Constituintes químicos isolados dos caules de Michelia champaca L. (Magnoliaceae)

Chemical constituents of stems from Michelia champaca L. (Magnoliaceae)

Resumos

O fracionamento cromatográfico da fase diclorometânica dos caules de Michelia champaca, forneceu quatro substâncias: álcool 4-O-beta-D-glicopiranosídeo sinapílico, aldeído 4-O-beta-D-glicopiranosídeo sinápico, siringaresinol e N-acetilnonaina. Extração ácido-base de uma nova porção do extrato bruto etanólico permitiu a identificação do alcalóide liriodenina. Os derivados fenilpropanoídicos e o alcalóide N-acetilnonaina estão sendo descritos pela primeira vez no gênero Michelia. O alcalóide liriodenina e a lignana siringaresinol apresentaram atividade antifúngica moderada.

Magnoliaceae; Michelia champaca; alcalóides; atividade antifúngica

The fractionation of the dichlorometanic layer of dried stems of Michelia champaca afforded four substances: sinapyl 4-O-beta-D-glucopyranoside alcohol, sinapyl 4-O-beta-D-glucopyranoside aldehyde, syringaresinol and N-acetylnonaine. Part of the crude extract portion was submitted to acid-basic extraction allowed the identification of the alkaloid liriodenine. The two phenylpropanoids derivatives and the alkaloid N-acetylnonaine were been reported for the first time from Michelia genus. The alkaloid liriodenine and the lignan syringaresinol showed moderate antifungal activity.

Magnoliaceae; Michelia champaca; alkaloids; antifungal activity

Constituintes químicos isolados dos caules de Michelia champaca L. (Magnoliaceae)

Chemical constituents of stems from Michelia champaca L. (Magnoliaceae)

M. C. M. Monteiro^I; I. H. Leptokarydis^I; G. H. Silva^{I, II}; V. C. da Silva^I; V. S. Bolzani^I; M. C. M. Young^III; M. N. Lopes^I,*

^IDepartamento de Química Orgânica, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", CP 355, CEP 14800-900, Araraquara, SP, Brasil

^IIDepartamento de Química, Universidade Federal de Sergipe, CEP 49100-000, Aracajú, SE, Brasil

^IIISeção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica, CP 4005, CEP 01061-970, São Paulo, SP, Brasil

RESUMO

O fracionamento cromatográfico da fase diclorometânica dos caules de Michelia champaca, forneceu quatro substâncias: álcool 4-O-b-D-glicopiranosídeo sinapílico, aldeído 4-O-b-D-glicopiranosídeo sinápico, siringaresinol e N-acetilnonaina. Extração ácido-base de uma nova porção do extrato bruto etanólico permitiu a identificação do alcalóide liriodenina. Os derivados fenilpropanoídicos e o alcalóide N-acetilnonaina estão sendo descritos pela primeira vez no gênero Michelia. O alcalóide liriodenina e a lignana siringaresinol apresentaram atividade antifúngica moderada.

Palavras-chave: Magnoliaceae; Michelia champaca; alcalóides; atividade antifúngica.

ABSTRACT

The fractionation of the dichlorometanic layer of dried stems of Michelia champaca afforded four substances: sinapyl 4-O-b-D-glucopyranoside alcohol, sinapyl 4-O-b-D-glucopyranoside aldehyde, syringaresinol and N-acetylnonaine. Part of the crude extract portion was submitted to acid-basic extraction allowed the identification of the alkaloid liriodenine. The two phenylpropanoids derivatives and the alkaloid N-acetylnonaine were been reported for the first time from Michelia genus. The alkaloid liriodenine and the lignan syringaresinol showed moderate antifungal activity.

Keywords: Magnoliaceae, Michelia champaca, alkaloids, antifungal activity

Introdução

Magnoliaceae compreende cerca de 10 gêneros e 220 espécies, sendo que a maioria ocorre no Hemisfério Norte, mas também são encontrados na Ásia (Índia e Malásia) e América do Sul (Brasil). No Brasil são cultivadas várias espécies dos gêneros Magnolia e Michelia, popularmente conhecidas como magnólia amarela [1].

