Aspectos toxicológicos e químicos da Anatoxina-a e seus análogos

Toxicological and chemical aspects of Anatoxin-a

anatoxin-a; algae; alkaloids

DIVULGAÇÃO

Aspectos toxicológicos e químicos da Anatoxina-a e seus análogos

Toxicological and chemical aspects of Anatoxin-a

Vania Rodríguez^I; Sidnei Moura^I; Ernani PintoI, ^*; Claudio M. P. Pereira^II; Rodolpho Campos Braga^III

^IDepartamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 05508-900 São Paulo - SP, Brasil

^IIDepartamento de Farmácia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 05508-900 São Paulo - SP, Brasil

^IIIDepartamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, CP 26077, 05513-970 São Paulo - SP, Brasil

ABSTRACT

Anatoxin-a and its analogues are azabicyclic alkaloids that represent one of the most powerful nicotinic agonists known for the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR). Because of this potent mechanism of action, anatoxin-a and its derivatives represent a target for the discovery of novel drugs. Their syntheses are useful for environmental monitoring and also for pharmacokinetic/pharmacodynamic and toxicological studies. Some strategies for the synthesis of anatoxin-a and analogous compounds are described herein, covering the period from 1996 to the present date. In this review, emphasis is given to the chemical and toxicological aspects of some variants of anatoxin-a, including homoanatoxin-a and anatoxin-a(s).

Keywords: anatoxin-a; algae; alkaloids.

INTRODUÇÃO

Os problemas ambientais referentes à preservação das águas superficiais e subterrâneas têm-se agravado muito nas últimas décadas, principalmente em razão do enorme crescimento populacional, e o conseqüente aumento da atividade industrial. Por este motivo, a legislação vem sendo cada vez mais restritiva e exige maior fiscalização¹.

As cianobactérias (também chamadas "blue-green algae") são organismos muito discutidos, tanto pela capacidade de alguns gêneros de converter N₂ em NH₃, como por serem provavelmente, um dos primeiros organismos responsáveis pela geração de O₂ na atmosfera terrestre². Elas são algas unicelulares que podem habitar vários ambientes em função da sua pouca exigência nutricional (energia luminosa, CO₂, N₂, água e alguns minerais), sendo encontradas principalmente tanto em água doce como salobre². Sua presença representa um risco à saúde pública, pela proliferação acelerada em ambientes eutrofizados e em reservatórios de água doce. Além disso, muitas espécies podem biossintetizar toxinas, aumentando ainda mais o risco à população^3,4. Os incidentes toxicológicos relacionados com as cianotoxinas incluem intoxicações de seres humanos e animais, trazendo como conseqüência, morte de gado, animais selvagens, animais domésticos e até humanos em todo o mundo⁵. No Brasil, há relatos de florações de cianobactérias em vários estados. O primeiro relato toxicológico relacionado com cianotoxinas envolvendo humanos aconteceu na cidade de Caruaru (Açude Tabocas), Pernambuco, onde vários pacientes que realizavam hemodiálise no Hospital de Caruaru foram expostos a microcistinas (cianotoxinas produzidas pela cianobactéria Microcystis spp.), levando à morte quase 50% dos pacientes que foram submetidos à hemodiálise com água contaminada por microcistinas⁶.

Os mecanismos de ação das cianotoxinas são diversos, podendo ser hepatotóxicas, neurotóxicas, dermatotóxicas ou promotoras da inibição da síntese de proteínas⁶. Os principais gêneros produtores de cianotoxinas são Anabaena, Microcystis, Oscillatoria, Aphanizomenon, Nodularia e Cylindrospermopsis⁷. No grupo das neurotoxinas estão saxitoxinas e seus análogos, pertencentes às chamadas "paralytic shellfish poisoning" (PSP) que provocam bloqueio nos canais de sódio na membrana dos neurônios⁸; Anatoxina-a(s) ("s" de salivação), um organofosforado natural que age como inibidor irreversível da acetilcolinesterase⁹ e Anatoxina-a, um potente agonista nicotínico da acetilcolina, cuja estrutura foi a primeira a ser elucidada dentro desta classe¹⁰. As estruturas químicas destas neurotoxinas estão representadas na Figura 1.

MECANISMO DE AÇÃO E TOXICIDADE DA ANATOXINA-a

A Anatoxina-a (2-acetil-9-azabiciclo[4.2.1]non-2-eno) é um alcalóide que possui uma amina secundária bicíclica, com massa molecular e pk_a de 165 u.m.a. e 9,4, respectivamente¹¹. Sabe-se que é produzida por mais de um gênero de cianobactéria e dentre elas podem ser incluídas Anabaena flos-aquae, Oscillatoria spp., Anabaena circinalis, Aphanizomenon flos-aquae e Cylindrospermum spp.¹².

A Anatoxina-a e seu homólogo, a Homoanatoxina-a, agem como potentes agonistas nicotínicos, tendo sido comprovado que impedem reversivelmente a despolarização neuromuscular de receptores nicotínicos colinérgicos em músculo esquelético estriado de mamíferos¹³. Foi sugerido que a ativação do receptor nicotínico pós-sináptico da acetilcolina resulta em um fluxo de sódio, produzindo despolarização local suficiente para abrir os canais desse cátion e, também, os canais de cálcio dependentes de voltagem. A célula posterior pode amplificar a resposta, ativando mais canais de cálcio¹⁴. Há um bloqueio da transmissão elétrica decorrente desta despolarização, que em dose suficientemente alta, pode levar à paralisia, asfixia e morte¹⁵.

Os sintomas observados poucos minutos após alguns animais terem sidos expostos à Anatoxina-a por via oral (administração de água doce contaminada) foram fasciculação muscular, convulsões e morte por parada respiratória¹⁶.

