Identificação de SNPs para conteúdo de ácidos graxos em soja pela técnica HRM

Identification of SNPs for fatty acid content in soybean by the HRM technique

Resumos

O objetivo deste trabalho foi identificar SNPs em genes associados ao conteúdo de ácidos graxos em soja e implementar a metodologia "high resolution melting" (HRM) para genotipagem desses SNPs. Os iniciadores HRM foram desenhados para discriminar os alelos SNPs em duas populações de mapeamento (RILs e F2) e seguiram o padrão esperado de segregação. Os SNPs do gene ABI associaram-se significativamente ao conteúdo de ácido esteárico (R² = 12,14), e os do gene FAD3B, aos conteúdos de ácido oleico (R² = 14,69) e linolênico (R² = 10,62). A técnica de genotipagem dos SNPs por HRM é eficiente na discriminação das classes genotípicas.

genotipagem; marcador molecular; melhoramento vegetal; polimorfismos de nucleotídeo único; seleção assistida por marcadores

The objective of this work was to identify SNPs in genes associated with fatty acid content in soybean and to implement the high resolution melting (HRM) technique for SNP genotyping. HRM primers were designed to discriminate SNP alleles in two mapping populations (RILs and F2) and followed the expected pattern of segregation. The ABI gene SNPs were significantly associated with stearic acid content (R² = 12.14), and the ones from the FAD3B gene, with oleic (R² = 14.69) and linolenic acid (R² = 10.62) contents. The technique of genotyping SNPs by HRM is efficient to discriminate genotype classes.

genotyping; molecular marker; plant breeding; single nucleotide polymorphisms; marker assisted selection

NOTAS CIENTÍFICAS

Identificação de SNPs para conteúdo de ácidos graxos em soja pela técnica HRM

Identification of SNPs for fatty acid content in soybean by the HRM technique

Maria Fernanda Antunes da Cruz^I; Rafael Delmond Bueno^II; Franciele Barros de Souza^II; Maurilio Alves Moreira^II; Everaldo Gonçalves de Barros^I

^IUniversidade Federal de Viçosa (UFV), Departamento de Biologia Geral, Avenida P.H. Rolfs, s/nº, CEP 36570-000 Viçosa, MG, Brasil. E-mail: [e-mail], [e-mail]

^IIUFV, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular. E-mail: [e-mail], [e-mail], [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi identificar SNPs em genes associados ao conteúdo de ácidos graxos em soja e implementar a metodologia "high resolution melting" (HRM) para genotipagem desses SNPs. Os iniciadores HRM foram desenhados para discriminar os alelos SNPs em duas populações de mapeamento (RILs e F₂) e seguiram o padrão esperado de segregação. Os SNPs do gene ABI associaram-se significativamente ao conteúdo de ácido esteárico (R² = 12,14), e os do gene FAD3B, aos conteúdos de ácido oleico (R² = 14,69) e linolênico (R² = 10,62). A técnica de genotipagem dos SNPs por HRM é eficiente na discriminação das classes genotípicas.

Termos para a indexação: genotipagem, marcador molecular, melhoramento vegetal, polimorfismos de nucleotídeo único, seleção assistida por marcadores.

ABSTRACT

The objective of this work was to identify SNPs in genes associated with fatty acid content in soybean and to implement the high resolution melting (HRM) technique for SNP genotyping. HRM primers were designed to discriminate SNP alleles in two mapping populations (RILs and F

₂) and followed the expected pattern of segregation. The

ABI gene SNPs were significantly associated with stearic acid content (R

² = 12.14), and the ones from the

FAD3B gene, with oleic (R

² = 14.69) and linolenic acid (R

² = 10.62) contents. The technique of genotyping SNPs by HRM is efficient to discriminate genotype classes.

Index terms: genotyping, molecular marker, plant breeding, single nucleotide polymorphisms, marker assisted selection.

Polimorfismos de nucleotídeo único ("single nucleotide polymorphisms", SNPs) consistem em pequenas variações de nucleotídeos (inserções ou deleções) nas sequências de bases de fragmentos homólogos de DNA. Esse tipo de variação é a mais frequente forma de polimorfismo observada no genoma (Collins et al., 1998).

