Instabilidade de microssatélite - MSI nos marcadores (BAT26, BAT25, D2s123, D5S346, D17S250) no câncer de reto

ARTIGO ORIGINAL

Instabilidade de microssatélite - MSI nos marcadores (BAT26, BAT25, D2s123, D5S346, D17S250) no câncer de reto

Microsatellite instability - MSI markers (BAT26, BAT25, D2S123, D5S346, D17S250) in rectal cancer

Graziele Moraes Losso^I; Roberto da Silveira Moraes^II; Arthur C. Gentili^III; Iara Taborda Messias-Reason^I

^ILaboratório de Imunopatologia Molecular

^IIServiço de Cirurgia do Aparelho Digestivo

^IIIServiço de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brasil

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

RACIONAL: O câncer colorretal tem importante componente genético. Os microssatélites são considerados marcadores fenotípicos de prognóstico, resposta terapêutica e de identificação de pacientes com mutação nos genes de reparo do DNA.

OBJETIVOS: Avaliar o perfil molecular dos tumores submetidos à microcirurgia endoscópica transanal (TEM) para tratamento do câncer de reto.

MÉTODO: Foram selecionados 38 espécimes avaliados segundo o estadiamento patológico. Foram escolhidas amostras da região tumoral e realizada dissecação e extração do DNA. Os tumores colorretais foram testados para instabilidade de microssatélite - MSI utilizando um painel composto de cinco marcadores (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 e D17S2720), técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR).

RESULTADOS: Nos 38 casos observou-se que 63% eram do sexo masculino e 47% feminino com média de idade de 58,4 anos. Em relação ao tipo tumoral 58% eram adenomas, sendo 24% adenomas de baixo grau e 76% de alto grau; 42% eram carcinomas. Quanto à profundidade de ressecção, verificou-se que 80% dos casos incluíam a gordura perirretal e 20% até a muscular própria. O microssatélite com maior frequência de amplificação foi o BAT26 (100%) e o menor D17S2720 (85,4%). Dezesseis casos (42%) apresentaram MSI; eram dez carcinomas, dois adenomas de baixo grau e quatro de alto grau. Vinte e dois casos (68%) tinham microssatélite estáveis - MSS. A perda alélica dos marcadores de microssatélites foi estatisticamente significante nos casos de carcinoma em relação a adenomas. O microssatélite com maior frequência de amplificação foi o BAT26 (100%) e o menor D17S2720 (85,4%); 16 casos (42%) apresentaram instabilidade de microssatélite - MSI. Desses, dez eram carcinomas, dois adenomas de baixo grau e quatro de alto grau; 22 casos (58%) apresentaram microssatélite estáveis - MSS.

CONCLUSÃO: A instabilidade de microssatélite (MSI-H) foi significantemente associada com carcinomas retais, confirmando sua utilização como marcador prognóstico na carcinogênese retal.

Descritores: Instabilidade de microssatélites. Marcadores biológicos de tumor. Microcirurgia endoscópica transanal.

ABSTRAT

BACKGROUND: Colorectal cancer has an important genetic component. Microsatellites are considered phenotypic markers of prognosis, therapeutic response and identify patients with mutations in DNA repair genes.

AIM: To evaluate the molecular profile of tumors underwent to transanal endoscopic microsurgery - TEM in surgical treatment of rectal cancer.

METHOD: Thirty eight surgical specimens were evaluated according to pathological staging and the region of the tumor were dissected and submitted to DNA extraction. The colorectal tumors were tested for microsatellite instability - MSI using a panel of five markers (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, and D17S2720) technique of Polymerase Chain Reaction (PCR).

RESULT: From total 63% were male and 47% female, with mean age of 58.4 years. In relation to tumor type adenomas were 58%, 24% low-grade adenomas and 76% high grade; 42% were carcinomas. The depth of resection 80% included the rectal perirenal fat and 20% the muscularis propria. The most frequent microsatellite amplification was BAT26 (100%) and lowest D17S2720 (85.4%). Sixteen patients (42%) were MSI, ten were carcinomas, two low grade adenomas and four high grade. Twenty-two cases (68%) showed microsatellite stable - MSS. The allelic loss of microsatellite markers was statistically significant in cases of carcinoma in relation to adenomas. The most frequent microsatellite amplification was BAT26 (100%) and lower D17S2720 (85.4%), 16 patients (42%) had microsatellite instability - MSI thereof ten were carcinomas, two low grade adenomas, four high-grade adenomas and 22 cases (58%) were microsatellite stable - MSS.

