Estudo do comportamento eletroquímico da enzima peroxidase na presença de peróxido de hidrogênio e ácido 5-aminossalicílico

Investigation on electrochemical behavior of peroxidase enzyme in the presence of hydrogen peroxide and 5-aminosalicylic acid

Estudo do comportamento eletroquímico da enzima peroxidase na presença de peróxido de hidrogênio e ácido 5-aminossalicílico

Investigation on electrochemical behavior of peroxidase enzyme in the presence of hydrogen peroxide and 5-aminosalicylic acid

C. V. Uliana; C. S Riccardi; H. Yamanaka^*

Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química, Campus de Araraquara, CP 355, 14800-900, Araraquara, SP

RESUMO

O comportamento eletroquímico da enzima peroxidase (HRP) foi estudado utilizando o peróxido de hidrogênio como substrato enzimático e o ácido 5-aminossalicílico (5-ASA) como mediador de elétrons sobre eletrodo de grafite. Diversos parâmetros foram otimizados, tais como, o potencial aplicado à técnica amperométrica fixado em -0,125V, a solução tampão fosfato-citrato 0,1 mol L-1 pH 5,0 como eletrólito suporte e a proporção entre o 5-ASA e H₂O₂ em 1:7, entre outros. Foi observada a catálise da reação de oxidação do peróxido de hidrogênio na presença da enzima HRP e do mediador 5-ASA. O produto dessa oxidação foi reduzido na superfície do eletrodo, evidenciando um significativo aumento na intensidade da corrente catódica.

Palavras-chave: peroxidase; peróxido de hidrogênio; ácido 5-aminossalicílico; eletrodo de grafite.

ABSTRACT

The electrochemical behavior of the enzyme peroxidase (HRP) was investigated using the hydrogen peroxide as enzymatic substrate and the 5-aminosalicylic acid (5-ASA) as mediator of electrons on graphite electrodes. Several parameters were optimized, namely, the applied potential to the amperometric technique fixed in -0.125V, the 0.1 mol L^-1 phosphate-citrate buffer at pH 5.0 as supporting electrolyte and the proportion between the 5-ASA and H₂O₂ in 1:7, among others. It was observed the catalysis of the oxidation reaction of the H₂O₂ in the presence of the enzyme HRP and 5-ASA. The oxidation product was reduced in the electrode surface, evidencing a significant increase in the intensity of the cathodic current.

Keywords: peroxidase; hydrogen peroxide; 5-aminosalicilic acid; graphite electrode.

Introdução

A enzima peroxidase (HRP, EC: 1.11.1.7, peróxido de hidrogênio oxidorredutase), proveniente de raiz de rábano silvestre (horseradish root), é freqüentemente empregada em química analítica por manter uma resposta estável por longos períodos de tempo a temperatura ambiente e em um amplo intervalo de pH, além de ter custo financeiro relativamente baixo e pode ser encontrada comercialmente em diversos graus de pureza [1].

A HRP é uma glicoproteína consistida de 308 resíduos de aminoácidos, dois Ca²⁺ e como grupo prostético (sítio ativo da enzima) uma ferroprotoporfirina IX, sendo denominado grupo heme, que está ligado não covalentemente à cadeia polipeptídica. O íon férrico central da referida protoporfirina está coordenado a um resíduo de histidina. As propriedades catalíticas, estruturais e eletroquímicas das peroxidases foram revisadas por Ruzgas e col. [2].

Esta enzima catalisa a redução de peróxidos, por meio de um mecanismo complexo de reações [3]:

A equação 1 envolve a oxidação do grupo prostético heme da peroxidase pelo peróxido de hidrogênio (ou hidroperóxidos orgânicos) por dois elétrons, e a formação de um composto intermediário, no estado (Fe⁵⁺, Composto I), consistindo do ferro oxiferril (O=Fe⁵⁺) e do cátion radical p porfirínico. Na equação 2, o composto intermediário (Fe⁵⁺) formado sofre uma reação de redução pela transferência de um elétron do doador SH, formando composto intermediário, no estado de oxidação (Fe⁴⁺, Composto II). Um elétron adicional pode ser transferido, proveniente de uma segunda molécula AH (Equação 3), de forma que a enzima retorne a forma nativa (Fe³⁺). Nas etapas 2 e 3, a espécie doadora de elétrons (SH) é oxidada.