Um grande esforço tem sido dedicado ao desenvolvimento de tecnologias de genotipagem mais precisas, rápidas e de baixo custo para a análise de SNPs (Rafalski, 2002). A técnica de dissociação em alta resolução ("high resolution melting", HRM) é um método homogêneo, rápido e simples de análise pós-PCR. A HRM é suficientemente sensível para permitir a detecção de mudança em apenas uma base, entre sequências de nucleotídeos. A técnica baseia-se na variação da temperatura média de fusão (Tm) que ocorre com mudança na sequência de bases. Assim, na análise de SNPs por HRM, os alelos homozigotos e heterozigotos, por apresentarem valores de Tm diferentes, produzem curvas de dissociação com formatos distintos (Gundry et al., 2003; Wittwer et al., 2003; Graham et al., 2005).

O objetivo deste trabalho foi identificar SNPs em genes associados ao conteúdo de ácidos graxos em soja (Glycine max L.) e implementar a metodologia "high resolution melting" (HRM) para genotipagem desses SNPs.

Para a genotipagem dos SNPs, foram utilizadas duas populações segregantes: uma formada de linhagens endogâmicas recombinantes ("recombinant inbred lines", RILs), originadas do cruzamento entre genótipos contrastantes quanto ao teor de ácido oleico (FA22 x CD219); e outra formada por uma população F₂, contrastante quanto ao teor de ácido linolênico (A29 x Tucunaré). O genótipo A29 (1% de ácido linolênico) foi desenvolvido, por meio de mutagênese, por pesquisadores da Universidade Estadual de Iowa, EUA. O genótipo FA22 foi selecionado de uma população em melhoramento e apresenta teor normal de ácido linoleico e elevado conteúdo de ácido oleico (aproximadamente 50%). A variedade CD219RR, desenvolvida pela Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola (Coodetec), e a variedade Tucunaré, desenvolvida pela Fundação Matogrosso, apresentam teores normais de ácido linolênico (~8%) e ácido oleico (~19%).

Com base em informações disponíveis na literatura, foram selecionados quatro genes candidatos (ABI3,LPCAT,ARAF e PDAT) diretamente relacionados à síntese e à regulação do teor de ácidos graxos em grãos de soja (Baud & Lepiniec, 2010). Além desses, selecionaram-se, também, os genes FAD3B e FAD3C, que codificam as ω-3-dessaturases e afetam o acúmulo de ácido linolênico em grãos de soja (Bilyeu et al., 2006; Pinto et al., 2013), para os quais já foram desenvolvidos marcadores SNPs (Bilyeu et al., 2006). Portanto, no presente trabalho, testou-se a efetividade da metodologia HRM para a genotipagem desses SNPs, nas populações: A29 x Tucunaré e FA22 x CD219RR, uma vez que seu uso é promissor para a seleção de genótipos superiores de soja (Bilyeu et al., 2005, 2006, 2011; Reinprecht et al., 2009; Pinto et al., 2013).

As sequências parciais dos quatro genes candidatos foram obtidas a partir do GenBank (National Center for Biotechnology Information, 2013). As sequências gênicas completas (regiões promotoras, regulatórias, terminadoras, íntrons e exons) dos genes ABI3 (Glyma18g38490.1), LPCAT (Glyma05g03510.1), ARAF (Glyma03g27460.2), PDAT (Glyma17g05910.1), FAD3B (Glyma02g39230) e FAD3C (Glyma18g06950) foram obtidas com uso da ferramenta "basic local alignment search tool" (Blast), no banco de dados Phytozome (2013), no qual está depositado o genoma sequenciado da soja (Schmutz et al., 2010).