CONCLUSION: Microsatellite instability (MSI-H) was significantly associated with rectal carcinomas, confirming its use as a prognostic marker in colorectal carcinogenesis.

Headings: Microsatellite instability. Tumor markers, biological. Trasanal endoscopic microsurgery.

INTRODUÇAO

O mapeamento do genoma humano aliado ao desenvolvimento de novas técnicas moleculares permitiu não só a descoberta de genes de predisposição genética ao câncer, como também a possibilidade de análise genômica em larga escala. O desenvolvimento do câncer resulta de uma série de etapas envolvendo mutações gênicas, quebras e perdas cromossômicas, amplificações gênicas e instabilidade genômica, além de mecanismos epigenéticos. Entre os múltiplos genes envolvidos nesse processo, destacam-se os proto-oncogenes, genes supressores de tumor e relacionados ao reparo do DNA^18,25.

O DNA é molécula que sofre frequentemente alterações através de perdas de segmentos, mutações ocorridas durante o processo de divisão celular. Para corrigir tais alterações dispõe-se de algumas proteínas com função de realizar os reparos necessários para manter a integridade do DNA. Essas proteínas são produzidas a partir de alguns genes conhecidos como de reparo (mismatch repair genes - MMR) e sua função é exercida de forma contínua, preservando os tecidos celulares^12,13. A instabilidade de microssatélite - MSI é fruto da inativação das proteínas de reparo do DNA e se constitui na base molecular do câncer colorretal hereditário não polipóide - HNPCC. Seis genes relacionados com o reparo do DNA estão envolvidos no MMR (mismatch repair genes), tais como: hMLH1 (Gene Human mut-L Homologue 1), hMSH2 (Gene Human mut-S Homologue 2), hMSH6 (Gene Human mut-S Homologue 6)¹⁹. O gene hMLH1 está localizado no cromossoma 3p21-23^14,15e o hMSH2 no cromossoma 2p21, em área inicialmente identificada como região importante para genes envolvidos no HNPCC^22,24. A observação de grande número de alterações nas sequências de microssatélites em determinado tecido tumoral demonstra ausência de função normal de reparo do DNA. Representa, consequentemente, evidência indireta que essa deficiência na ação das proteínas de reparo é causada pela presença de mutações nos genes anteriormente mencionados. Este defeito denomina-se erro de replicação (replications errors - RER +)^11,30. Os MSI representam uma característica fenótipica marcante da HNPCC estando presente em 80-90% dos tumores, e nos casos esporádicos chega a 15%^2,4.

Embora os genes estejam suscetíveis a um número de alterações químicas (mutações) ao acaso, a grande maioria delas é eliminada pelo sistema de reparo do DNA. Há variedade de mecanismos de reparo, cada uma catalisada por um conjunto diferente de enzimas. Quase todos mecanismos dependem da existência de duas cópias da informação genética, uma em cada fita da dupla hélice do DNA. Se a sequência em uma fita é danificada acidentalmente, a informação não é perdida, porque uma versão "backup" da fita alterada permanece na sequência complementar de nucleotídeos na outra fita¹⁸. Além da falha no sistema de reparo, é necessária a ocorrência de mais de uma mutação para transformar célula normal em tumoral. As mutações devem ocorrer pelo menos cinco ou seis vezes de forma independente em uma única célula para que se estabeleçam todas as condições necessárias ao desenvolvimento do câncer. Tais mutações podem ser dominantes ou recessivas. As mutações dominantes levam a um ganho de função, podendo causar o desenvolvimento de oncogenes que são formas mutadas de proto-oncogenes. Estes atuam na promoção do crescimento e divisão de células normais. Porém, na forma mutada, eles promovem o desenvolvimento do câncer. Já as mutações recessivas levam à perda de função e podem alterar ou inativar genes supressores de tumor (GST). Seus produtos são necessários para inibir o crescimento celular, o ciclo de divisão e prevenir o desenvolvimento do câncer. Essas mutações, no entanto, não destroem as células mutadas e fornecem vantagem competitiva sobre as células vizinhas normais^3,16. Os genes de reparo atuam assegurando que cada informação genética seja corretamente copiada durante a replicação do DNA. Mutações nesses genes levam ao aumento na frequência de outras mutações⁸.

