AVALIAÇÃO DE MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DE LISTERIA EM QUEIJOS

AVALIAÇÃO DE MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DE LISTERIA EM QUEIJOS¹

M.C.D. SILVA²,^*, T.C.C. VILARDI³, A. TIBANA⁴

RESUMO

Com o objetivo de avaliar os métodos de enriquecimento, semeadura direta e número mais provável (NMP), este último segundo o sistema do tubo Fung-Yu e segundo a técnica convencional, para a detecção de Listeria monocytogenes, foram analisadas 103 amostras de diferentes tipos de queijos (minas frescal, ricota, gorgonzola, roquefort, brie, camembert e cheddar) fabricados e comercializados na cidade do Rio de Janeiro, Brasil. O método de enriquecimento permitiu a detecção de L. monocytogenes em 11 (10.8%) amostras, enquanto o do NMP e da semeadura direta apenas em 3 (2.9%) e 2 (1.9%), respectivamente. O sistema Fung-Yu e a técnica convencional para proceder o método do NMP tiveram a mesma eficácia, em termos de sensibilidade e tempo, na detecção de L. monocytogenes e demais espécies do mesmo gênero. A eficiência dos meios seletivos indicadores testados variou em função da contaminação do queijo, sendo o ágar Mox mais sensível e mais seletivo que o Palcam para as amostras de queijos que apresentaram elevado nível de contaminação. Já para os demais tipos de queijos analisados ambos apresentaram a mesma eficiência. Das 103 amostras analisadas, 11 (10.8%) estavam contaminadas com L. monocytogenes, 13 (12.7%) com L. innocua, 6 (5.8%) com L grayi, e 1 (0.97%) com L. welshimeri, sendo L. monocytogenes evidenciada em amostras de queijos gorgonzola, roquefort e minas frescal.

Palavras-chave:Listeria spp, métodos, meios de isolamento, queijos

SUMMARY

EVALUATION OF METHODS FOR DETECTION OF LISTERIA FROM BRAZILIAN CHEESE. To evaluate the methods of Enrichment, Direct Plating and Most Probable Number (MPN) — the latter according to Fung-Yu and conventional technique — for the detection of Listeria monocytogenes, 103 samples of different types of cheese ("minas frescal", ricotta, gorgonzola, roquefort, brie, camembert and cheddar) manufactured and marketed in the city of Rio de Janeiro — Brazil were analyzed. The enrichment method was more efficient than direct plating method, as well as than Most Probable Number method. The efficiency of the media tested have varied according to the degree of cheese contamination, the Mox agar being more effective than Palcam agar for samples with a high contamination level, like homemade "minas frescal", while for ripened cheeses (gorgonzola and roquefort) they were similar. Species other than L. monocytogenes were also observed in the cheeses samples examined, such as L. innocua (12.7%), L. grayi (5.8%) and L. welshimeri (0.97%), being L. monocytogenes found in gorgonzola, roquefort and "minas frescal" cheese samples.

Keywords:Listeria spp, cheese, methods

1 — INTRODUÇÃO

O interesse pela ocorrência de Listeria em alimentos, particularmente por Listeria monocytogenes, vem se intensificando desde a década de 80, em função dos vários surtos e casos esporádicos de listeriose de origem alimentar ocorridos no Canadá, Estados Unidos e Europa [33]. Desta forma, uma grande variedade de métodos bacteriológicos, incluindo meios de culturas, vêm sendo propostos objetivando agilizar o rastreamento de L. monocytogenes nos mais diversos tipos de alimento [2,3,7,9,11,15,16,30,42,43,44,45]. Dentre os métodos convencionais para a detecção e isolamento de L. monocytogenes, destacam-se: os recomen-dados pelo U. S. Department of Agriculture (USDA) [24], pelo Food and Drug Administration (FDA) [21] e pelo Health Protection Branch do Canadá [39], os quais vêm se apresentando como de melhor sensibilidade e maior aceitação entre os pesquisadores. Contudo, na busca de uma metodologia simples e rápida para detecção de Listeria spp em alimentos, YU & FUNG [41] desenvolveram um método usando tubos em forma de "U", denominados Fung-Yu (Figura 1). Esse sistema de tubos foi utilizado no método do número mais provável (NMP) apresentando excelentes resultados [43,44,45].

