Análise espectrofotométrica da ação das lipoxigenases em grãos de soja macerados em diferentes temperaturas

Spectrophotometric analysis of the lipoxygenase action on soybeans soaked at different temperatures

ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA DA AÇÃO DAS LIPOXIGENASES EM GRÃOS DE SOJA MACERADOS EM DIFERENTES TEMPERATURAS¹

EVANGELISTA, Carlos Magno & REGITANO-d’ARCE², Marisa A. B

RESUMO

O sabor e aroma desagradáveis dos derivados da soja, particularmente do extrato hidrossolúvel (leite de soja), são obstáculos a sua aceitação pelos ocidentais que o consideram desagradável. A origem desse "flavor" está na oxidação de ácidos graxos catalisada pelas isoenzimas lipoxigenases quando os tecidos dos grãos sofrem danos na presença de umidade. Já na maceração (embebição) dos grãos, no processo tradicional de produção de leite de soja, células do cotilédone sofrem rupturas, devido ao entumescimento provocado pela rápida absorção de água, permitindo o contato enzima-substrato. O objetivo do presente estudo foi avaliar o nível de oxidação sofrido por grãos de soja macerados em diferentes temperaturas, e depois liofilizados, para a extração e análise espectrofotométrica (232 nm) da fração lipídica. Os métodos de extração e análise empregados permitiram a verificação da ocorrência de oxidação no processo de maceração sendo que o coeficiente de extinção (dienos conjugados) passou de 3,40 [(g/100ml)cm]^-1 (grãos não macerados) para 5,88 [(g/100ml)cm]^-1 (grãos macerados a 22°C) e o coeficiente de extinção diminuiu com o aumento da temperatura.

Palavras-chave: leite de soja, maceração, fração lipídica, inativação térmica, lipoxigenase.

SUMMARY

SPECTROPHOTOMETRIC ANALYSIS OF THE LIPOXYGENASE ACTION ON SOYBEANS SOAKED AT DIFFERENT TEMPERATURES. The flavor of soybean products, particularly of the hydrosoluble extract (soymilk), is one of the main problems to its acceptance by western people. The compounds responsible for this flavor are secondary products of the oxidation of the fatty acids catalysed by a group of isoenzymes called lipoxygenases, which are activated when soybeans are wet. During soybean soaking, in the traditional process of soymilk production, cells of the cotiledons are broken due to swelling caused by the fast absorption of water, allowing the contact enzyme-substrate. The objective of this study was to extract and to analyse by spectrophotometric absorption at 232 nm the soybean lipid fraction after soaking in different temperatures and freeze-drying. It was observed that the highest the soaking water temperature, the lowest was the oxidation found in the soybean lipids. Results varied from 3.40 [(g/100ml)cm]^-1 (dry soybeans) to 5.88 [(g/100ml)cm]^-1 (soybeans soaked for 8 h at 22°C). The method adopted allowed the detection of different levels of oxidation for different soaking temperatures.

Key words: Soybean milk, soaking, lipid fraction, thermal inactivation, lipoxygenase.

1 — INTRODUÇÃO

As lipoxigenases (oxidoredutase linoleato: oxigênio, E.C. 1.13.11.12) são isoenzimas que catalisam a incorporação de moléculas de oxigênio em ácidos graxos polinsaturados (substratos) que possuem a estrutura cis,cis-1,4-pentadieno. Os ácidos graxos vegetais mais comuns que possuem essa estrutura são os ácidos linoléico e linolênico. Os grãos de soja constituem a fonte mais rica de lipoxigenases, sendo que quatro isoenzimas foram isoladas, as lipoxigenases L-1, L-2, L-3a e L-3b. Estas isoenzimas diferem entre si em vários aspectos da ação catalítica tais como pH ótimo de ação, especificidade para substrato, regio-especificidade, produtos primários e secundários formados e valor de K_m. As isoenzimas L-3a e L-3b são muito similares em suas propriedades e, para fins analíticos, podem ser consideradas idênticas e caracterizadas como L-3 (3).