Sob o ponto de vista genético o câncer colorretal (CCR) pode ser dividido em dois grupos: os esporádicos, que ocorrem sem caráter familiar e correspondem cerca de 85% dos casos e os hereditários, que ocorrem devido a defeito genético herdado na família, geração após geração. Nos casos hereditários, o CCR ocorre em idades mais precoces - a partir dos 20 anos - e possuem como característica clínica a presença de várias pessoas dentro de uma mesma família acometida de câncer intestinal^6,9. O resultado do tratamento do CCR está diretamente relacionado ao diagnóstico precoce, ou seja, quanto mais cedo se realizar o diagnóstico, maior o índice de cura, chegando-se a mais de 90% nos casos iniciais. Nos últimos anos, com o rápido e crescente desenvolvimento das técnicas moleculares, identificaram-se defeitos genéticos específicos de pelo menos duas das principais síndromes hereditárias do intestino grosso, a polipose adenomatosa familiar (PAF) e o câncer colorretal hereditário sem polipose (HNPCC). Ambos são transmitidos verticalmente, de uma geração para outra, através de padrão de herança Mendeliano, em geral do tipo autossômico dominante²⁸. O proto-oncogene (K-ras), os genes supressores tumorais (APC, DCC e TP53) e os genes reparadores do DNA ou MMR (do inglês, mismatch repair - genes denominados MSH2, MLH1, PMS1, PMS2 e MSH6) têm participação central no desenvolvimento do CCR. Aproximadamente 25% a 40% da molécula de DNA é formada por sequências repetitivas de nucleotídeos, as quais podem ser observadas diversas vezes em todo o genoma e subdivididas em repetições dispersas e repetições tandem (ou satélite)¹⁰. Estas repetições podem ser classificadas de acordo com a extensão da sequência repetitiva em: satélite, minissatélite e microssatélite, dependendo do número de nucleotídeos. O número de repetições de minissatélite e microssatélite varia entre os indivíduos, motivo pelo qual eles são considerados impressões digitais do DNA e utilizados em exames de paternidade¹. A instabilidade de microssatélite - MSI constitui-se na observação de que o DNA extraído de células de determinados tumores apresentam alterações no número de unidades repetitivas em um ou mais microssatélites quando comparados aos mesmos microssatélites existentes em amostras de DNA de tecido normal do mesmo indivíduo - células sanguíneas, por exemplo. Portanto, as células tumorais apresentam "impressões digitais" defeituosas em seu DNA quando comparadas aos outros tecidos do organismo.

A hipermetilação do promotor do gene hMLH1 parece ser uma das principais alteração genéticas presente no CCR. A análise molecular da via carcinogenética mutadora através da pesquisa de MSI tem aplicação prática na clínica, uma vez que tumores ditos "mutadores" exibem características biológicas distintas^3,29. Há evidências de que esses tumores se distinguem por diversos aspectos: localização (proximal no colon), idade (menos avançada), aspecto histológico (maior incidência de tumores mucinosos) e prognóstico (melhor sobrevida em relação ao CCR estável para microssatélites)²⁶. Entretanto, os tumores com MSI estão associados com resistência à quimioterapia com 5-fluorouracil (5FU) e à menor sobrevida dos pacientes, pós-tratamento com a droga (5FU)^5,6,15,20. MSI em CCR pode ainda ser marcador de suscetibilidade herdada ou adquirida para outros tumores, tais como câncer gástrico, de útero e ovário²¹. Diversas teorias têm sido propostas para explicar porque tumores MSI-H (Alta-instabilidade) apresentam melhor prognóstico em carcinomas colorretais esporádicos, apesar das características desfavoráveis.

Este estudo tem por objetivo avaliar o perfil molecular dos tumores submetidos à microcirurgia endoscópica transanal (TEM) para tratamento do câncer de reto.

MÉTODOS

Foram selecionados 38 espécimes cirúrgicos produtos da ressecção pela microcirurgia endoscópica transanal (TEM) no período de 2003 a 2006, avaliadas segundo o estadiamento patológico²⁷. Após, foram escolhidas amostras da região tumoral dos espécimes emblocados em parafina, sendo realizada a dissecação e extração do DNA utilizando-se kit comercial (QIAmp^® DNA FFPE Tissue Handbook - Qiagen, Califórnia, USA) . Os tumores colorretais foram testados para instabilidade de microssatélite - MSI utilizando um painel de cinco pares de primers (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, D17S2720) (Tabela 1). O método utilizado para detecção dos marcadores de microssatélite foi VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats) Kashyap et al., 2004. Foi utilizado 100 ng/ul de DNA purificado em volume final de 25µl na reação de PCR. As condições da PCR foram: desnaturação inicial na temperatura de 95°C por período de cinco minutos, seguida por 10 ciclos contínuos de desnaturação a 95°C por um minuto de anelamento iniciando à 60°C e baixando 1°C a cada ciclo até atingir a temperatura de 51°C no último ciclo com extensão a 72°C por um minuto e a 72°C por mais um minuto. Terminando os 30 ciclos, o material permaneceu cinco minutos na temperatura de 72°C para fornecer maior tempo de extensão com totalidade de 40 ciclos. Subsequentemente, os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamina a 10% (16 horas, 450 V, temperatura ambiente) corado com nitrato de prata a 0,1%.