TOXICIDADE AGUDA

Os estudos sobre avaliação da toxicidade aguda da Homo- e Anatoxina-a estabeleceram os valores da DL₁ e DL₅₀ por diferentes vias de administração em animais de experimentação^16-21 (Tabela 1).

A partir dos primeiros estudos sobre a atividade farmacológica e toxicológica da Anatoxina-a, vários trabalhos foram realizados até o momento, principalmente referentes à potência da Anatoxina-a sobre os diferentes tipos de receptores nicotínicos^15,22. Swanson et al.²³ propuseram a primeira hipótese de que a Anatoxina-a teria maior atividade que seu antípoda, pois a forma destrógira apresentou maior afinidade pelo receptor nicotínico. Dez anos mais tarde, Alkondon e Alburquerque realizaram uma análise comparativa do grau de potência de isômeros de alguns agonistas nicotínicos na geração de corrente tipo IA e IIA em neurônios de hipocampo de rato. Neste experimento, os isômeros ópticos de Anatoxina-a demonstraram ser os mais estereosseletivos, comparados com os isômeros da nicotina, epibatidina e outros compostos ativos. Também neste mesmo experimento, a (+)-Anatoxina-a foi mais potente que o isômero levógiro. No entanto, cabe salientar que as correntes de tipo I parecem ser produzidas pelo sub-tipo de receptor nicotínico a₇ e as de tipo II ao subtipo a₄b₂. Portanto, a Anatoxina-a pode se ligar a estes dois tipos de receptores²⁴. Com relação à influência da Anatoxina-a sobre outros sistemas neurológicos, foi comprovado por vários estudos in vitro que, tanto a mistura racêmica de (±)-Anatoxina-a quanto (+)-Anatoxina-a tem igual ou maior potência que a nicotina, por ex., na estimulação da secreção de catecolaminas endógenas a partir de células cromafins de tecido adrenal bovinos e de terminais do nervo estriado do hipocampo de rato mediante seu receptor neuronal nicotínico²⁵. Este fato foi corroborado em um estudo in vivo realizado em ratos, o qual mostrou que a Anatoxina-a estimula o sistema simpático por meio da liberação de catecolaminas dos terminais nervosos²⁶. Estudos mais recentes, como o realizado por Lakshmana et al.²⁷, relatam a apoptose celular provocada pela Anatoxina-a em células não neuronais. A citotoxicidade foi caracterizada pela perda de viabilidade celular, liberação da enzima lactato-desidrogenase, perda da função mitocondrial e fragmentação de DNA, sugerindo a possibilidade de que estes eventos sejam mediados pela geração de espécies reativas de oxigênio e ativação da via das caspases (família de cisteína-proteases que controlam a cascata proteolítica do processo apoptótico).

Vários estudos têm examinado os níveis de Anatoxina-a em reservatórios de água doce seguido da aparição de florações²⁸. Até o momento, todos os casos de incidentes toxicológicos relacionados com a Anatoxina-a e que levaram à morte em poucos minutos envolveram apenas animais. Por ex., alguns destes relatos incluem morte de gado na Finlândia, cachorros na Escócia, Irlanda e França e flamingos no Quênia²⁹. Com relação ao efeito da Anatoxina-a em plantas, alguns testes de laboratório com a planta aquática Lemna minore e a macroalga filamentosa Cladophora fracta mostraram que houve um aumento significativamente importante na atividade da enzima peroxidase (POD) em ambos os organismos estudados. Depois de 4 dias de exposição, a uma concentração de Anatoxina-a de 25 µg mL^-1(P < 0,05), também se observou um incremento na atividade da enzima glutationa-transferase (GST) e uma redução na produção de oxigênio pela fotossíntese para a planta L. minor³⁰. Embora não haja casos de morte em humanos relacionados à Anatoxina-a, o risco não deve ser descartado. Outros sintomas que também estão relacionados aos gêneros de cianobactérias produtoras de Anatoxina-a envolvem doenças gastrointestinais agudas, dermatite alérgica e mal-estar geral, atribuídas a extratos de Anabaena flos-aquae³¹.

TOXICIDADE SUB-AGUDA E CRÔNICA DA ANATOXINA-a

Os estudos sobre a toxicidade sub-aguda e crônica da Anatoxina-a são escassos, pois a maioria das neurotoxinas produzidas por algas leva à morte por toxicidade aguda. Os poucos estudos existentes não evidenciaram sinais clínicos ou histopatológicos de toxicidade sub-aguda (mortes em razão da administração da toxina, mudanças importantes no peso, parâmetros hematológicos ou bioquímicos) nos animais tratados com diferentes doses de Anatoxina-a^20,32. Entretanto, o fato da Anatoxina-a ter demonstrado alguma influência no aumento da atividade de enzimas importantes em plantas (GST e POD) pode indicar a possibilidade desse composto exercer um efeito indireto, a médio ou longo prazo, em proteínas com funções semelhantes em humanos. Por essas razões, os estudos com a Anatoxina-a poderiam ser estendidos a outros sistemas enzimáticos e/ou vias bioquímicas em mamíferos para se compreender melhor seu mecanismo de ação.

Embora existam vários grupos de pesquisa que estudam as toxinas produzidas por cianobactérias, não existem dados de ocorrência de Anatoxina-a ou análogos no Brasil. Apenas a Anatoxina-a(s) foi descrita em estudos com extratos de algas e inibição da enzima acetilcolinesterase³³.