A espécie Michelia champaca aparece como uma planta importante na medicina indígena [2]. É usada pela população para regular a menstruação, combater infecções da garganta e febres, artrites, reumatismos [3], como anticoncepcional [2] e como proteção pós-parto [4]. Estudo farmacológico com o extrato da casca da raiz indicou propriedade inseticida potente contra a larva do mosquito Aedes egyptii [5].

Estudos fitoquímico e biológico com raízes [6], cascas da raiz [7] e folhas [6] de M. champaca levaram ao isolamento de lactonas sesquiterpênicas com significativa atividade antitumoral e permitiram estabelecer o perfil químico deste gênero como essencialmente terpênico [5], com predominância das lactonas sesquiterpênicas. KHAN e colaboradores [4] relatam, com base em triagem fitoquímica, a presença de alcalóides, flavonóides, taninos, saponinas, além de triterpenóides em folhas, sementes, caules e raízes de M. champaca. O flavonóide quercetina foi isolado das flores, pela primeira vez no gênero por KAPOOR e JAGGI [8].

Além da atividade antitumoral descrita anteriormente, alguns autores relatam também atividade antifúngica para a espécie. O extrato metanólico das flores de M. champaca mostrou forte atividade frente ao patógeno Staphylococcus aureus [9]. Os extratos diclorometânico e metanólico das folhas apresentaram atividade moderada frente a vários fungos patogênicos e fitopatogênicos [10]. Ainda, sementes, caules e raízes foram bioativos quando ensaiados com fungos patogênicos humanos [4].

Neste trabalho, descrevemos o fracionamento biomonitorado dos caules de M. champaca, buscando isolar e identificar os possíveis metabólitos secundários responsáveis pela atividade antifúngica detectada na fase diclorometânica quando bioensaiadas com os fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum.

Materiais e Métodos

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros de RMN foram registrados em espectrômetro Varian AS 500 (500 MHz para ¹H e 125 MHz para ¹³C). Foram utilizados os solventes deuterados CDCl₃, DMSO-d₆ e CD₃OD, produzidos pela Acros, Aldrich ou CIL, sendo TMS o padrão interno. As colunas cromatográficas tiveram como fase estacionária sílica gel 60 H (70 - 230 mesh, Merck) e sílica C18 (43 - 60 µm). As análises em cromatografia em camada delgada foram realizadas em sílica gel 60 F₂₅₄ (placa) e as manchas visualizadas por absorção da radiação UV, anisaldeído 2% em H₂SO₄ seguida de aquecimento, câmara de iodo e solução dragendorff. Os cromatogramas foram obtidos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), num aparelho Varian ProStar, com detector UV-Vis, registrados em microcomputador de 500 MHz com processador Pentium II. Foram utilizadas colunas analíticas Phenomenex Luna C18 (5 ?m, 250 x 4,6 mm) e coluna preparativa Phenomenex Luna C18 (10 µm, 250 x 21,20 mm). Os solventes orgânicos utilizados para obtenção de extratos e fracionamentos foram das marcas Mallinckrodt, Synth e J. T. Baker (grau CLAE). A água (grau CLAE) foi obtida usando um sistema de purificação Milli-Q Plus (Millipore). As soluções foram concentradas em evaporador rotativo Buchi R-114, sob pressão reduzida. Os espectros de massas de baixa resolução foram obtidos em um espectrômetro Platfform, no modo electrospray. Os espectros de infravermelho foram obtidos em um espectrômetro Nicolet-730 FT-IR.

Material vegetal

Michelia champaca L. (Magnoliaceae) foi coletada no Campus da Universidade de São Paulo (USP), em Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil e identificada pela Dra. Inês Cordeiro do Instituto de Botânica da Secretaria do Meio Ambiente do Estado de São Paulo.

Extração e isolamento dos constituintes químicos

Os caules M. champaca foram secos à temperatura ambiente, moídos e submetidos à percolação em etanol, resultando no extrato bruto (55,30 g), após evaporação do solvente sob pressão reduzida. O extrato bruto foi solubilizado em MeOH/H₂O (70:30, v/v) e submetico à partição com solventes de diferentes polaridades, fornecendo as fases hexânica (9,00 g), diclorometânica (13,04 g), acetato de etila (4,82 g), n-butanólica (11,90 g) e hidroalcóolica (9,08 g). Todas essas fases foram bioensaiadas para averiguação da atividade antifúngica.