Análise estatística

Para as análises de associação foram realizados os testes de independência entre as variáveis utilizando-se os testes qui-quadrado com correção de Yate's ou de Fisher. Foi calculado o odds ratio, com intervalo de confiança de 95%. Valores de p menores que 0,05 foram considerados significativos.

RESULTADOS

Dos 38 casos de câncer de reto operados pela TEM (Figura 1), 63% eram homens e 47% mulheres com média de idade de 58,4 anos. Em relação ao tipo tumoral 58% eram adenomas - 24% de baixo e 76% de alto grau - e 42% carcinomas (Tabela 1). Quanto à profundidade da ressecção verificou-se que em 80% incluía a gordura perirretal e em 20% até a muscular própria.

O microssatélite com maior frequência de amplificação foi o BAT26 (100%) e o menor o D17S2720 (85,4%). Dezesseis casos (42%) apresentaram MSI. Destes, dez eram carcinomas, dois adenomas de baixo grau e quatro de alto. Vinte e dois (68%) casos apresentaram microssatélite estáveis (MSS). A perda alélica dos marcadores de microssatélites foi estatisticamente significante nos casos de carcinoma em relação aos adenomas (p = 0,0003; OR 16,7; IC95%: 2,8-98,0) (Tabela 2 e Figura 2).

DISCUSSÃO

A identificação de parâmetros que refletem o comportamento biológico do câncer de reto é determinante no prognóstico e no incremento da terapia oncológica. Os resultados deste estudo evidenciaram a importância da análise molecular no aparecimento de tumores iniciais de reto, podendo implicar no delineamento terapêutico.

A presença de MSI pode ser significativamente corroborada pela avaliação concomitante do número de linfócitos citotóxicos ativos intramurais²⁷. Essa observação deu suporte à hipótese de que tumores com MSI-H estão associados com a produção de novos epítopos imunogênicos devido ao sistema de reparo defeituoso. Essa hipótese tenta explicar porque pacientes com CCR esporádico MSI-H apresentam resposta imunológica antitumor mais efetiva do que pacientes com MSS com desfecho clínico mais favorável. Neste estudo observou-se que a presença de MSI-H foi significantemente mais elevada em carcinomas do que em adenomas, corroborando com o valor prognóstico dos marcadores MSI no CCR. Deve-se ainda destacar que os artigos publicados sobre MSI em CCR são principalmente em populações européias e orientais, sendo poucos estudos realizados na população brasileira. Considerando-se que nosso país apresenta grande heterogeneidade genética - resultado de cinco séculos de miscigenação -, faz-se necessário estudos que estabeleçam a frequência de MSI nas diferentes regiões do Brasil.

A sobrevida dos pacientes com CCR metastático (mCRC) melhorou progressivamente ao longo das últimas décadas. Foi devida principalmente à novas combinações quimioterápicas (5-fluorouracil, irinotecano, oxaliplatina), como à introdução de novas terapias. Entre elas destacam-se dois anticorpos monoclonais contra o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) - o cetuximab e panitumumab - que demonstraram eficácia no tratamento do mCRC. No entanto, devido à toxicidade e aumento de custos, é indispensável a utilização de ferramentas capazes de selecionar os pacientes que têm maior probabilidade de se beneficiar.

Portanto, a identificação de casos de câncer retal com MSI pode permitir a intervenção quimiotérapica neo-adjuvante e específica para cada paciente poupando-o assim de toxidade terapêutica e possibilitando a aplicação de uma nova modalidade terapêutica.

CONCLUSÕES

A instabilidade de microssatélite (MSI-H) foi significantemente associada com carcinomas retais, confirmando sua utilização como marcador prognóstico na carcinogênese retal.

Recebido para publicação: 27/03/2012

Aceito para publicação: 22/08/2012

Fonte de financiamento: CNPq, CAPES, Programa de Medicina Interna e da Saúde da Universidade Federal do Paraná

Conflito de interesses: não há

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Fev 2013
• Data do Fascículo
  Dez 2012

Histórico

• Recebido
  27 Mar 2012
• Aceito
  22 Ago 2012