A HOMOANATOXINA-a: UM POTENTE ANÁLOGO DA ANATOXINA-a

O análogo metilênico da Anatoxina-a, Homoanatoxina-a, foi isolado pela primeira vez de uma cultura de Planktothrix (Oscillatoria) formosa NIVA-CYA 92; posteriormente, foi testada a atividade do extrato desta cepa na transmissão neuromuscular, obtendo-se como resultado que esta cianotoxina tem como alvo a junção neuromuscular, agindo especificamente no receptor nicotínico pós-sináptico, diminuindo a sensibilidade deste para a acetilcolina. A Homoanatoxina-a foi identificada como um componente tóxico de uma cepa de Rhadidiopsis mediterranea LBRI 48, sendo essa a primeira identificação da produção simultânea de Anatoxina-a e Homoanatoxina-a pela mesma cepa³⁴. Aráoz et al.³⁵ estudaram 23 cepas de Oscillatoria e somente 3 delas sintetizavam apenas Anatoxina-a. Por outro lado, apenas uma cepa foi capaz de sintetizar Anatoxina-a e Homoanatoxina-a simultaneamente, sugerindo que algumas espécies de cianobactérias teriam diferenças regulatórias, o que levaria à biossíntese preferencial de uma ou das duas neurotoxinas.

O mecanismo de toxicidade da Homoanatoxina-a é semelhante ao da Anatoxina-a, ou seja, age como um potente agente bloqueador neuromuscular^13,18. Foi observado que em doses da ordem de µg (DL₅₀ apresentada na Tabela 1) a Homoanatoxina-a induz a paralisia corporal, convulsões e morte por parada respiratória entre 7 e 12 min. Foram realizadas algumas analogias entre os efeitos fisiológicos produzidos pela Homoanatoxina-a e a d-Tubocurarina mediante experimentos com preparações de neurônios de hemidiafragma. Foi observado que o efeito fisiológico de ambas é muito semelhante¹³. Outros estudos demonstram que a Homoanatoxina-a produz um aumento da liberação de acetilcolina nas terminações dos nervos colinérgicos periféricos, por meio da abertura de canais de Ca⁺⁺ dependentes de voltagem tipo L³⁶. Philips et al.³⁷, realizaram ensaios de competição pelo receptor nicotínico em cérebro de rato, entre Nicotina e a-Bungarotoxina marcadas e alguns análogos sintéticos da Anatoxina-a (Homoanatoxina-a, Propilanatoxina e Isopropilanatoxina). A Homoanatoxina-a e a Isopropilanatoxina demonstraram potência funcional similar à da (+)-Anatoxina-a na ligação pelo receptor nicotínico a₇.

Alguns resultados experimentais obtidos por Smith³⁸ sugeriram que a primeira causa de morte de camarões durante quatro episódios em um criadouro australiano foi a presença de neurotoxinas produzidas pela cepa Oscillatoria corakiana. Nesses episódios evidenciaram-se danos histopatológicos no trato digestivo dos camarões e ensaios com cistos Artemia também mostraram toxicidade. Embora não tenha sido identificada a presença de cianotoxinas nesta cepa, propõe-se que níveis sub-letais de neurotoxinas (Anatoxina-a, Homoanatoxina-a e PSP) teriam enfraquecido os camarões, levando-os a menor consumo de alimento e imunossupressão, o que os fez mais propensos a infecção bacteriana.

ANATOXINA-a(S), O ORGANOFOSFORADO NATURAL DE CIANOBACTéRIAS

Uma outra cianotoxina no grupo de alcalóides neurotóxicos é a Anatoxina-a(s). A Anatoxina-a(s) é um éster metílico da N-hidroxiguanidina fosfato, de massa molecular 252, e caracteriza-se por ser química e fisiologicamente diferente das outras Anatoxinas já mencionadas. O "s" do nome da Anatoxina-a(s) deriva da excessiva salivação viscosa observada em camundongos tratados com esta cianotoxina³⁹. Por essa razão, a letra "s" de salivação foi adicionada ao nome do composto. A Anatoxina-a(s) é produzida por algumas cepas de Anabaena flos-aquae e Anabaena lemmermannii⁴⁰. Este composto age como um inseticida organofosforado sintético, sendo considerado o único organofosforado inibidor irreversível de acetilcolinesterase de ocorrência natural conhecido³⁹. Cook et al.⁴¹, na década de 80, fizeram uma comparação da capacidade de inibição da acetilcolinesterase entre a Anatoxina-a(s) e inseticidas sintéticos inibidores reversíveis (carbamatos) e irreversíveis (organofosforados). Os resultados obtidos sugeriram uma capacidade inibitória da acetilcolinesterase da Anatoxina-a(s) comparável com o paraoxon (inseticida organofosforado). Além disso, em experimentos com animais (administração via oral e intraperitoneal) foi verificado que essa toxina é incapaz de inibir a acetilcolinesterase cerebral, concluindo-se, portanto, que ela não atravessa a barreira hematoencefálica. Por essa razão, foi também sugerido para Anatoxina-a(s) pouca tendência a bioacumulação e baixa permanência em células adiposas e membranas celulares. Além disso, esse composto é muito mais solúvel em água que os organofosforados sintéticos.

A inibição da colinesterase impede a hidrólise da acetilcolina, induzindo uma excessiva estimulação colinérgica e abertura dos canais iônicos, até provocar a exaustão do músculo. Um fato muito importante do ponto de vista clínico é que a inibição da acetilcolinesterase produzida pela Anatoxina-a(s) não pode ser revertida por oximas^8,42. A DL₅₀ da Anatoxina-a(s) está apresentada na Tabela 1.

ROTAS EMPREGADAS PARA SÍNTESE DE ANATOXINA E ANÁLOGOS

Nos anos 70, após a caracterização química e estrutural da Anatoxina-a, várias rotas sintéticas que levam a essa substância e análogas vêm sendo descritas. Isso se deve, principalmente, ao fato dos processos existentes para a extração da Anatoxina-a serem morosos e, na maioria dos casos, apresentarem baixos rendimentos. Devido à importância desses compostos, vários grupos de pesquisa vêm descrevendo caminhos sintéticos para prepará-los. Nessa divulgação, selecionaram-se as estratégias mais relevantes e recentes para síntese da Anatoxina-a e seus análogos.