FIGURA 1.
Esquema do Tubo Fung - Yu. (Fonte: Yu & Fung, 1993 [41]) — TSBE^a - caldo triptose de soja + 0.2% esculina + 0.1% citrato férrico amoniacal; Mox^b - ágar oxford modificado.

A listeriose humana acomete principalmente recém-nascidos, gestantes e idosos. Apesar de ser pouco comum em humanos [25], a percentagem de casos fatais é elevada (30%), excedendo inclusive a de Clostridium botulinum. As manifestações clínicas comumente associadas a tais patogenias são: meningite, septicemia, formas tifoídicas e pulmonares, granulomatose séptica e aborto. Nas bacteremias por L. monocytogenes em adultos, o sintoma mais comum é a febre, podendo ocorrer fadiga, mal-estar, náusea, vômitos, dores e diarréia [14].

Apesar dos vários relatos na literatura internacional sobre a ocorrência de listeriose associada à ingestão de alimentos, sendo os produtos de laticínios os mais frequentemente envolvidos nos casos recentes de listeriose humana, no Brasil pouca atenção tem sido dada à possibilidade de veiculação do agente por alimentos. Há no entanto relatos sobre o isolamento de L. monocytogenes em vegetais [18], camarão [10,19], bem como em produtos cárneos e lácteos [5,8,15,27,28,34]. Entretanto, são poucos e em alguns casos discordantes os resultados obtidos por pesquisadores [5,8,38] sobre a incidência desse patógeno em queijos consumidos no nosso meio; provavelmente porque a maioria dos laboratórios não se encontram familiarizados com a metodologia de isolamento, e/ou devido aos diferentes procedimentos empregados. Portanto o presente trabalho tem como principal objetivo, avaliar a eficiência dos métodos bacteriológicos previamente descritos, para a detecção de L. monocytogenes em diferentes tipos de queijos, visando a aplicação dos mesmos na rotina dos laboratórios de controle microbiológico de alimentos.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 - Amostras

Cento e três amostras de diferentes tipos de queijos, sendo 32 gorgonzola, 2 roquefort, 3 ricota, 2 cheddar, 11 brie, 6 camembert e 47 minas frescal, coletadas ao acaso, em supermercados e feiras livres da cidade do Rio de Janeiro — RJ, nos meses de março a dezembro de 1995, foram analisadas quanto a presença de Listeria spp. Dentre os queijos tipo minas frescal, 17 foram de fabricação artesanal e os demais industrializados e comercializados sob inspeção federal. Uma vez adquiridas, as amostras foram transportadas até o laboratório e submetidas à análise microbiológica, cujo início não ultrapassava 2 horas após a coleta do material.

2.2 - Enumeração de Listeria monocytogenes

2.2.1- Preparação das amostras

Alíquotas de 25g de cada amostra foram homogeneizadas em 225ml de água peptonada tamponada (APT) para obtenção da diluição 10^-1 e a partir desta, foram preparadas diluições decimais até 10^-4, empregando-se o mesmo diluente, conforme é mostrado na Figura 2.

FIGURA 2.
Representação esquemática das metodologias empregadas para enumeração e detecção de Listeria spp. (APT - água peptonada tamponada; LEB - caldo de enriquecimento para Listeria; MOX - ágar Oxford modificado; TSBE - caldo triptose de soja + Fe ⁺³ + esculina).

2.2.2 - Contagem pela técnica da semeadura direta

Volumes de 0.1ml do homogeneizado e de cada diluição foram semeados em superfície, em placas contendo ágar Oxford modificado — Mox (base de ágar Oxford — Merck) suplementado com moxalactam (15mg/l) (Sigma) e sulfato de colistina (10mg/l) (Sigma), e ágar Palcam (Merck) suplementado com sulfato de polimixina B (10mg/l), acriflavina (5mg/l) e ceftazidima (20mg/l). As placas foram incubadas a 35°C por 24 a 48 horas, sendo as de ágar Palcam em condições de microaerofilia (5% CO₂, 80% N e 10% H), para posterior contagem e isolamento das colônias (Figura 2).