Folhas de plantas das populações RILs e F₂ foram coletadas 15 dias após o plantio, para a extração e a análise do DNA por meio da metodologia Doyle & Doyle (1990), com modificações. A concentração e a qualidade do DNA foram determinadas com o espectrofotômetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE, EUA). Para discriminar os alelos SNPs dos genes descritos na Tabela 1, foram desenhados iniciadores para a genotipagem HRM com auxílio do programa Primer 3.Os parâmetros utilizados para desenhar os iniciadores foram: tamanhos entre 18 e 27 nucleotídeos, Tm entre 57 e 63ºC, conteúdo de CG (citosina + guanina) entre 20 e 80%, e tamanhos dos produtos de amplificação entre 60 e 90 pb. Após o desenho dos iniciadores, foram preditas estruturas secundárias, tanto neles quanto nos amplicons, por meio do programa DINAMelt Server (University at Albany, Albany, NY, EUA). A especificidade dos iniciadores foi testada com o programa PCR virtual (iPCR) e com o banco de dados Phytozome (2013).

As reações de genotipagem, utilizadas para discriminar os alelos de SNPs nas duas populações, foram realizadas em volume de 10 µL, contendo 5 µL de 2x HRM PCR Master Mix (Qiagen, Mainz, Alemanha), 0,7 µL a 10 µmol L^-1 de cada iniciador, 3,3 µL de água livre de RNAse e 1 µL de DNA a 15 ng µL^-1. As reações de amplificação foram conduzidas no termociclador Rotor-Gene "real-time rotary analyzer" (Qiagen, Mainz, Alemanha), com etapa inicial a 95ºC por 2 min, seguida de: 40 ciclos de 95ºC por 5 s, 40 ciclos de 60ºC por 10 s e HRM (73-83ºC, incremento de 0,1ºC), 2 s por passo. Realizadas as reações de amplificação, os dados foram analisados por meio do programa do próprio aparelho.

A composição de ácidos graxos na fração óleo foi determinada por cromatografia gasosa. As etapas de extração e transesterificação dos ácidos graxos em metil-ésteres derivados foram realizadas segundo a metodologia de Bubeck et al. (1989). Os metil-ésteres derivados foram fracionados em coluna Carbowax de 30 m de comprimento e 0,32 mm de diâmetro interno. As temperaturas da coluna e do injetor foram mantidas a 240ºC, e a do detector, a 280ºC.

A análise de segregação de cada marcador foi feita por meio do teste qui-quadrado, a 5% de probabilidade, tendo-se utilizando o critério de proteção Bonferroni. A associação do marcador com as características foi analisada nas duas populações (RILs e F₂) e determinada pela análise de mapeamento por marca simples, por meio de regressão linear. Todas as análises estatísticas apresentadas foram realizadas com o aplicativo GQMOL (Cruz & Schuster, 2004).

Os marcadores genotipados nas duas populações estudadas seguiram o padrão esperado de segregação: 1:1, na população de RILs; e 1:2:1, na população F₂ (Tabela 2). Apenas os iniciadores LPCAT5.3.3 e PDAT17.5.1 não discriminaram eficientemente os indivíduos conforme o alelo de interesse. Com os demais iniciadores, a genotipagem HRM foi capaz de determinar a frequência dos SNPs nas duas populações de mapeamento e determinar o perfil de homozigose e heterozigose (Tabela 2 e Figura 1).

A análise de associação marcador-característica permitiu verificar que o SNP no gene FAD3B associa-se de forma significativa (Tabela 3) aos teores de ácido oleico (R²=14,69) e linolênico (R²=10,62), resultado similar aos descritos por Pinto et al. (2013). Já o SNP no gene ABI associou-se significativamente com o teor de ácido esteárico (R²=12,14), na população A29 x Tucunaré (F₂). Não foi detectada associação significativa com nenhum dos marcadores testados na população de RILs FA22 x CD219RR.

O uso da técnica HRM em soja é eficiente, simples e de fácil implementação. O perfil descrito na literatura para a discriminação dos alelos homozigotos e heterozigotos dos SNPs avaliados foi confirmado, e o método de genotipagem testado mostra-se eficiente para a seleção assistida por marcadores moleculares.

Recebido em 7 de agosto de 2013 e aprovado em 29 de novembro de 2013

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  31 Mar 2014
• Data do Fascículo
  Dez 2013

Histórico

• Recebido
  07 Ago 2013
• Aceito
  29 Nov 2013