Estudos referentes à síntese desta molécula, anteriores a 1995, já foram relatadas em artigo de revisão⁴³.

A abertura de b-lactamas, utilizando reações tandem de ânions, foi descrita por Parsons et al.⁴⁴ para obter a (±)-Anatoxina-a e seus análogos (Esquema 1).

O biciclo 3, obtido por reação de 2 com metil-lítio, foi transformado, in situ, no iodeto 4a correspondente por meio de reações sucessivas de desbenzilação, proteção do átomo de nitrogênio com grupo Boc e tratamento com iodo. O iodeto 4b foi obtido pelo tratamento do álcool 3 com iodo e trifenil fosfina. Os compostos 4a e 4b, assim obtidos, foram transformados na (±)-Anatoxina-a 1 através de metodologia já descrita por Rapoport et al.⁴⁵, destacando-se como vantagem desta rota a possibilidade de obtenção da toxina em escala de gramas.

Na preparação de análogos da Anatoxina-a (Esquema 2) Parsons e colaboradores⁴⁶ utilizaram a b-lactama 5 como material de partida. A abertura do anel b-lactâmico foi realizada pelo emprego de reagentes de Grignard para levar às cetonas 6. Na seqüência, ocorreu uma ciclização eletrofílica, posteriormente usou-se reagentes de selênio para introduzir uma ligação dupla, em posição definida, através da eliminação de selenóxido 7. Os compostos 8 foram reduzidos por hidrogenação e os assim obtidos (9) foram transformados nos análogos 10, seguindo novamente a estratégia proposta por Rapoport⁴⁵.

Forro e colaboradores⁴⁷ propuseram como um possível material de partida para síntese da Anatoxina-a, enantiomericamente pura, as b-lactamas 16 e 17 (Esquema 3).

A b-lactama racêmica 12 foi preparada pela adição de isocianato de clorosulfunila (CSI) no cicloocatadieno (11). Este foi sonicado⁴⁸ com paraformaldeído, resultando na ((±)-13) b-lactama N-hidroximetilada (Esquema 4).

A b-lactama N-hidroximetilada racêmica (13) em presença do vinil acetato e da PS lipase, resultou no éster (14) e no álcool (15) com 53% de conversão ((1R, 8S)-14 (e.e. 92%), (1S, 8R)-15 (e.e. 96%)) (Esquema 4).

O tratamento do éster (16) e álcool (17) com hidróxido de amônio levaram à b-lactamas, com a estereoquímica definida.

A Anatoxina-a e a Epibatidina (Figura 2) são potentes agonistas nicotínicos. Baseado nisto, foi preparado o híbrido UB-165 (18) e seu enantiômero, a fim de testar sua afinidade em sítios ligantes [³H] nicotínicos em cérebros de ratos. Estudos realizados pelo autor constataram que este híbrido é um potente agonista nicotínico situado entre Anatoxina-a e a Epibatidina⁴⁹. Híbridos desses agonistas nicotínico foram estudados tanto no plano sintético como biológico.

Gallagher et al.⁵⁰ descreveram um novo método de ativação e funcionalização no C-10. Essa estratégia permite a incorporação de resíduos de tioésteres contendo fluorescência, fornecendo novos ligantes probes estruturais (Figura 3). Os autores salientam que modificações deste tipo realizadas nesta posição, mantendo-se a unidade acetila preservada, não comprometem a atividade biológica⁵¹.

A aminocarbonilação intramolecular de aminas insaturadas foi descrita recentemente como um método eficiente na construção de importantes alcalóides e compostos biologicamente relacionados. Muitos exemplos de ciclizações de compostos com aminas insaturadas já foram estudados⁵².

Ham et al.⁵³ propuseram uma reação de aminocarbonilação intramolecular (Esquema 5) utilizando a olefina cíclica 19, catalisada por paládio, para obtenção do anel bicíclico 20, que pôde ser facilmente convertido na (±)-Anatoxina-a⁵⁴.

A síntese da (-)-Anatoxina-a via ciclização assimétrica, utilizando novos ligantes em alquilações catalisadas por paládio⁵⁵, foi descrita por Trost et al.⁵⁶.

Essa metodologia propõe que, a partir do composto racêmico 21, se pode chegar ao intermediário sintético 22, enantiomericamente puro, pelo emprego de catálise de paládio induzida por ligantes quirais (Esquema 6). Os ligantes utilizados estão apresentados na Figura 4.

Os resultados do estudo envolvendo a utilização de vários ligantes (Figura 4) nessa reação estão apresentados na Tabela 2.

De acordo com a Tabela 2, o ligante L3 foi o que apresentou melhor desempenho, levando ao intermediário 22, com maior rendimento e excesso enantiomérico. Para explicar os diferentes ee entre L1 e L3, os autores propuseram um modelo de estado de transição para esses ligantes. O ligante L1 apresentou maior efeito de repulsão estérica nesse estado quando comparado ao ligante L3, explicando-se, assim, os baixos ee induzidos pelo ligante L1 (Figura 5).

Em uma etapa final, o intermediário 22 foi convertido na metil cetona 23, por hidrólise do éster com hidróxido de lítio, seguido de transformação no correspondente cloreto com cloreto de oxalila. Esse cloreto foi tratado com trimetil alumínio, fornecendo a cetona 23⁵⁷. A detosilação redutiva levou à (-)-Anatoxina-a, com esterioquímica absoluta definida, a qual corresponde ao enantiômero desse produto natural⁵⁸ (Esquema 7).

