Produção de anticorpos para cafeína e seu derivado cafeinidina

Antisera production to caffeine and its derivative caffeinidine

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS PARA CAFEÍNA E SEU DERIVADO CAFEINIDINA¹

P. MAZZAFERA², A.P. VITÓRIA³

RESUMO

São apresentados dados sobre a conjugação de cafeína e seu derivado cafeinidina com albumina de soro bovino e sua utilização para a produção de anticorpos. Galinhas poedeiras foram imunizadas e as globulinas extraídas das gemas dos ovos. Por ensaios de imunoprecipitação pode-se verificar que ambos anticorpos reagiram com seus respectivos antígenos, cafeína e cafeinidina. Também verificou-se que a posição do radical metil em mono e dimetilxantinas era importante para o reconhecimento antígeno-anticorpo. Metilação na posição N-3 pareceu ser determinante para o reconhecimento pelo anticorpo produzido para o conjugado cafeinidina-BSA. Por outro lado, metilação na posição N-7 foi importante para o conjugado cafeína-BSA. Discute-se as vantagens de um anticorpo sobre o outro e a possibilidade de seu emprego em testes imunológicos para determinação de alcalóides purínicos totais em material vegetal e seus derivados alimentícios.

Palavras-chave: anticorpo, cafeína, cafeinidina, hapteno, imunoprecipitação

SUMMARY

ANTISERA PRODUCTION TO CAFFEINE AND ITS DERIVATIVE CAFFEINIDINE. Data on the conjugation of caffeine and its derivative caffeinidine with bovine serum albumin and their use to produce antisera are reported here. Chickens were immunized with the conjugates and antisera were extracted from egg yolks. In immunoprecipitation assays it was verified that both antisera were efficient against their respective antigens. It was also observed that the methyl position in mono and dimethylxanthines played a role in the recognition by the antisera. Methyl at N-3 position seemed to be important for the precipitation by the antisera produced to caffeinidine-BSA conjugate. On the other hand, methylation at N-7 position was important for caffeine-BSA conjugate. The advantages of each antisera and their potential application in imunological tests as a tool to determine total purine alkaloids in plant material and derived foodstuffs are discussed.

Key words: antisera, caffeine, caffeinidine, hapten, immunoprecipitation

1 - INTRODUÇÃO

Além de constituinte de várias plantas, sendo as principais representantes o café, o chá, chá mate (chimarrão), guaraná e a cola, o alcalóide cafeína é amplamente usado como aditivo em remédios, refrigerantes e alimentos (13). Em remédios, por exemplo, por ser um neuro-estimulante, serve para contrabalancear o efeito depressivo de outras substâncias. Na produção do café solúvel, na qual cada país possui suas normas quanto à quantidade mínima de cafeína (1), é comum sua adição na preparação do produto, a fim de atingir os níveis exigidos. Outro exemplo é a adição nos refrigerantes a base de cola.

Para a determinação de cafeína nesses produtos, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tem sido a técnica mais empregada. De métodos trabalhosos e demorados, tal como cromatografia em camada delgada (21), espectrometria em ultravioleta (10), cromatografia a gás (3), as análises em CLAE, com detecção no ultravioleta, representam um salto em economia de tempo e acuracidade dos resultados. Os primeiros trabalhos sobre o uso de CLAE para determinar cafeína estiveram relacionados com análises em vários alimentos e fluídos biológicos (22, 23) e ainda hoje vários são os trabalhos publicados sobre o assunto (4).

Porém, em plantas, devido à presença de inúmeros outros compostos que também absorvem na região de detecção de cafeína no ultravioleta (270 a 280 nm), dependendo da concentração do alcalóide se faz necessária uma pré-purificação (8), o que torna-se um inconveniente no que diz respeito ao tempo de análise. Além disso, trabalhos de melhoramento genético para a qualidade de bebida nos quais o teor de cafeína é acompanhado em centenas de plantas (14, 15, 16), o emprego de CLAE pode não ser muito vantajoso, uma vez que a lavagem da coluna cromatográfica e o re-equilíbrio podem ser necessários a cada amostra. O mesmo poderia ser dito em relação a outras plantas tal como o guaraná e chá mate, que possuem cafeína como o principal alcalóide purínico (11, 12, 13).