Parte da fase diclorometânica (6,5 g), a qual foi a única a apresentar atividade, foi submetida à cromatografia em coluna (CC) usando sílica gel (70 - 230 mesh) e eluída com hexano/AcOEt e AcOEt/MeOH em misturas de polaridade crescente, fornecendo 22 frações, após análise por cromatografia em camada delgada. A fração 8 (690 mg, eluída em AcOEt/MeOH 80:20, v/v) foi submetida à CC utilizando sílica de fase reversa C18, eluída com MeOH/H₂O em gradiente decrescente de polaridade, obtendo-se 6 frações. A subfração 8.3 (74,2 mg, eluída em AcOEt/MeOH 40:60, v/v) foi submetida a CLAE preparativa em fase reversa C18 (l = 254 nm, MeOH/H₂O 80:20 (v/v), fluxo de 10 mL min^-1), fornecendo as substâncias 1 (4,6 mg) e 2 (3,7 mg). A fração 7 (420 mg, Hex/AcOEt 10:90, v/v) foi cromatografada em coluna de fase reversa C18, eluída em MeOH/H₂O em gradiente crescente de polaridade, obtendo-se 10 frações. A subfração 7.5 (69,6 mg, MeOH/H₂O 65:35, v/v) foi submetida a CLAE preparativa l = 247 nm, MeOH/H₂O 50:50 (v/v), fluxo de 17 mL min^-1) e forneceu a substância 3 (9,3 mg). A fração 5 (380 mg, Hex/AcOEt 40:60, v/v) foi também submetida a cromatografia em fase reversa, à vácuo, fornecendo 11 frações. A subfração 5.8 (70,9 mg, MeOH/H₂O 80:20, v/v) foi submetida a cromatografia em camada delgada preparativa de fase normal, sendo eluída em AcOEt/MeOH 20:80 (v/v) e fornecendo a substância 4 (8,0 mg), após recristalização em MeOH.

Uma nova porção do extrato bruto (25,0 g) foi solubilizada em HCl 5%, após precipitação do material graxo com metanol. Fez-se, em seguida, extração com AcOEt, basificação da fase aquosa e novamente extração com AcOEt [11]. A fração alcaloídica (247,4 mg) foi submetida à cromatografia em coluna utilizando C18, eluída em MeOH/H₂O em gradiente decrescente de polaridade, fornecendo a substância 5 (14,5 mg, MeOH/H₂O 70:30, v/v).

Bioensaio antifúngico

Estes ensaios foram realizados no laboratório do Instituto de Botânica de São Paulo sob a supervisão da Dra. Maria Cláudia Marx Young.

Suspensões contendo esporos dos fungos das espécies Cladosporium cladosporoides e Cladosporium sphaerospermum foram utilizadas como reveladores em cromatografia em camada delgada para a realização da bioautografia [12]. A amostra de extratos foi aplicada em cromatoplacas e eluída com solventes adequados. Após a evaporação dos solventes e localização das manchas por meio de absorção no ultravioleta, uma solução de glicose e sais contendo esporos do fungo foi nebulizada sobre as placas que foram incubadas à temperatura de 25º C em câmara úmida e escura durante 2 a 3 dias. Após o tempo de incubação, observou-se o crescimento do fungo sobre a placa. Nos locais onde existem substâncias fungitóxicas surge um halo de inibição. Foi utilizado nistatina (1 µg) como padrão positivo.

Resultados e Discussão

As fases hexânica, diclorometânica, acetato de etila, n-butanólica e hidroalcóolica, provenientes da partição líquido-líquido do extrato etanólico, foram bioensaiadas com os fungos Cladosporium cladosporoides e C. sphaerospermum, sendo que apenas a fase diclorometânica apresentou atividade moderada. Esta fase foi, então, fracionada em coluna cromatográfica de fase normal fornecendo dois derivados fenilpropanoídicos, álcool 4-O-b-D-glicopiranosídeo sinapílico (1) e aldeído 4-O-b-D-glicopiranosídeo sinápico (2), uma lignana siringaresinol (3) e um alcalóide N-acetilnonaina (4) (Figura 1).

Avaliação prévia do extrato bruto com revelador draggendorff, detectou a ocorrência de alcalóides na matriz vegetal. Assim, o extrato bruto foi submetido a extração ácido-base para obtenção de uma fração rica em alcalóides, que foi fracionada em coluna cromatográfica de fase reversa e levou ao isolamento de liriodenina (5) (Figura 1).