2.2.3 - Enumeração de Listeria spp pela técnica dos tubos múltiplos (NMP)

A quantificação de Listeria spp e L. monocytogenes nas amostras analisadas pelo método do número mais provável (NMP), foi realizada de acordo com a técnica convencional [37] e pela técnica proposta por YU & FUNG [44]. Para a técnica convencional um volume de 1.0 ml de cada diluição (10^-1 — 10^-4) foi inoculado em triplicata em 10ml de caldo tryptcase de soja (Difco) adicionado de 0.2% de esculina (Merck) e 0.1% de citrato férrico amoniacal (Merck) (TSBE) e incubado a 35°C por 24 a 48 horas. Após o período de incubação, a partir dos tubos enegrecidos, foi transferida com auxílio de uma alça de platina, uma alíquota do crescimento para tubos contendo caldo Fraser (Merck) suplementado com acriflavina (25mg/l) (Merck), ácido nalidíxico (20mg/l) (Merck) e citrato férrico amoniacal (5%) (Merck) e incubado a 35°C por 24 a 48 horas (Figura 2). Usando tubos Fung-Yu previamente preparados com os meios caldo TSBE em concentração dupla, agar Mox semisólido e caldo Fraser (Figura 1), porções de 1.0 ml de cada diluição (10^-1 — 10^-4) foram inoculadas em triplicata no lado A do tubo Fung-Yu e incubados a 35°C por 48 a 72 horas, até enegrecimento do caldo Fraser (Figura 1). A seguir, as culturas do caldo Fraser enegrecidos, tanto dos tubos convencionais como dos tubos Fung-Yu, foram semeadas nos ágares Mox e Palcam e incubadas conforme anteriormente descrito (Figura 2). A determinação do NMP foi feita de acordo com OBLINGER & KOBURGER [29], após confirmação da presença de L. monocytogenes em cada diluição semeada.

2.3 - Enriquecimento primário e secundário

Alíquotas de 25g de cada amostra de queijo foram homogeneizadas em 225ml de caldo de enriquecimento para Listeria (LEB-Merck), segundo metodologia proposta pelo Health Protection Branch do Canadá [39], conforme representada na Figura 2. Volumes de 0.1ml do homogeneizado foram semeados em tubo contendo 10ml de caldo Fraser (enriquecimento secundário), e diretamente em placas de ágares Mox e Palcam, e incubados conforme descrito no item 2.2.2. Após o período de incubação, as culturas enegrecidas do caldo Fraser foram também semeadas nos ágares Mox e Palcam, e incubadas como descrito anteriormente.

As colônias típicas foram identificadas de acordo com ROCOURT et al [32]. Cerca de 5 a 10 colônias típicas foram escolhidas de cada placa, semeadas em tubos contendo caldo triptose fosfato (CT), e posteriormente identificadas através da bacterioscopia pelo método de Gram, testes de motilidade (caldo triptose fosfato (Difco) + 0.3% ágar) à 30°C, catalase, reação CAMP com S. aureus e R. equi, fermentação de carboidratos (raminose, xilose, manitol, manoside e glicose) e reação de redução do nitrato.

2.4 - Enumeração de coliformes fecais pela técnica dos tubos múltiplos (NMP)

As 103 amostras de queijos foram também avaliadas quanto as condições higiênico-sanitárias, através da enumeração de coliformes fecais pela técnica dos tubos múltiplos (NMP), com três tubos por diluição [17].

2.5 - Análise estatística

O teste c² (1) foi utilizado para verificar a existência ou não de significância entre os métodos de isolamento testados (Semeadura direta, NMP e Enriquecimento) para Listeria spp e L. monocytogenes. Nos casos em que pelo menos uma das frequências esperadas (Fe) do teste c² foi menor que 5, aplicou-se o teste de Fisher [31].