A desprotonação enantioseletiva em um anel de oito membros⁵⁹ (Esquema 8) constitui-se, em outra estratégia na obtenção da (+)-Anatoxina-a. A cetona pro-quiral 24 foi tratada com hidrocloreto de (+)-bis[(R)-1-etilfenil]amina e 2 equivalentes de butil lítio, levando ao fosfato enólico 25 com alta enantiosseletividade. Para completar a síntese, realizou-se um acoplamento de Stille com Pd(0), seguido por hidrólise do éter vinílico/desproteção do átomo de nitrogênio e adição intramolecular conjugada. Posteriormente fez-se a troca dos grupos protetores, conduzindo ao azabiciclo 26.

A partir da (-)-Cocaína foi possível preparar a (+)-Anatoxina-a enantiomericamente pura, em 8 passos, com rendimento global de 26%⁶⁰ (Esquema 9).

Degradando-se o cloridrato de (-)-Cocaína (27), com estereoquímica definida, obteve-se a (+)-2-tropinona que foi tratada com cloroformiato de etila, visando a proteção do átomo de nitrogênio, resultando na cetona bicíclica 28. A expansão do anel foi realizada de forma enantiosseletiva, utilizando diazometil trimetilsilano na presença de ácido de Lewis. O anel já expandido foi tratado com KHMDS e 2-N(TF₂)-5-cloro-piridina, levando à formação do triflato 29, com a ligação dupla característica do produto natural. Em condições suaves, realizou-se uma reação de Heck, gerando a enona bicíclica 30, em altos rendimentos. Por último, foi realizada a desproteção do átomo de nitrogênio, usando iodo trimetilsilano em clorofórmio, resultando na (+)-Anatoxina-a (31).

Uma síntese concisa foi descrita por Martin et al.^61,62, fazendo o fechamento intramolecular do anel, empregando uma metátese de eninos (Esquema 10).

Os autores obtiveram o enino 33 a partir de modificação, em cinco etapas, do composto D-metil piroglutamato 32, comercialmente disponível. O enino 33, na presença do catalisador de Grubbs de segunda geração, forneceu, com rendimento de 87%, o 9-azabiciclo[4.2.1]noneno 34. O dieno 34 foi seletivamente didroxilado em presença do complexo de OsO₄ e trietilamina, seguido da redução do intermediário de ósmio, resultando no diol 35. A clivagem do diol por periodato de sódio levou à cetona bicíclica 36. A desproteção do átomo de nitrogênio com iodo trimetilsilano resultou na (+)-Anatoxina-a, em rendimentos praticamente quantitativos.

Outra forma de obter esta toxina é a utilização de metátese de eninos descrita por Mori et al.⁶³ (Esquema 11).

Os autores obtiveram o enino 38 a partir de modificação, em 7 etapas, do composto (-)-ácido piroglutâmico 37, comercialmente disponível. O composto acetilênico 38 foi protegido na forma de sililacetileno éster 39, pelo tratamento com a base apropriada e cloro trimetilsilano. O enino 39, na presença do catalisador de Grubbs de segunda geração, forneceu, com rendimento de 85%, a olefina 40. Esta, por sua vez, foi submetida a um processo de oximercurização seguido do tratamento com boro hidreto de sódio, levando ao respectivo álcool. A oxidação de Dess-Martin desse álcool intermediário resultou na (+)-Anatoxina-a com o átomo de nitrogênio protegido com o grupo tosila (41), em bons rendimentos.

A ciclo adição [2+2] de dicloro cetona com enol quiral leva às a,a-diclorociclobutanonas diasteromericamente enriquecidas, que podem ser facilmente convertidas em g-lactamas pela expansão anelar de Beckmann. Estas lactamas são valiosos intermediários na produção de uma variedade de produtos naturais contendo nitrogênio, como aminoácidos, pirrolidinas, pirrolizidinas e indolizidinas⁶⁴ (Esquema 12).

Através dessa ciclo adição [2+2] foi possível preparar (+)-Anatoxina-a⁶⁵. O alil éster 42 (Esquema 13), obtido por essa estratégia, deu origem ao biciclo 43, por ciclizaçao com ácido fórmico em diclorometano a 0 °C. O biciclo 43 foi submetido a uma oxidação de Wacker, levando à metil cetona 44, em rendimentos moderados.

O passo final foi realizado conforme metodologia descrita por Skrinjar et al.⁶⁶ (Esquema 14).

Os exemplos citados neste artigo mostram a aplicabilidade das reações de metátese e outras estratégias na síntese da Anatoxina. Nos últimos 40 anos, as reações de metátese de olefinas e eninos surgiram como uma potente ferramenta para formação de ligações carbono-carbono. Os catalisadores desenvolvidos por Grubbs e Schrock, indicados ao prêmio Nobel de 2005 em Química⁶⁷, além de possibilitarem a aplicação desta reação na pesquisa acadêmica, permitem o desenvolvimento de novas estratégias sintéticas para obtenção de estruturas complexas, como da Anatoxina-a. A utilização das reações de metátese de eninos, descrita por Martin e Mori^61-63, podem ser consideradas as sínteses mais eficientes, concisas e elegantes apresentadas até o momento para obtenção da referida toxina. A descoberta de novos catalisadores mais ativos, eficientes e seletivos, e ainda estáveis, para executar reações cada vez mais exigentes, porém em condições experimentais simples, constitui a perspectiva mais otimista do químico orgânico sintético para esse propósito.

PERSPECTIVAS E AVANÇOS

A poluição ambiental traz inúmeros problemas para a sociedade; um dos mais preocupantes é a eutrofização das águas com a conseqüente escassez de recursos hídricos de boa qualidade, principalmente para consumo humano. Nesse contexto, em ambientes eutrofizados, as cianobactérias crescem sem controle e algumas espécies são capazes de produzir toxinas, criando um grave problema à saúde pública. O estudo de toxinas produzidas por algas é relevante, pois no Brasil já são documentadas as existências dessas toxinas em vários mananciais de água potável.