Quando o eletrodo substitui o substrato doador de elétrons em um ciclo comum da reação do peróxido, o processo é denominado transferência eletrônica direta. Enzimas imobilizadas no eletrodo podem ser oxidadas pelo peróxido (equação 1) e então reduzidas por elétrons provenientes do eletrodo (equação 4).

A transferência eletrônica direta entre a HRP adsorvida em eletrodos tem sido demonstrada em publicações desde 1978 [4]. Vários materiais eletródicos têm sido empregados para estabilizar a transferência eletrônica direta da HRP, entre eles, carbono vítreo [5], grafite [6], ouro modificado [7] e platina [8]. No entanto, em geral, esse processo é lento. Assim, um mediador de transferência de elétrons tem sido usado para melhorar a velocidade de transferência eletrônica, sendo mais eficiente na redução bioeletrocatalítica de peróxidos em eletrodos modificados com HRP.

Quando um doador de elétrons (S) está presente num sistema peroxidase-eletrodo, os processos diretos e mediados podem ocorrer simultaneamente com a redução do doador S• oxidado pelo eletrodo (equação 5).

Os mediadores são pequenas moléculas passíveis de redução/oxidação com alta velocidade de transferência eletrônica que distribuem os elétrons da superfície do eletrodo para os compostos I e II. A molécula do mediador escolhido deve reagir rapidamente com a peroxidase oxidada. Uma variedade de moléculas doadoras de elétrons pode reagir rapidamente com os compostos I e II, sendo que, para a enzima HRP pode-se utilizar como mediador de elétrons: hidroquinona [9, 10], ácido ascórbico [11], ferroceno [12,13], iodeto [14, 15, 16], entre outros. O ácido 5-aminossalicílico (5-ASA) também tem sido usado como mediador para a enzima HRP em imunoensaios com detecção ótica [17], potenciométrica [18] e amperométrica [19, 20, 21], sendo que nos trabalhos utilizando a técnica amperométrica, a HRP foi imobilizada na superfície dos diferentes eletrodos.

O presente trabalho apresenta um estudo sobre o comportamento eletroquímico da enzima HRP sobre eletrodo de grafite utilizando o peróxido de hidrogênio como substrato enzimático e o 5-ASA como mediador da transferência eletrônica.

Materiais e métodos

Equipamentos e Reagentes

As medidas eletroquímicas foram realizadas empregando-se um Potenciostato-Galvanostato PAR EG&G modelo 263. Uma célula eletroquímica de compartimento único de 5 mL foi utilizada para as medidas, juntamente com um sistema de três eletrodos: eletrodo de trabalho (eletrodos de grafite, perfazendo uma área de 0,00318 cm²), eletrodo de referência (Ag/AgCl) e o eletrodo auxiliar (Pt, área de 1 cm²).

A enzima peroxidase (987 unidades HRP/mg proteína) foi fornecida pela Sigma; fosfato de sódio monobásico, ácido cítrico e fosfato de sódio dibásico pela Mallinckrodt, peróxido de hidrogênio estabilizado fornecido pela Merck e ácido 5-aminossalicílico (5-ASA) pela Acros. Empregou-se o sistema Milli-Q Ultra Pure Water System da marca Millipore, para a obtenção de água ultrapura.

A solução tampão fosfato de sódio 0,1 mol L^-1 pH 7,0 foi preparada a partir dos sais Na₂HPO₄/NaH₂PO₄. As soluções tampão fosfato-citrato 0,1 mol L^-1 pH 5,0 foram adequadamente preparadas a partir dos respectivos sais segundo Gomori [22]. Para a preparação da solução tampão Britton-Robinson utilizou-se duas soluções, sendo a solução 1 composta de uma mistura de 4,0 mol L^-1 dos ácidos ortofosfórico, acético e bórico e a solução 2 de hidróxido de sódio 1,0 mol L^-1 empregada para ajuste do pH²³. A enzima HRP foi dissolvida em água deionizada (C_f = 2,0 mg mL^-1 de proteína), sendo a solução armazenada a – 4°C como solução estoque. O monitoramento da atividade da HRP foi realizado empregando-se soluções de H₂O₂ e 5-ASA, preparadas imediatamente antes do uso, em água deionizada, à temperatura de (25 ± 1)°C.