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

A presença de Listeria spp foi evidenciada em 20 (19.4%), 4 (3.88%), 3 (2.91%) e 2 (1.94%) das 103 amostras de queijos analisadas pelos métodos de enriquecimento, número mais provável utilizando tubos Fung-Yu e tubos convencionais, e semeadura direta, respectivamente, conforme é mostrado na Tabela 1. Já L. monocytogenes foi evidenciada em 11 (10,8%) dessas amostras através do método de enriquecimento, sendo 8 de queijo tipo minas frescal, 2 gorgonzola e 1 roquefort. Pelos métodos de número mais provável e da semeadura direta a sua presença foi evidenciada em 3 (2.91%) (2 de queijo gorgonzola e 1 roquefort) e 2 (1.94%) (2 de gorgonzola) amostras, respectivamente (Tabela 1). Esses dois métodos sendo menos sensível que o de enriquecimento, só evidenciaram L. monocytogenes em amostras de queijos com contagens acima de 1 NMP/g e 100 UFC/g, respectivamente e apresentando baixo nível de coliformes fecais (<10 NMP/g). Estes resultados são similares aos obtidos por outros pesquisadores [12,35] os quais observaram que a técnica da semeadura direta em meios sólidos seletivos, não apresentaram resultados satisfatórios. YU, PRASAI & FUNG [45], analisando produtos cárneos para detecção de Listeria spp encontraram através do método NMP, usando tubos Fung-Yu e pela semeadura direta, uma eficiência de 31 e 17%, respectivamente. As duas amostras de queijo gorgonzola foram positivas para L. monocytogenes nos três métodos testados, apresentando contagem de 6.0 x 10 a 7.0 x 10² UFC/g pela semeadura direta e em torno de 2.3 x 10 a 9.0 x 10² NMP/g pelo método do NMP. É provável que uma maior eficiência do método NMP utilizando tubos convencionais poderia ter sido alcançada, se o inóculo, a partir do homogeneizado de queijo, fosse de 10ml. No caso do método NMP usando tubos Fung-Yu, a temperatura de incubação utilizada foi de 35°C conforme recomendada por YU & FUNG [41,43,44,45]. Se tivesse sido usada a temperatura de 25°C na qual L. monocytogenes apresenta maior motilidade [20], possivelmente teríamos resultados mais eficientes. Convém ressaltar que o sistema Fung-Yu foi proposto como método rápido de enriquecimento seletivo através da motilidade de Listeria [41]. Durante o preparo dos tubos Fung-Yu observou-se, uma grande dificuldade em manter o meio semisólido no tubo capilar (Figura 1), ocorrendo, frequentemente, a mistura dos dois caldos com a porção semisólida. De forma que a presença de Listeria spp no caldo Fraser, poderia ter sido decorrência dessa mistura, e não em função da sua motilidade à 35°C, daí a obtenção de resultados semelhantes, nas mesmas amostras de queijo, utilizando-se tubos convencionais. No entanto, neste trabalho, não foi testada a incubação do sistema à 25°C.

O método de enriquecimento foi particularmente relevante, para a evidenciação de L. monocytogenes em amostras de queijos frescais. A não utilização desse método teria levado a vários resultados falso negativos (Tabela 2). Da mesma forma ART & ANDRÉ [2] observaram que sem um enriquecimento primário, 2/3 das amostras de alimentos positivas para Listeria spp não teriam sido evidenciadas. Este método atende portanto a legislação, que preconiza padrão zero de tolerância, em especial para alimentos prontos para consumo [22,40]. A adoção desse padrão por vários países visa assegurar um produto isento de risco para o consumidor. Apesar de uma única célula de L. monocytogenes não ser suficiente para causar listeriose, a sua presença no alimento coloca em risco a saúde do consumidor [26], pela sua capacidade de se multiplicar rapidamente nas condições de estocagem. Logo o estágio de enriquecimento nos meios LEB e Fraser prévio à semeadura, nos ágares Mox e Palcam foi importante, para evidenciar amostras positivas para L. monocytogenes. Deve-se ressaltar, no entanto, a importância dos métodos quantitativos, em particular do número mais provável, nas investigações de surtos e casos esporádicos de listeriose, bem como no estabelecimento de padrões para determinados tipos de alimentos [37].

A análise estatística desses resultados revelou que as diferenças observadas entre a semeadura direta, e o número mais provável não foram significativas. Já as observadas entre o método de enriquecimento e os demais testados o foram com relação à detecção de Listeria spp (p<0.01), sendo que na detecção de L. monocytogenes, as diferenças só foram significativas com relação à semeadura direta (p<0.05) (Tabela 2).

Vários experimentos tem sido realizados com o objetivo de comparar a eficiência dos meios de isolamento para L. monocytogenes em alimentos [2, 3, 7, 8, 9, 11, 15, 30, 42]. Na avaliação dos meios ágar Mox e ágar Palcam, observou-se que a eficiência de cada um variou em função da contaminação do queijo analisado. O ágar Mox por ser mais seletivo [42] mostrou-se superior ao ágar Palcam na detecção desse microrganismo a partir de queijo minas frescal artesanal, que apresentou níveis elevados de coliformes fecais (>10⁶ NMP/g). Esses resultados já haviam sido observados com leite cru [9], e em produtos cárneos [42], com perfis microbiológico muito semelhante ao encontrado nas amostras de queijo minas frescal de fabricação artesanal. Já a análise de queijos maturados (gorgonzola e roquefort) revelou não haver diferença entre os dois meios testados, as três amostras positivas para L. monocytogenes apresentaram níveis baixos de coliformes fecais (<10 NMP/g), indicando que não houve interferência desses microrganismos, no sentido de exercer um efeito antagônico ou de mascarar a sua presença durante o isolamento nos dois meios testados.