Imunologicamente, cafeína é definida como um hapteno, ou seja, uma substância com massa molecular menor que 1.000 e que não é antigênica (5). Para torná-las antigênicas, tais moléculas precisam ser covalentemente ligadas a moleculas maiores, normalmente proteínas, formando conjugados, e estes utilizados para a imunização de animais. A produção de anticorpos para conjugados proteína-alcalóides e sua aplicação na dosagem dos mesmos em material vegetal, através de diferentes testes imunológicos, vem sendo feita por alguns grupos (6, 7, 17). A principal vantagem alegada nestes trabalhos é que os testes imunológicos permitem a análise de um grande número de material ao mesmo tempo (96 determinações por placa imunológica). Como a leitura das reações desenvolvidas nas placas pode ser automatizada, a economia de tempo é maior ainda.

Uma vez que compostos secundários de plantas podem ter uma variação muito grande em estrutura, diferentes estratégias podem ser empregadas para a ligação da proteína ao hapteno (5). Sendo assim, o presente trabalho descreve duas metodologias para a obtenção de anticorpos a partir de ovos de galinhas imunizadas com conjugados de albumina de soro bovino com cafeína e com seu derivado cafeinidina.

2 - MATERIAL E MÉTODOS

2.1- Produção de conjugados proteína-hapteno

O conjugado cafeína e albumina de soro bovino (CAF-BSA) foi produzido com base em método estabelecido para o herbicida paraquat (18), que tem como princípio a ligação entre um radical carboxílico gerado na molécula de cafeína, com a lisina de BSA. O radical carboxílico foi gerado no N-9 da molécula de cafeína por tratamento com ácido 6-bromohexanóico (Figura 1A). Em 150 ml de isopropanol foram dissolvidos 0,5 g de CAF e 1 g de ácido bromohexanóico, sendo esta mistura refluxada por 22 h a 80°C. Após secagem sob vácuo o resíduo foi solubilizado em 3 ml de isopropanol, filtrado e seco no ambiente. Em seguida, 140 mg do pó obtido e 130 mg de BSA foram dissolvidos em 7 ml de tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 8,0. Posteriormente, acrescentou-se 140 mg de carbodiimida e a mistura permaneceu a 4°C, sob agitação suave com barra magnética por 48 h. Após nova adição de 50 mg de carbodiimida e agitação por mais 6 h, a mistura foi transferida para saco de diálise, com exclusão de 2.000 daltons, e dialisada por 48 h contra tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, com trocas de tampão a cada 12 h. Após a recuperação do dializado, determinou-se a concentração de proteína (2). A ligação de CAF à BSA pode ser averiguada pelo aumento da massa molar do BSA por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (dado não apresentado).

Cafeinidina (CFD) é sintetizada a partir de cafeína, com a abertura da molécula na posição C-2 por tratamento com álcali, havendo geração de um radical carboxílico (9). Resumidamente, 5 g do alcalóide foram dissolvidos em 40 ml de NaOH 2N e mantidos a 70-75°C por 4 h. Após neutralização com HCl concentrado para pH 6,7, a mistura foi seca a vácuo e o resíduo solubilizado com etanol. O material insolúvel foi removido por filtração e o filtrado evaporado, extraído com acetona e após secagem rendeu um óleo amarelo escuro. A formação de CFD e sua pureza pode ser avaliada por CLAE, de acordo com as condições descritas abaixo. Os tempos de retenção de CAF e CFD foram diferentes, e somente um pico foi observado quando CFD foi injetada sozinha (dados não mostrados). A obtenção do conjugado CFD-BSA (Figura 1B) foi feita exatamente como descrito acima para CAF-BSA, sendo que foram utilizados 200 µl do óleo final obtido.

2.2 - Produção dos anticorpos contra os conjugados proteína-hapteno

Para a produção de anticorpos contra os conjugados CAF-BSA e CFD-BSA, imunizaram-se galinhas poedeiras e os anticorpos foram extraídos das gemas de ovos (20). Foram utilzados três animais para cada conjugado. A administração foi feita via sub-cutânea nas axilas das asas, alternando-se as mesmas a cada aplicação. Na primeira aplicação, 200 µg de cada antígeno foram misturados (1/1, p/v) com o adjuvante completo de Freund. Após duas semanas, em uma segunda aplicação, a mesma quantidade foi misturada com o adjuvante incompleto de Freund (1/1, v/v). Foram feitas mais quatro aplicações semanais iguais a esta.