Resultados e discussão

Comportamento eletroanalítico do 5-ASA na presença de H₂O₂ e da HRP.

Um estudo por voltametria cíclica foi realizado empregando-se o intervalo de potencial de +0,250V a -0,300 V e n= 0,050 V s^-1. O monitoramento da reação catalisada ou não pela HRP foi conduzido em solução tampão fosfato-citrato pH 5,0 na presença de H₂O₂ 1,0 x 10^-3 mol L^-1 e 5-ASA 1,0 x 10^-3 mol L^-1.

O voltamograma cíclico referente à reação do 5-ASA apresentou dois picos catódicos (E_pc1 = 0,067 V / E_pc2 = -0,107 V) e dois picos anódicos (E_pa1 = 0,125 V / E_pa2 = -0,080 V), como pode ser observado na Figura 1B. A oxidação do 5-ASA é um processo com transferência de dois elétrons para formação das espécies eletroquimicamente ativas 5-ASA quinoneimina (5-ASA-QI). A quinoneimina pode ser hidrolizada a benzoquinona que forma o par redox quinona/hidroquinona [24].

Na presença da HRP, o 5-ASA oxidado pela catálise enzimática (5-ASA_ox), é detectado na superfície do eletrodo por meio de técnicas eletroanalíticas. Observou-se um aumento significativo da intensidade de corrente do pico catódico para o sistema H₂O₂ / 5-ASA; valor de I_pc2 de -1,22 µA na ausência da HRP (Figura 1B) para -2,72 µA na presença da enzima (Figura 1 C). Quando a medida foi realizada na solução contendo H₂O₂ e HRP na ausência de 5-ASA, o valor da intensidade de corrente foi baixo (Figura 1A).

Efeito do valor de potencial aplicado na técnica amperométrica.

Transientes de +0,100V a –0,250V vs. Ag/AgCl foram efetuados para avaliar o efeito do potencial aplicado no comportamento do sistema enzimático. A Figura 2 mostra que, na presença da enzima HRP, houve um aumento do valor de intensidade de corrente catódica em função do potencial aplicado de +0,100 a –0,125V, mantendo-se constante a partir deste potencial. Na ausência da HRP, a intensidade de corrente nesse intervalo de potencial é praticamente constante e próximo de zero. Portanto, foi definido o potencial de –0,125V para o monitoramento da atividade enzimática.

Influência do pH.

A enzima HRP em solução apresentou atividade em uma ampla faixa de pH entre 4,0 e 8,0 (Figura 3), sendo que o valor de intensidade de corrente foi máximo em pH 4,0 – 5,0. O valor de pH igual a 5,0 foi escolhido para o monitoramento amperométrico da atividade enzimática nos experimentos subseqüentes.

Efeito do eletrólito de suporte

Avaliou-se a influência do eletrólito de suporte na resposta enzimática empregando-se as seguintes soluções tampão 0,1 mol L^-1 pH 5,0: citrato de sódio, Britton-Robinson, acetato de sódio, fosfato-citrato e fosfato de sódio. A atividade da enzima foi monitorada a –0,125 V empregando-se o sistema 5-ASA / H₂O₂ (ambos na concentração 1,0 x 10^-3 mol L^-1).

A Figura 4 indica que, para o sistema contendo 5-ASA / H₂O₂ na ausência da HRP em solução tampão fosfato-citrato, o valor de intensidade de corrente é menor quando comparado às demais soluções, enquanto que, na presença da HRP há significativo aumento de corrente. Portanto, a solução tampão fosfato-citrato de sódio foi escolhida para o monitoramento da atividade da enzima HRP.