São comuns os problemas relacionados aos métodos de análise para monitoramento dessas substâncias. O principal deles é a obtenção de padrões analíticos. A extração desses compostos de culturas de algas apresenta baixo rendimento e dificuldade de separação dos interferentes, principalmente pela alta polaridade dos componentes envolvidos. Além disso, a obtenção desses compostos em grandes quantidades para testes toxicológicos mais rigorosos é fundamental.

De fato, a síntese de Anatoxina-a vem sendo empregada tanto para o desenvolvimento de métodos para detecção e monitoramento de toxinas em água potável e de amostras ambientais, como para estudos farmacológicos e toxicológicos. Testes para se avaliar a toxicidade dessas substâncias são prejudicados em razão da escassez desses compostos para ensaios mais rigorosos. Além disso, alguns análogos podem apresentar atividade biológica de interesse para a indústria farmacêutica. Por essas razões, a síntese dessas toxinas tem sido amplamente estudada para produção dessas importantes moléculas pelas mais diversas rotas sintéticas, ora produzindo misturas racêmicas, ora formas enantiomericamente puras. A importância dos estudos de síntese orgânica dessa classe de compostos também pode ser comprovada pelo considerável número de trabalhos recentes disponíveis na literatura.

AGRADECIMENTOS

À CAPES, CNPq, FAPESP (03/06443-0, 04/14264-0, 04/11416-4 e 06/56315-6) pelo financiamento dos projetos e bolsa para V. Rodríguez. Ao Centro de Capacitação e Pesquisa em Meio Ambiente - CEPEMA - USP.

REFERÊNCIAS

1. Lopes, T. E. R.; Peralta-Zamora, P.; Quim. Nova 2004, 27, 441.

2. Sverck, C.; Smith, D. W.; J. Environ. Eng. Sci. 2004, 3, 155; http://www.hc-sc.gc.ca/hecs-sesc/water/dwgsup.htm, acessada em Janeiro 2004; Vidotti, E. C.; Rollemberg, M. C.; Quim. Nova 2004, 27, 139.

3. Carmichael, W. W.; Sci. Am. 2004, 270, 781.

4. Bittencourt-Oliveira, M do C.; Kujbida, P.; Cardozo, K.H.; Carvalho, V. M.; Moura, A. N.; Colepicolo, P.; Pinto, E.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 326, 694.

5. Codd, G. A.; Ward, C. J.; Beattie, K. A.; Bell, S. G.; Proceedings of the International Symposium on Phototrophic Prokaryotes, 9th, Vienna, Italy, 1999; Humpage, A. R.; Rositano, J.; Bretag, A. H.; Baker, P. D.; Nicholson, B. C.; Steffensen A.; Aust. J. Mar. Freshwater 1994, 45, 761; Turner, P. C.; Gamie, A. J.; Hullinrake, K.; Codd, G. A.; Br. Med. J. 1990, 300, 1440.

6. Domingos, P.; Rubim, T. K.; Molica, R. J. R.; Azevedo, S. M. F. O.; Carmichael, W. W.; Environ. Toxicol. 1999, 14, 31; Sant'Ana, C. L.; Azevedo, M. T. D.; Nova Hedwigia 2000, 71, 359; Azevedo, S. M. F. O.; Evans, W. R.; Carmichael, W. W.; Namikoshi, M.; J. Appl. Phycol. 1994, 6, 261; Jochiminsen, E. M.; Carmichael, W. W.; An, J. S.; Cardo, D. M.; Cookson, S. T.; Holmes, C. E.; Antunes, M. B.; De Melho Filho, D. A.; Lyra, T. M.; Barreto, V. S.; Azevedo, S. M.; Jarvis, W. R. N.; Engli. J. Med. 1998, 26, 873; Pouria, S.; Andrade, A.; Barbosa, J.; Cavalcanti, R. L.; Barreto, V. T. S.; Ward, C. J.; Preiser, W.; Poon, G. K.; Neild, G. H.; Codd, G. A.; Lancet 1997, 352, 21.

7. Codd, G. A.; Water Sci. Technol. 1995, 32,149; Quilliam, M. A.; J. AOAC Int. 1999, 82, 773; Carmichael, W. W.; Sci. Am. 1994, 270.

8. Catterall, W.; Ann. Ver. Pharmacol. Toxicol. 1980, 20,15.

9. Mahmood, N. A.; Carmichael, W. W.; Toxicon 1987, 25, 1221.

10. Devlin, J. P.; Edwards, O. E.; Gorham, P. R.; Hunter, P. R.; Pike, R. K.; Stavie, B.; Can. J. Chem. 1977, 55, 1367.

11. Koskinen, A. M. P.; Rapoport, H. J.; J. Med. Chem. 1985, 28, 1301.

12. Rapala, J.; Iahili, K.; Sivonen, K.; Niemelae, S. I.; Lett. Appl. Microbiol. 1994, 19, 423.

13. Skulberg, O. M.; Carmichael, W. W.; Andersen, R. A.; Matsunanga, S.; Moore, R. E.; Skulberg, R.; Environ. Toxicol. Chem. 1992, 11, 321.

14. Soliakov, L.; Gallegher, T.; Wonnacot, S.; Neuropharmacology 1975, 34, 1535.

15. Carmichael, W. W.; Biggs, D. F.; Gorham, P. R.; Science 1975, 187, 542; Carmichael, W. W.; Asv. Botan. Res. 1997, 27, 211.

16. Carmichael, W. W.; Ownby, C. L.; Odell, G.V.; Freshwater Cyanobacteria (blue-green algae) toxins, natural toxins, Pharmacology and Terapeutics, ed. Pergamon Press: Oxford, 1989, p. 3.