As estruturas de todas as substâncias isoladas foram determinadas através de métodos espectroscópicos (EM, IV e RMN de ¹H e ¹³C, uni e bidimensionais) e confirmadas através da comparação com dados da literatura.

Todas as substâncias isoladas do extrato ativo e a substância 5 foram submetidas a bioautografia com os fungos Cladosporium cladosporoides e C. sphaerospermum, e as substâncias 3 e 5 apresentaram atividade na concentração de 100 µg por ponto de aplicação.

Álcool 4-O-b-D-glicopiranosídeo sinapílico (1). IV n_max (KBr) cm^-1: 3422, 2923, 2846, 1645, 1587, 1453 e 1245; MS: m/z 395 [M + Na]⁺; RMN de ¹H (DMSO-d₆): d 6,72 (2H, s, H-2 e H-6), d 6,46 (1H, dl, J = 16 Hz, H-7), d 6,33 (1H, dt, J = 5 e 16 Hz, H-8), d 4,90 (1H, d, J = 5 Hz, H-1'), d 4,85 (1H, tl, J = 5 Hz, H-9), d 4,27 (1H, t, J = 5,5 Hz, H-4'), d 4,10 (1H, tl, J = 5 Hz, H-9), d 3,76 (6H, s, OCH₃), d 3,40 (1H, m, H-6'), d 3,20 (1H, m, H-3'), d 3,13 (1H, m, H-2'), d 3,00 (1H, m, H-5'); RMN de ¹³C (DMSO-d₆): d 152,7 (C-3 e C-5), d 133,8 (C-4), d 132,6 (C-1), d 130,2 (C-8), d 128,4 (C-7), d 104,5 (C-2 e C-6), d 102,6 (C-1'), d 77,2 (C-3'), d 76,5 (C-5'), d 74,2 (C-2'), d 69,9 (C-4'), d 61,4 (C-9), d 60,9 (C-6'), d 56,3 (OCH₃).

Aldeído 4-O-b-D-glicopiranosídeo sinápico (2). IV n_max (KBr) cm^-1: 2920,2850, 1666 e 1400-1600; MS: m/z 393 [M + Na]⁺; RMN de ¹H (DMSO-d₆): d9,64 (1H, d, J = 8 Hz, H-9), d7,62 (1H, d, J = 16 Hz, H-7), d7,09 (2H, s, H-2 e H-6), d6,89 (1H, dd, J = 8 e 16 Hz, H-8), d5,08 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1'), d 3,81 (6H, s, OCH₃), d 3,38 (1H, m, H-6'), d 3,21 (2H, m, H-2' e H-5'), d 3,13 (1H, m, H-4'), d 3,06 (1H, dd, J = 2 e 5,5 Hz, H-3'); RMN de ¹³C (DMSO-d₆): d 194,2 (C-9), d 153,4 (C-7), d 152,8 (C-3 e C-5), d 136,9 (C-4), d 129,4 (C-1), d 127,9 (C-8), d 107,1 (C-2 e C-6), d 02,0 (C-1'), d 77,4 (C-3'), d 76,6 (C-5'), d 74,1 (C-2'), d 69,9 (C-4'), d 60,8 (C-6'), d 56,5 (OCH₃).

Siringaresinol (3). IV n_max (KBr) cm^-1: 3146, 2941, 2854, 1614, 1515 e 1458; MS: m/z 441 [M + Na]⁺; RMN de ¹H (DMSO-d₆): d8,23 (2H, sl, OH e OH'), d6,59 (4H, s, H-2, H-2', H-6 e H-6'), d4,61 (2H, d, J = 4 Hz, H-7 e H-7'), d4,15 (2H, dd, J = 5 e 7 Hz, H_eq-9 e H_eq-9'), d3,77 (2H, dd, J = 3,5 e 7 Hz, H_ax-9 e H_ax-9'), d3,75 (12H, s, OCH₃ e OCH₃'), d 3,04 (2H, m, H-8 e H-8'); RMN de ¹³C (DMSO-d₆): d 147,9 (C-3, C-3', C-5 e C-5'), d 134,7 (C-1 e C-1'), d 131,4 (C-4 e C-4'), d 103,6 (C-2, C-2', C-6 e C-6'), d 85,3 (C-7 e C-7'), d 71,0 (C-9 e C-9'), d 56,0 (OCH₃ e OCH₃'), d 53,6 (C-8 e C-8').