As imunoglobulinas foram obtidas das gemas de ovos coletados entre o 18^o e o 41^o dia após a última aplicação. A purificação foi feita de acordo com POLSON et al. (20). A concentração de proteínas foi determinada na fração purificada de anticorpos, que foram mantidos em freezer (-20°C).

2.3 - Ensaios de imunoprecipitação

Foram realizados dois ensaios de imunoprecipitação. No primeiro, foram colocadas quantidades conhecidas de CAF (1,25 µg) e CFD (1,87 µl) em tubos Eppendorf, na presença de diferentes quantidades de anticorpos, variando de 5 a 200 µg de proteína. O volume foi ajustado para 250 µl com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7 e os tubos deixados por 24 h na temperatura ambiente. Em seguida, adicionou-se sulfato de amônia (170 mg) para saturação próxima a 100% e os tubos foram centrifugados a 13.000 rpm por 10 minutos em centrífuga de bancada, para eliminação das proteínas. Nos sobrenadantes foram analisadas CAF e CFD. Os dados foram calculados com a porcentagem da CAF ou CFD precipitada em relação às quantidades iniciais adicionadas nos tubos. Uma vez que não se sabia quantitativamente o quanto de CFD estava sendo adicionado, pois esta não é vendida comercialmente e desconhece-se o seu coeficiente de extinção, o desaparecimento da mesma do sobrenadante, devido à complexação com o anticorpo, foi determinado por comparação das áreas dos picos obtidos em CLAE com aquelas de volume conhecido da substância pura.

As determinações de CAF e CFD em CLAE foram feitas tendo como solvente isocrático metanol 20% em solução aquosa de ácido acético 0,5%, com fluxo de 1ml/min. CAF e CFD foram separadas em coluna de fase reversa C18 (Supelco, supelcosil, 4 mm X 15 mm, 5 µm) e detectadas em detector de UV operando em 280 nm para CAF e 254 para CFD (16, 19). Para a determinação das quantidades encontradas, as áreas obtidas foram comparadas com aquelas de padrões de CAF e CFD.

Outro ensaio de imunoprecipitação foi realizado para avaliar a reatividade dos anticorpos com xantina e diferentes metilxantinas [3-metilxantina, 7-metilxantina, teobromina (3,7-dimetilxantina), paraxantina (1,7-dimetilxantina), teofilina (1,3-dimetilxantina) e cafeína]. A proporção foi de 200 µg de anticorpo e 5 µg de cada metilxantina. O volume final foi de 250 µl, sendo completado com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7. A incubação foi feita como descrita acima, assim como a precipitação dos anticorpos. Cafeína, teofilina e paraxantina no sobrenadante foram analisadas em CLAE também como descrito anteriormente. Teobromina foi analisada com metanol 15%; 3- e 7-metilxantina com metanol 10% em fluxo de 0,8 ml/min; xantina com metanol 5% e fluxo de 0,8 ml/min e ácido úrico com apenas com solução aquosa de ácido acético 0,5% com fluxo de 0,8 ml/min. As áreas dos picos obtidos foram comparadas com aquelas obtidas com padrões puros.

3.1 - RESULTADOS E DISCUSSÃO

No primeiro ensaio de imunoprecipitação ambos os anticorpos foram capazes de reconhecer os respectivos haptenos na forma não conjugada (Figura 2). Nos dois casos, houve precipitação de mais de 50% quando adicionou-se mais de 100 mg de anticorpo. A imunoprecipitação da CAF foi evidente quando a proporção de anticorpos:CAF foi superior à 40:1 (50 µg anticorpo / 1,25 µg CAF).

No segundo ensaio testou-se a especificidade dos anticorpos contra cafeína e outras metilxantinas, mantendo-se fixa a proporção anticorpo:metilxantinas em 40:1 (2000 µg anticorpo / 5 µg CAF).

A Figura 3 mostra que o anticorpo contra CFD-BSA mostrou maior afinidade por CAF do que aquele contra CAF-BSA, sendo observada 24% de precipitação contra 8%, respectivamente. O mesmo anticorpo foi eficiente para precipitar paraxantina e teobromina. O anticorpo contra o conjugado CAF-BSA foi eficiente para precipitar 3-metilxantina, teobromina e teofilina.