17. Stevens, D. K.; Krieger, R. I.; Toxicon 1989, 27, 79.

18. Fitzgeorge, R. B.; Clark, S. K.; Keevil, C. W.; 1^stInternational Symposium on Detecion Methods for Cyanobacterial (Blue-Green Algal) Toxins, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK, 1994.

19. Carmichael, W. W.; J. Appl. Bacteriol. 1992, 72, 445.

20. Fawell, J. K.; James, H. A.; FR 0434/DoE 3728, 1994.

21. Mahmood, N. A.; Carmichael, W. W.; Toxicon 1986, 24, 425.

22. Carmichael, W. W.; Science 1975, 187, 542; Carmichael, W. W.; Biggs, D. F.; Peterson, M. A.; Toxicon 1979, 17, 229.

23. Swanson, K. L.; Allen, C. N.; Aronstam, R. S.; Rapaport, H.; Alburquerque, E. X.; Mol. Pharmacol. 1986, 29, 250.

24. Alkodon, M.; Alburquerque, E. X.; J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995, 274, 771.

25. Dalit, E. D.; Zinder, O.; Gen. Phermac. 1998, 31, 737; Molloy, L.; Wonnacott, S.; Gallagher, T.; Brought, P. A.; Livett, B. G.; Eur. J. Pharmacol. 1995, 289, 447; Clarke, P. B. S.; Reuben, M. Brit. J. Pharmacol.; 1996, 117, 595.

26. Dube, S. N.; Mazumder P. K.; Kumar, D.; Rao, P. V. L.; Bashkar, A. S. B.; Def. Sci. J. 1996, 46, 135.

27. Lakshmana P. V.; Bhattacharya, R.; Gupta, N.; Parida, M. M.; Bhaskar, A. S. B.; Dubey, R.; Arch. Toxicol. 2002, 76, 227.

28. James, K. J.; Sherlock, I. R.; Stack, M. A.; Toxicon 1997, 35, 811.

29. Sivonen, K.; Niemela, S.; Niemi, R.; Lepisto, L.; Luoma, H.; Rasanen, L.; Hidrobiologia 1990, 190, 267; Edwards, C.; Beattie, K. A.; Scrimgeour, C. M.; Codd, G. A.; Toxicon 1992, 30, 1165; James, K. J.; Sherlock, I. R.; Stack, M. A.; 12^th European Symposium on Animal, Plant and Microbial toxin, Basal, Switzerland, 1997; Gugger, M.; Lenoir, S.; Berger, C.; Ledreux, A.; Druart, J. C.; Humbert, J. F.; Guette, C.; Bernard, C.; Toxicon 2005, 45, 919; Krienitz, L.; Ballot, A.; Kotut, K.; Wiegand, C.; Putz, S.; Metcalf, J. S.; Codd, G. A.; Pflumacher, S.; FEMS Microbiol. Ecol. 2003, 43, 141.

30. Mitrovic, S. M.; Pflumacher, S.; James, K. J.; Furey, A.; Aquat. Toxicol. 2004, 68, 185.

31. Harada, K.; Kimura, Y.; Ogawa, K.; Suzuki, M.; Dahlem, A. M.; Beasley, V. R.; Carmichael, W. W.; Toxicon 1989, 27, 1289.

32. Astrachan, N. B.; Archer, B. G.; Hilbelink, D. R.; Toxicon 1980, 18, 684.

33. Molica, R. J.; Oliveira, E. J. A.; Carvalho, P. V. V.; Costa, A. N.; Cunha, C. C.; Melo, G.; Azevedo, S. M.; Harmful Algae 2005, 4, 743.

34. Skulberg, O. M.; Carmichael, W. W.; Andersen, R. A.; Matsunaga, S.; Skulberg, R.; Environ. Toxicol. Chem. 1992, 11, 321; Lilleheil, G.; Andersen, R. A.; Skulberg, O. M.; Alexander, J.; Toxicon 1997, 35, 1275; Namikoshi, M.; Murakami, T.; Watanabe, M. F.; Oda, T.; Yamada, J.; Tsujimura, S.; Nagai, H.; Oishi, S.; Toxicon 2003, 42, 533; Furey, A.; Crowley, L.; Shuilleabhain, A. N.; Skulberg, O. M.; James, K. J.; Toxicon 2003, 41, 297.

35. Aráoz, R.; Nghiêm, H.; Rippka, R.; Palibroda, N.; Tandeau, N. M.; Herdman, M.; Microbiology 2005, 151, 1263.

36. Aas, P.; Eriksen, S.; Kolderup, J.; Lundy, P.; Haugen, J-E.; Skulberg, O. M.; Fonnum, F.; Environ. Toxicol. Pharmacol. 1996, 2, 223.

37. Philips, T.; Brough, P. A.; Gallagher, T.; Wonnacott, S.; Drug Dev. Res. 1994, 31, 147.

38. Smith, P.; Toxicon 1996, 34, 857.

39. James, K.; Furey, A.; Sherlock, I. R.; Stack, M. A.; Twohig, M.; Caudwell B. F.; Skulberg O. M.; J. Chromatogr., A 1998, 798, 147; Carmichael, W. W.; Mahmood, N. A.; Hyde, E. G. Em Marine Toxins: Origin, Structure and Molecular Pharmacology; Hall, S.; Strichart, G., eds.; American Chemical Society: Washington, 1990.

40. Matsunaga, S.; Moore, R. E.; Niemczura, W. P.; Carmichael, W. W.; J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8021; Onodera, H.; Oshima, Y.; Henriksen, P.; Yasumoto, T. Toxicon 1997, 35, 1645.

41. Cook, W. O.; Beasley, V. R.; Dahlem, A. M.; Dellinger, J. A.; Harlin, K. S.; Carmichael, W. W.; Toxicon 1988, 26, 750; http://www.aims.gov.au/arnat, acessada em Junho 2005.

