevisiae PE–2 em meio YED. O meio foi inoculado com 2mL de uma suspensão a 1% (m/v) da levedura e incubado por 18 horas. Em tempos determinados durante o crescimento anaeróbio, alíquotas da suspensão de células foram retiradas e a concentração celular foi determinada. No final do ensaio, foram determinadas a viabilidade celular, a taxa de brotamento, a contaminação bacteriana e a produção de etanol. Os teores de trealose, para cada tratamento, foram dosados nas leveduras no início e no final do ensaio. O cádmio prejudicou o crescimento e a viabilidade celular das duas cepas da levedura S. cerevisiae. A vinhaça apresentou um discreto efeito tóxico, traduzido pela redução do crescimento. Porém, nos tratamentos contaminados com cádmio, apresentou um efeito protetor, minimizando os efeitos deletérios do metal.

Palavras–chave: levedura; cádmio; metais pesados; vinhaça; fermentação alcoólica.

SUMMARY

The present study was carried out in order to evaluate the capability of different cadmium concentration (0; 0,05, 0,10 and 0,50mM) to affect the growth of two S. cerevisiae strains (PE–2 and IZ–1904) in YED (yeast extract 1% and dextrose 2%) medium, and to evaluate the three vinasse concentration capability (0,15 and 30%) to attenuate the two cadmium concentration toxicity (0,1 and 0,5mM), using S. cerevisiae PE–2 strain in YED medium. In the first assay, the medium was inoculated in aseptic conditions with 1mL of 1% yeast suspension (PE–2 or IZ–1904) and incubated at 30ºC, 70 RPM for 18 hours. During anaerobic growth (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 and 18 hours), portions of cell suspension were taken out and biomass concentration was determined. At the end of fermentation, yeast viability, budding rate and bacterial contamination were determined. Both, initial and final trehalose, was measured. In the second assay, the medium was inoculated in aseptic conditions with 2mL of 1% PE–2 suspension and incubated at 30ºC, 120 rpm for 18 hours. During the anaerobic growth (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12,14, 16 and 18 hours) portions of cell suspension were taken out and biomass concentration was determined. At the end of fermentation, alcohol production, yeast viability, budding rate and bacterial contamination were determined. Both, initial and final trehalose, was measured. The increase of cadmium levels showed a reduction on yeast growth and cell viability. Vinasse showed low toxicity, but protected yeast cells very effectively against the toxic effects of cadmium.

Keywords: yeast; vinasse; cadmium; heavy metals; alcoholic fermentation.

1 — INTRODUÇÃO

A relação entre os vários microrganismos, especialmente bactérias, e os metais pesados é relativamente bem documentada. Porém, poucas informações sobre a resistência de leveduras frente aos metais pesados têm sido publicadas. O estudo das interações entre as leveduras e os metais pesados tem um alto interesse científico. Entre os fungos, as leveduras são as mais exploradas científicamente, devido ao fato de serem organismos eucariotos mais facilmente manipulados, e assim servir de excelente modelo para o estudo de muitos problemas importantes na biologia dos eucariotos [11].

As leveduras são também conhecidas por acumular grandes quantidades de metais pesados em meios aquosos [15]. Desta forma, quando estes microrganismos entram na cadeia alimentar, eles podem se tornar perigosos. Um exemplo de risco ecológico pode ser a produção industrial de Saccharomyces cerevisiae. O processo de fermentação alcoólica mais utilizado no Brasil é o Melle–Boinot, no qual as células de levedura recuperadas são recirculadas no processo. Entretanto, várias usinas desviam do processo parte do leite de levedura (10 a 20%). Esta biomassa de leveduras é então utilizada na alimentação animal e humana como fonte de proteína.

O acúmulo de metais pesados por microrganismos é geralmente bifásico: uma rápida ligação com a superfície da célula, independente do metabolismo, é seguida de um acúmulo intracelular dependente do metabolismo e com gasto de energia [14, 15, 22, 28]. Neste acúmulo não dependente do metabolismo (biosorção), os cátions podem ser depositados na membrana via adsorção, precipitação orgânica ou ficarem adsorvidos a grupos aniônicos fixos, presentes na membrana da célula [15, 30, 44]. O acúmulo independente do metabolismo é seguido de outro, dependente do metabolismo, onde grandes quantidades do metal podem ser bioacumuladas [13, 16, 24, 27, 29, 32, 34, 35, 36]. Os cátions são transportados através da membrana celular, provavelmente por proteínas de transporte, até o citossol, onde se associam a várias organelas ou ficam ligados a metaloproteínas [8, 28, 44].