É interessante notar que a maior afinidade do anticorpo para CFD-BSA ocorreu com as xantinas metiladas na posição 7 e em outra posição. Assim, somente a metilação em N-7 ou N-3 não conferiu bom reconhecimento, porém, isto ocorreu quando metiladas as posições N-3,7 (teobromina), N-1,7 (paraxantina) e N-1,3,7 (cafeína). O fato da metilação na posição N-7 ser oposta à ligação com o BSA (ver Figura 1B) parece ser determinante no reconhecimento. Provavelmente isto se deve a essa parte da molécula ficar mais exposta para a formação de anticorpos.

De forma semelhante, o melhor reconhecimento do anticorpo contra CAF-BSA foi com 3-metilxantina, teobromina (3,7-dimetilxantina) e teofilina (1,3-dimetilxantina). Neste caso a metilação na posição N-3 parece ser determinante. As metilações nas posições N-1 e N-7 não parecem colaborar no reconhecimento, pelo contrário, uma vez que menor precipitação ocorreu com paraxantina (1,7-dimetilxantina) e cafeína (1,3,7-trimetilxantina). Também neste caso existe a evidência de que o posicionamento oposto de BSA e a metilação em N-3 desempenha papel importante no reconhecimento entre antígeno e anticorpo.

A correlação calculada entre os dados para ambos anticorpos resultou em r = -0,543, sendo mais um indicador da importância das posicões dos grupos metil e da ligação com o BSA nos conjugados utilizados na produção dos anticorpos. Diferenças na estrutura de alcalóides afetando a afinidade por anticorpos também foi demonstrado para alcalóides de lupino (7).

Aparentemente, a produção e utilização do anticorpo contra o conjugado CFD-BSA parece ser mais vantajosa. O método empregado para sua produção é mais simples e mais barato, uma vez que para a abertura do anel de cafeína são necessários reagentes mais baratos e prontamente disponíveis em qualquer laboratório. Além disso, existe melhor reconhecimento entre antígeno e anticorpo para cafeína e teobromina, os alcalóides que normalmente são encontrados em maiores quantidades em plantas (13, 22). Teofilina e, principalmente, paraxantina, são encontradas em pequenas quantidades em tecidos vegetais.

No entanto, uma vez que ambos alcalóides reconhecem as principais metilxantinas de plantas, seria possível sua utilização para o desenvolvimento de um teste imunológico, tal como o ELISA, usado para outros alcalóides (6, 7, 17). Neste caso, uma vez que existe variação de planta para planta em relação ao principal alcalóide, como por exemplo a teobromina no cacau e cafeína no café, existe a necessidade da obtenção de uma curva de calibração para cada material. Para subprodutos como chocolate e café em pó haveria a mesma necessidade. Para o caso de líquidos corpóreos, outros testes seriam necessários, uma vez que vários ácidos metilúricos são formados na degradação de cafeína em animais, e que poderiam, portanto, apresentar reação com os anticorpos contra CAF-BSA e CFD-BSA.

4 - CONCLUSÕES

- Os conjugados de CAF e CFD com BSA foram imunogênicos.

- Anticorpos extraídos da gema de ovo de galinha foram efetivos contra várias metilxantinas além de cafeína.

- A posição da metilação nas moléculas de metilxantinas pareceu ser determinante para o reconhecimentno entre antígeno e anticorpo.

- O anticorpo contra CFD-BSA pareceu ser mais eficiente na precipitação de alguns alcalóides purínicos (teobromina e cafeína) que são mais comumente encontrado em plantas ou seus derivados alimentícios.

- O anticorpo contra CFD-BSA aparentemente é o mais vantajoso de se produzir também pela facilidade metodológica e seu custo.

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Jorge Vega pela leitura criteriosa durante a preparação do manuscrito.

² Professor do Departamento de Fisiologia Vegetal, Instituto de Biologia, Unicamp, CP6109, CEP13083-970, Campinas, SP. E-mail: [e-mail]. Com Bolsa de Pesquisa do CNPq.

³ Aluna de doutorado do Departamento de Fisiologia Vegetal, Instituto de Biologia, Unicamp. Bolsista do CNPq.

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1

Recebido para publicação em 15/10/97. Aceito para publicação em 04/03/98.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Set 2001
• Data do Fascículo
  Abr 1998

Histórico

• Aceito
  04 Mar 1998
• Recebido
  15 Out 1997