N-acetilnonaina (4): IV n_máx (KBr) cm^-1: 2913 e 1626; MS: m/z 308 [M + H]⁺ ; RMN de ¹H (CD₃OD): d 8,00 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-11), d 7,20 (1H, m, H-8), d 7,13-7,17 (2H, m, H-9 ou H-10), d 6,55 (1H, s, H-3), d 5,98 (1H, d, J = 1,5 Hz, O-CH₂-O), d 5,88 (1H, d, J = 1,5, O-CH₂-O), d 4,95 (1H, dd, J = 3,5 e 14,0 Hz, H_ax-6a), d 4,01 (1H, m, H_ax-5), d 3,18 (1H, m, H_eq-5), d 2,97 (1H, dd, J = 3,5 e 14,0 Hz, H_eq-7), d 2,72 (1H, m, H_ax-7), d 2,68 (1H, m, H-4), d 2,61 (1H, m, H-4), d 2,13 (3H, s, O=C-CH₃); RMN de ¹³C (CD₃OD): d 172,0 (C=O), d 148,8 (C-2), d 144,7 (C-1), d 136,9 (C-7a), d 132,6 (C-3a), d 129,6 (C-10), d 128,9 (C-9), d 128,8 (C-11a), d 128,3 (C-8), d 128,0 (C-11), d 126,6 (C-3b), d 119,0 (C-1a), d 108,5 (C-3), d 102,3 (O-CH₂-O).d 52,2 (C-6a), d 43,3 (C-5), d 34,6 (C-7), d 31,8 (C-4), d 22,3 (O=C-CH₃).

Liriodenina (5): IV n_máx (KBr) cm^-1: 2924, 2852, 1660 e 1400-1600; MS: m/z 276 [M + H]⁺ ; RMN de ¹H (CDCl₃): d 8,86 (1H, d, J= 5,5 Hz, H-5), d 8,60 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8 ou H-11), d 8,56 (1H, dd, J = 1,5 e 8,0 Hz, H-8 ou H-11), d 7,73 (1H, d, J =5 Hz, H-4), d 7,71 (1H, m, H-9 ou H-10), d 7,55 (1H, dt, J = 1,5 e 8,0 Hz, H-9 ou H-10), d 7,14 (1H, s, H-3), d 6,35 (2H, s, O-CH₂-O); RMN de ¹³C (CDCl₃): d 182,4 (C-7), d 151,7 (C-1), d 148,8 (C-2), d 145,2 (C-6a), d 144,9 (C-5), d 135,7 (C-3a), d 133,9 (C-9), d 132,9 (C-11a), d 131,5 (C-7a), d 128,8 (C-10), d 128,6 (C-11), d 127,3 (C-8), d 124,2 (C-4), d 123,2 (C-1b), d 103,2 (C-3), d 102,4 (O-CH₂-O).

Conclusões

O estudo químico dos caules de M. champaca levou ao isolamento e identificação de dois alcalóides, uma lignana e dois derivados fenilpropanoídicos, mostrando uma química diferenciada das raízes e sementes da planta, ricas em lactonas sesquiterpênicas. Este estudo contribuiu para o conhecimento dos metabólitos secundários de mais uma espécie da flora brasileira.

Os derivados fenilpropanoídicos e o alcalóide N-acetilnonaina estão sendo relatados pela primeira vez no gênero Michelia. A lignana siringaresinol já havia sido isolada da espécie Michelia fuscata, enquanto que liriodenina é comumente encontrada no gênero e em outras partes de M. champaca. A atividade antifúngica detectada na fase diclorometânica e confirmada na lignana 3 e no alcalóide 5 é um dado relevante, já que é a primeira vez que está sendo descrito para uma lignana. Substâncias com atividade frente aos fungos fitopatogênicos do gênero Cladosporium são de grande interesse para a agricultura.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte financeiro e à bolsa de iniciação científica concedida a M. C. M. M.

Recebido em : 11/05/2007

Aceito em : 08/06/2007

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Nov 2007
• Data do Fascículo
  2007

Histórico

• Aceito
  08 Jun 2007
• Recebido
  11 Maio 2007