Das 103 amostras, de diferentes tipos de queijos (gorgonzola, roquefort, cheddar, brie, camembert, minas frescal e ricota) analisadas, 11 (10.8%) apresentaram-se contaminadas por L. monocytogenes, 13 (12.7%) por L. innocua, 6 (5.8%) por L grayi, e 1 (0.97%) por L. welshimeri. Foram positivos para L. monocytogenes, os queijos: gorgonzola, roquefort e minas frescal. É relevante a incidência de L. monocytogenes em 5.7% dos queijos maturados (gorgonzola e roquefort) analisados, pois no Brasil inexistem dados a esse respeito. DESTRO et al [8], verificaram a incidência de L. monocytogenes em torno de 10% dos queijos minas frescal comercializados em São Paulo — Brasil, enquanto CASAROTTI et al [5] e VIEIRA et al [38] não encontraram nenhuma Listeria spp neste mesmo tipo de queijo comercializado em Piracicaba-SP e no Rio de Janeiro, respectivamente. Essa discordância de resultados também têm sido relatadas por vários pesquisadores nos mais diversos tipos de queijos [4,6,13,23], provavelmente devido aos diferentes métodos e meios de cultura empregados no isolamento de L. monocytogenes bem como as diferenças entre os vários tipos de queijo.

4 — CONCLUSÃO

A eficiência dos diferentes procedimentos propostos para o isolamento de L. monocytogenes a partir de queijos está associada a inúmeros fatores como características intrínsecas da amostra analisada (pH, atividade de água, potencial de óxido-redução, conteúdo em nutrientes, microflora presente e a sua distribuição no alimento), seletividade dos meios de cultura e tipo de incubação (temperatura e atmosfera). Ressalta-se a importância da técnica dos tubos múltiplos (NMP) como método quantitativo, essencial nas investigações de surtos e adoção de padrões permitidos de L. monocytogenes em alimentos. O método de enriquecimento foi considerado o mais relevante na detecção de L. monocytogenes a partir de queijos, seguido do número mais provável e da semeadura direta. O ágar Mox mostrou-se eficiente principalmente para queijos com elevado nível de flora contaminante.

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[43] YU, L. S. L. & FUNG, D. Y. C Comparisons of selected methods with Fung-Yu tube procedure for determining Listeria monocytogenes and other Listeria spp in meats. J. Food Prot. v.55, p.349-355, 1992.

[44] YU, L. S. L. & FUNG, D. Y. C. Five-tube most-probable-number methods using the Fung-Yu tube for enumeration of Listeria monocytogenes inrestructured meat products during refrigerated storage. Int. J. Food Microbiol. v.18, p. 97-107, 1993.

[45] YU, L. S. L.; PRASAI, R. K.; FUNG, D. Y. C. Most Probable Numbers of Listeria species in raw meats detected by selective mobility enrichment. J. Food Prot. v.58, n.9, p. 943-945, 1995.

6 — AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à MERCK SA Indústrias Químicas pelos meios de cultura gentilmente cedidos para realização deste trabalho. Á CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro e pelas bolsas concedidas. Ao Dr. Ernesto Hofer da FIOCRUZ, pela assessoria prestada durante o desenvolvimento do trabalho. Á Rita de Cássia, pela colaboração nas análises microbiológicas.

² Prof^a. Dr^a do Departamento de Nutrição, CSAU/UFAL. Br. 101, km 14 Tabuleiro dos Martins, CEP: 57072-970, Maceió-Al

³ Bolsista CNPq, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes- UFRJ.

⁴ Prof^a Dr^a do Departamento de Microbiologia Médica do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes- UFRJ, CEP: 21941-590 Rio de Janeiro — RJ.

* A quem a correspondência deve ser enviada.

¹

Recebido para publicação em 13/05/97. Aceito para publicação em 25/05/98.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Dez 1998
• Data do Fascículo
  Maio 1998

Histórico

• Aceito
  25 Maio 1998
• Recebido
  13 Maio 1997