Efeito da proporção entre os substratos 5-ASA/ H₂O₂

Inicialmente, para estudar o efeito da proporção H₂O₂/5-ASA, avaliou-se a resposta enzimática fixando a concentração de H₂O₂ em 0,5 x 10^-3 mol L^-1 frente a um aumento da concentração de 5-ASA (0,250; 0,750; 1,00; 1,50 e 2,00 x 10^-3 mol L^-1). A catálise enzimática foi observada para os substratos H₂O₂/5-ASA nas proporções 1:0,5; 1:1,0 e 1:1,5. Porém, o valor de intensidade de corrente catódica diminui com o aumento da concentração de 5-ASA na presença da enzima HRP e, conforme descrito na literatura²⁰, concentrações elevadas de 5-ASA podem induzir a um bloqueio parcial da superfície do eletrodo pela forma oxidada do substrato enzimático. Deste modo, avaliou-se a resposta enzimática fixando a concentração do 5-ASA em 2,50 x 10^-4 mol L^-1 frente a um aumento da concentração de H₂O_2. A resposta enzimática máxima ocorreu quando a proporção para os substratos 5-ASA/H₂O₂ foi de 1:7. Para concentrações elevadas de H₂O₂ houve um aumento do valor de intensidade de corrente catódica para o sistema na ausência da enzima HRP, não sendo viável o monitoramento da atividade da enzima acima da proporção de 1:7 entre 5-ASA/H₂O₂.

Estudo do tempo de incubação dos eletrodos na solução contendo 5-ASA/H₂O₂/HRP antes das medidas amperométricas.

Seqüencialmente, avaliou-se a variação da intensidade de corrente devido a um aumento do tempo de incubação dos eletrodos na solução contendo 5-ASA/H₂O₂ na ausência e na presença da HRP (Figura 5). Na ausência da enzima, observou-se um ligeiro aumento do valor de intensidade de corrente que se estabiliza a partir de 10 minutos até pelo menos 30 minutos de incubação. Na presença de 1,0 U mL^-1 de HRP , ocorreu um aumento significativo do valor de intensidade de corrente a partir de 2 minutos de incubação da reação, tornando-se constante a partir desse tempo. Este tempo de incubação é relativamente curto, quando comparado ao sistema que utiliza o iodeto como mediador, por exemplo, cujo tempo de incubação é de 10 minutos antes das medidas [14,15]. Adotou-se para todos os experimentos, um tempo de incubação do sistema 5-ASA/H₂O₂ de 2 minutos antes do início das medidas eletroanalíticas.

Curva analítica da enzima HRP

A curva analítica da HRP (0,0 a 43 µg mL^-1), em diferentes concentrações dos substratos 5-ASA/H₂O₂ proporção 1:7, dentro dos pontos da linearidade (concentração 5-ASA/ H₂O₂: a) 0,125 e 0,875, b) 0,250 e 1,75, c) 0,500 e 3,50; d) 1,00 e 7,00 x 10^-3 mol L^-1, respectivamente) do sistema é mostrada na Figura 6. Os valores de intensidade de corrente catódica aumentaram proporcionalmente à concentração de HRP adicionada ao sistema para todas as concentrações estudadas. Pode-se observar que a resposta enzimática apresentou o maior intervalo linear, de 0,10 a 13 µg mL^-1, para concentrações de 0,50 x 10^-3 mol L^-1 de 5-ASA e 3,50 x 10^-3 mol L^-1 de H₂O₂.

A otimização das condições experimentais para o monitoramento da atividade catalisadora da enzima HRP possibilita o emprego da metodologia no desenvolvimento de eletrodos modificados com a enzima para aplicação em biossensores.

Conclusões

A enzima HRP catalisa a reação de oxidação do mediador de elétrons ácido 5-aminossalicílico sobre eletrodo de grafite, evidenciado pelo significativo aumento da intensidade de corrente de redução do 5-ASA_ox. No entanto, em altas concentrações do substrato H₂O₂ e do 5-ASA, ocorre a inibição do sítio catalítico da enzima. O potencial de -0,125 V aplicado na técnica amperométrica, inferior aos encontrados na literatura para outros mediadores que variam de -0,150 a -0,400V, apresenta a vantagem de diminuir a interferência de outras espécies que podem ser reduzidas na superfície do eletrodo. Desta maneira, foi possível determinar as condições experimentais ótimas para o monitoramento da atividade catalisadora da enzima HRP.

Agradecimentos

Os autores agradecem à FAPESP pelo suporte financeiro.

Recebido em 25 de fevereiro de 2008

Aceito em 27 de março de 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Maio 2008
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Aceito
  27 Mar 2008
• Recebido
  25 Fev 2008