42. Hyde, E. G.; Carmichael, W. W.; J. Biochem. Toxicol. 1991, 6, 195.

43. Mansell, H. L.; Tetrahedron 1996, 52, 6025.

44. Parsons, P. J.; Camp, N. P.; Underwood, J. M.; Harvey, D. M.; Tetrahedron 1996, 52, 11637.

45. Sardina, F. J.; Howard, M. H.; Koskinen, A. M. P.; Rapoport, H.; J. Org. Chem. 1989, 54, 4654.

46. Parsons, P. J.; Camp, N. P.; Edwards, N.; Sumoreeah, L. R.; Tetrahedron 2000, 56, 309.

47. Forro, E.; Arva, J.; Fulop, F.; Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 643.

48. Stefani, H. A.; Pereira, C. M. P.; Almeida, R. B.; Braga, R. C.; Guzen, K. P.; Cella, R.; Tetrahedron Lett. 2005, 46, 6833; Martins, M. A. P.; Pereira, C. M. P.; Cunico, W.; Moura, S.; Rosa, F.; Peres, R. L.; Machado, P.; Zanatta, N.; Boanacorso, H. G.; Ultrason. Sonochem. 2006, 13, 364.

49. Wright, E.; Gallagher, T.; Sharples, C. G. V.; Wonnacott, S.; Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 2867.

50. Magnus, N. A.; Ducry, L.; Rolland, V.; Wonnacott, S.; Gallagher, T.; J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1997, 2313.

51. Huby, N. J. S.; Thompson, P.; Wonnacott, S.; Gallagher, T.; J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1991, 243.

52. Ham, W. H.; Jung, Y. H.; Lee, K.; Oh, C. Y.; Lee, K. Y.; Tetrahedron Lett. 1997, 38, 3247; Harayama, H.; Abe, A.; Sakado, T.; Kimura, M.; Fugami, K.; Tanaka, S.; Tamaru, Y.; J. Org. Chem. 1997, 62, 2113; Harayama, H.; Okuno, H.; Takahashi, Y.; Kimura, M.; Fugami, K.; Tanaka, S.; Tamaru, Y.; Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7287; Kimura, M.; Saeki, N.; Uchida, S.; Harayama, H.; Tanaka, S.; Fugami, K.; Tamaru, Y.; Tetrahedron Lett. 1993, 34, 7611; Tamaru, Y.; Tanigawa, H.; Itoh, S.; Kimura, M.; Tanaka, S.; Fugami, K.; Sekiyama, T.; Yoshida, Z.; Tetrahedron Lett. 1992, 33, 631; Tamaru, Y.; Hojo, M.; Yoshida, Z.; J. Org. Chem. 1988, 53, 5731; Tamaru, Y.; Hojo, M.; Higashimura, H.; Yoshida, Z.; J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 3994; Tamaru, Y.; Kobayashi, T.; Kawamura, S.; Ochiai, H.; Yoshida, Z.; Tetrahedron Lett. 1985, 26, 4479; Hegedus, L. S.; Mckearin, J. M.; J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 2444.

53. Oh, C.; Kim, K.; Ham, W.; Tetrahedron Lett. 1998, 39, 2133.

54. Krinjar, M.; Nilsson, C.; Wistrand, L. G.; Tetrahedron: Asymmetry 1992, 3, 1263.

55. Braga, A. L.; Vargas, F.; Sehnem, J. A.; Braga, R. C.; J. Org. Chem. 2005, 70, 9021; Braga, A. L.; Ludtke, D. S.; Vargas, F.; Braga, R. C.; Synlett 2006, 10, 1453.

56. Trost, B. M.; Oslob, J. D.; J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 3057.

57. Arisawa, M.; Torisawa, Y.; Kawahara, M.; Yamanaka, M.; Nishida, A.; Nakagawa, M.; J. Org. Chem. 1997, 62, 4327.

58. Huber C. S.; Acta Crystallogr., Sect. B: Struct. Sci. 1972, 78, 2577; Koskinen, A. M. P.; Rapaport, H.; J. Med. Chem. 1985, 28, 1301.

59. Aggarwal, V. K.; Humphries, P. S.; Fenwick, A.; Angew. Chem., Int. Ed. 1999, 38, 1985.

60. Wegge, T.; Schwarz, S.; Seitz, G.; Tetrahedron: Asymmetry 2000, 11, 1405.

61. Brenneman, J. B.; Machauer, R.; Martin, S. F.; Tetrahedron 2004, 60, 7301.

62. Brenneman, J. B.; Martin, S. F.; Org. Lett. 2004, 6, 1329.

63. Mori, M.; Tomita, T.; Kita, Y.; Kitamura, T.; Tetrahedron Lett. 2004, 45, 4397.

64. Roche, C.; Delair, P.; Greene, A. E.; Org. Lett. 2003, 5, 1741; Rasmussen, M. O.; Delair, P.; Greene, A. E.; J. Org. Chem. 2001, 66, 5438; Delair, P.; Brot, E.; Kanazawa, A.; Greene, A. E.; J. Org. Chem. 1999, 64, 1383; Kanazawa, A.; Gillet, S.; Delair, P.; Greene, A. E.; J. Org. Chem. 1998, 63, 4660; Nebois, P.; Greene, A. E.; J. Org. Chem. 1996, 61, 5210.

65. Muniz, M. N.; Kanazawa, A.; Greene, A. E.; Synlett 2005, 1328.

66. Skrinjar, M.; Nilsson, C.; Wistrand, L. G.; Tetrahedron: Asymmetry 1992, 3, 1263.

67. Rouhi, M.; Chem. Eng. News 2005, 83, 41.

Recebido em 25/10/05; aceito em 21/12/05; publicado na web em 22/8/06

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Set 2011
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Recebido
  25 Out 2005
• Aceito
  21 Dez 2005