Para leveduras a toxidade dos metais pesados pode ser conseqüência da formação direta de complexos, os quais modificam a atividade biológica de componentes celulares como ácidos nucléicos, enzimas ou aminoácidos [9, 19, 21, 31] assim como conseqüência de danos na parede celular [1, 2, 35].

No presente trabalho foi testada a capacidade do cádmio em afetar o crescimento de duas cepas da levedura Saccharomyces cerevisiae e a capacidade da vinhaça em atenuar os efeitos tóxicos, com o objetivo de coletar algumas informações da relação entre o cádmio e as leveduras.

2 — MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 — Preparo da vidraria

Toda a vidraria reutilizável foi previamente imersa, por 4 horas, em uma solução de lavagem (HNO₃, HCl e água, na proporção 1:2:9) sendo a seguir enxaguada com água deionizada e seca em estufa a 80ºC [26].

2.2 — Preparo das soluções:

Para limitar a possível contaminação, todas as soluções utilizadas foram preparadas com água ultra pura (Sistema Millipore Milli–Q de purificação).

2.3 — Cepas utilizadas

Utilizou–se as leveduras Saccharomyces cerevisiae PE–2 e Saccharomyces cerevisiae IZ–1904, ambas caracterizadas pelo método de cariotipagem [7], e oriundas da Coleção de Leveduras do Departamento de Ciências Biológicas (ESALQ/USP). Tais leveduras são amplamente empregadas pelo parque industrial brasileiro, e apresentam baixa (IZ–1904) e alta (PE–2) capacidade de sobrevivência nas dornas.

2.4 — Pré–crescimento das leveduras

Partindo de uma cultura pura (liofilizada), as leveduras foram reativadas em meio YEPD (extrato de levedura, peptona e dextrose) e pré–crescidas anaerobicamente a 30ºC em um meio de melaço com 6% de açúcares redutores totais (ART), suplementado com KH₂PO₄ (8,36mM), (NH₄)₂SO₄ (5mM), uréia (38,75mM), MgSO₄.H₂O (3,57mM), ZnSO₄.7H₂O (0,10mM), MnSO₄.H₂O (0,12mM) e ácido linoléico (0,11mM) e esterilizado (121ºC/1atm/20 minutos). Após o crescimento as células foram coletadas por centrifugação (800G, 20min) e ressuspendidas em água destilada estéril a uma concentração de 1% na massa úmida (m/v).

2.5 — Primeiro ensaio de fermentação: análises do crescimento

Os crescimentos foram levados a efeito em 75mL de meio YED (extrato de levedura 1% e dextrose 2% autoclavado 1atm, 121^oC por 20 minutos), em frascos erlenmeyers de 125mL, tapados com folha de alumínio e acrescidos com acetato de cádmio (CdC₄H₆OH. 2H₂O), de forma que as concentrações finais do metal fossem 0; 0,05; 0,10 e 0,50mM. Todos os tratamentos foram realizados em 3 repetições. O valor de pH dos meios foi ajustado a 5,5 utilizando uma solução de H₂SO₄ 0,1M. Os frascos contendo os meios foram inoculados em condições assépticas, com 1mL da suspensão a 1% da respectiva levedura (PE–2 ou IZ–1904), conforme o tratamento, e incubados a 30ºC, sob agitação (120rpm) por 18 horas. Em tempos determinados durante o crescimento (0, 2, 4, 6, 8, 19, 12, 14, 16 e 18 horas), 1mL da suspensão de células foi retirado e transferido para tubos de ensaio com 9mL de água deionizada estéril. A concentração de células foi determinada por leitura turbidimétrica, a 570nm, em espectrofotômetro Bausch & Lomb, modelo Spectronic 88. A taxa de crescimento foi então calculada pela conversão das leituras em concentração de biomassa (g 100mL^-1 de meio) através de reta padrão anteriormente estabelecida para cada levedura. Todos os tratamentos foram feitos em triplicata.

2.6 — Segundo ensaio de fermentação

Os crescimentos foram levados a efeito em 75mL de meio YED (extrato de levedura 1% e dextrose 2%, autoclavado a 1atm, 121^oC por 20 minutos) em frascos erlenmeyers de 125mL, tapados com folha de alumínio e acrescidos com acetato de cádmio (CdC₄H₆OH.2H₂O), de forma que as concentrações finais do metal fossem 0,0; 0,10 e 0,50mM e com as diferentes proporções de vinhaça no meio (15 e 30% em volume). Todos os tratamentos foram realizados em 3 repetições. O pH dos meios foram ajustados a 5,5 utilizando uma solução de H₂SO₄ 0,1M. Os frascos contendo os meios foram inoculados em condições assépticas, com 2mL da suspensão 1% (m/v) da levedura (PE–2), conforme o tratamento, e incubados a 30ºC, sob agitação (120rpm) por 18 horas. Os crescimentos foram avaliados em diferentes tempos (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 18 horas), conforme protocolo do ensaio 1, igualmente com 3 repetições.

2.7 — Taxa de viabilidade, taxa de brotamento e contaminação bacteriana

No final do ensaio (18 horas), foram retirados 0,5mL de cada suspensão, sendo as amostras diluídas e coradas com eritrosina e observadas em microscópio ótico para avaliação da viabilidade, taxa de brotamento e contaminação bacteriana [3].

2.8 — Análise de trealose

A trealose foi extraída de 60mg (peso fresco) de células com 2mL de ácido tricloroacético 0,5M, em banho de gelo por 20 minutos (a suspensão foi frequentemente agitada) seguida de centrifugação e separação do extrato sobrenadante [42, 43]. Em duplicata, 0,2mL de cada sobrenadante foram transferidos para tubos Pyrex diluindo–se com 0,3mL de água. A seguir, foi adicionado 5mL do reagente antrona (125mg antrona e 2,5g tiouréia em uma mistura de 65,2mL de água e 187,5mL de H₂SO₄). A reação transcorreu em banho de água (100ºC) por 10 minutos, seguida de resfriamento por 20 minutos em sala escura. A intensidade de cor formada foi mensurada em colorímetro (Klett–Summerson) a 620nm [10].

2.9 — Análise do etanol formado

Ao final das fermentações (18 horas), o etanol foi dosado no vinho delevurado mediante destilação com vapor (em microkjeldhal) seguido de densimetria eletrônica em densímetro Anton Paasr, modelo DMA 48 [45].

2.10 — Análise estatística

A análise de variância (teste de F) foi utilizada para analisar as variáveis crescimento, células viáveis e teor de trealose, seguida de uma análise seguindo um esquema fatorial no delineamento inteiramente casualizado, com modelo classificação cruzada dupla e 3 repetições. As comparações de médias foram feitas pelo teste de comparações múltiplas de Tukey [38].

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

O cádmio foi tóxico para ambas as leveduras em todas as concentrações testadas (0,05; 0,1 e 0,5mM) quando comparadas com o controle (0,0mM Cd) nas duas variáveis testadas (crescimento e viabilidade), embora possa ser observado claramente que a levedura IZ–1904 foi mais sensível ao cádmio (Tabela 1), apresentando um decréscimo na taxa de crescimento (Figuras 1 e 2). Além disto, a levedura IZ–1904, na concentração de 0,05mM de cádmio atrasou o final da fase Log em relação ao controle de 14 para 16 horas, o que já havia sido notado por GRAFL & SCHWANTES [17]. Estes autores demonstraram que para Saccharomyces cerevisiae a toxidade para cádmio começa a se manifestar na concentração de 0,001mM, e que 0,1mM impediu a divisão celular completamente.

Esta maior resistência ao cádmio demonstrada pela levedura PE–2, quando comparada com a levedura IZ–1904 e a cepa utilizada por GRAFL & SCHWANTES [17] já poderia ser esperada. Outros trabalhos [5, 6] já haviam demonstrado a maior tolerância da levedura PE–2 a diversos fatores estressantes, tais como etanol, temperatura, sorbitol, apresentando melhores médias de viabilidade, crescimento e rendimento fermentativo, quando comparada com outras leveduras.

Conforme esperado, os teores de trealose nas duas leveduras diminuiram em relação ao controle com o aumento da concentração de cádmio, sendo porém anormal os teores elevados encontrados para ambas as cepas no tratamento com 0,5mM. Este comportamento pode ser explicado pelo não crescimento das cepas nesta concentração de cádmio (Figuras 1 e 2). As células provavelmente se encontram em um estado de semi–letargia, não sendo capazes de metabolizar a glicose do meio de fermentação, e utilizando as reservas endógenas iniciais lentamente, até o esgotamento destas. Isto é ainda mais palpável quando se compara a viabilidade das leveduras submetidas a este tratamento com as demais.

Os teores de trealose nas leveduras decresceram com o aumento das doses de cádmio e conseqüente queda na viabilidade (Tabelas 1, 2 e 3). A trealose é um dissacarídeo não redutor constituído de duas unidades de glicose, e parece exercer um efeito protetor sobre as células de levedura durante processos de estresse [23]. O modelo mais aceito para explicar o efeito protetor da trealose é o proposto por Crowe et al. [12]. Segundo os autores, a trealose interage com os grupos polares das cadeias fosfolipídicas existentes na membrana, substituindo a água que está ligada às cabeças polares dos fosfolipídios quando em condições favoráveis e seria perdida no processo de estresse. Com a ligação da trealose à membrana não há alteração do espaçamento entre os fosfolipídios, evitando assim as separações laterais dos componentes da membrana. Com a substituição das moléculas de água pela trealose, mantém–se a integridade e a fluidez da membrana, e assim, a viabilidade celular.

O cádmio é conhecido por interagir com os polifosfatos da membrana plasmática da levedura [38, 39]. Como estes polifosfatos atuam no transporte de glicose para dentro da célula [11, 22, 37, 40, 41] este transporte deve ter sido completamente inibido nesta concentração de cádmio (0,5mM). Provavelmente as leveduras se encontram em um estado de semi–letargia, não sendo capazes de metabolizar a glicose do meio de fermentação, utilizando para sobreviver as suas reservas endógenas (nitrogênio, trealose e glicogênio). Quando do esgotamento destas reservas, ocorrerá a morte destas células.

A utilização das reservas de trealose e glicogênio poderia até mesmo explicar o aumento dos teores de proteína em leveduras submetidas a 0,042mM de cádmio, obtido por SILVA [35], SILVA & PRADO–FILHO [36] e MARIANO–DA–SILVA & PRADO–FILHO [27], Assim como o aumento do teor alcóolico de vinhos oriundos da fermentação de mostos de melaço contaminados com 0,042mM de cádmio, obtidos por PRADO–FILHO, DOMINGOS & SILVA [29] e DOMINGOS [13], o que não foi discutido pelos autores pela falta de subsídios pela não mensuração dos teores de trealose.

O aumento das concentrações de cádmio coincidiu com a diminuição na produção de álcool (Tabela 3). Provavelmente, com a diminuição da absorção de glicose, a glicólise foi prejudicada, ocorrendo diminuição no metabólito final desta via metabólica.

A vinhaça mostrou um pequeno efeito depressivo sobre o crescimento (Figura 3), porém sem afetar a viabilidade celular (Tabelas 4 e 5). Os resultados mostraram claramente que a vinhaça atenuou o efeito tóxico do cádmio (Tabela 6, Figuras 4, 5 e 6). Ficou também bem evidenciado que a maior dose de vinhaça exerceu um efeito protetor maior. Estas afirmações ficam ainda mais evidentes quando confrontamos os resultados de viabilidade (Tabela 5), os teores de trealose (Tabela 7) e os valores de álcool no vinho (Tabela 8).

Esta proteção proporcionada pela vinhaça pode ser atribuída às interações pouco conhecidas entre o cádmio e os compostos orgânicos e inorgânicos presentes em um meio complexo [4]. A ação individual de grupos orgânicos, quelantes e seqüestradores, com ligações como R–S^–, SO₄^-2, F^–, NO₃^–, NH₃, etc. é desconhecida [29], bem como as interações no ambiente fermentativo de um mosto YED–vinhaça; por outro lado, a vinhaça é conhecidamente rica em compostos minerais tais como cálcio, zinco, enxofre, etc. [33], que como foi demonstrado por vários autores [2, 18, 20, 25, 28] podem por competição ou complexação atenuar a toxidade do cádmio sobre a levedura.

4 — CONCLUSÕES

O cádmio, ainda que em baixas concentrações, prejudica o crescimento de leveduras, mesmo aquelas conhecidamente resistentes a fatores estressantes. A vinhaça apresenta um discreto efeito tóxico sobre a levedura, traduzido pela redução do crescimento. Apesar disto, quando observamos os tratamentos contaminados com cádmio, notamos claramente seu efeito protetor, minimizando os efeitos deletérios do metal. Os valores de trealose mostraram uma ótima correlação com viabilidade e crescimento da levedura, sendo que este parâmetro reflete o estado fisiológico de estresse ao qual a levedura está submetida. O uso da vinhaça como inibidor da toxicidade, não só do cádmio mas também de outros metais pesados, tem potencial, e merece ser alvo de estudos mais detalhados, inclusive sobre a bioacumulação destes metais.

5 — REFERêNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 — AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi financiado pela FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) — Processo nº 98/13743–0 tipo DR.

Recebido para publicação em 20/09/2001

Aceito para publicação em 26/09/2003 (000734)

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A quem a correspondência deve ser enviada.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Jun 2004
• Data do Fascículo
  Mar 2004

Histórico

• Recebido
  20 Set 2001
• Aceito
  26 Set 2003