Os ácidos graxos dos grãos de soja são os saturados (~15%) palmítico e esteárico; o monoinsaturado oléico (~24%), e os polinsaturados, linoléico (~54%) e linolênico (~7%) (24). Portanto, a soja contitui-se num dos produtos mais susceptíveis a ocorrência da oxidação dos ácidos graxos, contudo, somente com o dano ao tecido do cotilédone do grão de soja, a enzima lipoxigenase e o substrato lipídico são postos em contato. Enquanto o tecido for mantido seco (aproximadamente 13% de umidade) a enzima não catalisa a oxidação do substrato. Entretanto, se água é adicionada em temperaturas inferiores à de inativação enzimática, a reação ocorre rapidamente e produz "flavor de feijão ou oxidado" altamente rejeitável, o qual é aceito apenas pelos orientais que desenvolveram paladar tolerante (18).

Os sólidos solúveis são lixiviados dos grãos de soja em velocidades relativamente constantes durante toda a hidratação e as quantidades lixiviadas são maiores em temperaturas mais elevadas. A temperatura é o fator mais importante na absorção de água e perda de sólidos. Do total de sólidos perdidos (até 10,4 % após 24 h, a 37°C), 7 a 16 % são proteínas após macerações de 2h a 20°C e de 24h a 37°C, respectivamente. A proporção de proteína perdida aumenta com o aumento do tempo e da temperatura de hidratação (22). Na germinação de sementes, se a absorção de água é muito rápida, elas podem sofrer danos (rupturas) e liberar nutrientes para o solo estimulando o crescimento de fungos e bactérias que podem invadí-las e deteriorá-las. Há liberação de gases adsorvidos em colóides e perdas de solutos tais como açúcares, ácidos orgânicos, íons, aminoácidos e proteínas para o meio. Grãos de soja também perdem certos inibidores de proteinases e lectinas de sua parede celular no início da embebição e estes compostos seriam agentes protetores contra microrganismos ou insetos invasores (5).

Portanto, o processo de maceração viabiliza o contato enzima-substrato permitindo assim, a ocorrência da oxidação dos ácidos graxos. Além disso, deve-se considerar que os produtos secundários responsáveis pelo sabor e aroma desagradáveis dos derivados da soja, resultantes da oxidação dos ácidos graxos, possuem valores de sensibilidade pelo paladar humano muito baixos, em níveis de ppm (11), de modo que a sua percepção pode ocorrer mesmo em um baixo nível de oxidação dos ácidos graxos. A oxidação de óleos que contém linoleato ou ácidos graxos mais insaturados (como o óleo de soja), é acompanhada pela conjugação de duplas ligações que levam a um aumento progressivo da absorção de luz na região do ultravioleta (12).

Vários métodos foram propostos para a inativação das lipoxigenases e melhoria do sabor e aroma dos produtos da soja. Dentre eles, se destacam os que fazem uso de energia térmica.

Este estudo teve por objetivo o acompanhamento do grau de oxidação enzimática (devido à ação das lipoxigenases) sobre a fração lipídica de grãos de soja submetidos à maceração em diferentes condições de tempo-temperatura, utilizando a análise da fração lipídica por espectrofotometria. Para isso, houve necessidade de adaptação de métodos rápidos e eficazes de extração que permitissem a análise direta da fração lipídica.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Cultivar utilizado

Grãos de soja da variedade Davies da safra 94/95 foram obtidos do Centro Nacional de Pesquisa da Soja (CNPSo) da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) - Londrina, PR.

2.2 – Caracterização dos grãos

Os grãos de soja foram caracterizados pela determinação dos teores de óleo, método Ac 3-44 da A.O.C.S. (2), proteína pelo método micro-Kjeldahl da A.O.A.C. (1), umidade, método 6.1.1.2 e cinza, método 4.8 do Instituto Adolfo Lutz (15) e carboidratos (calculado pela diferença percentual, considerando-se a somatória dos demais componentes)

Também foram determinados os índices de acidez e de peróxido segundo a AOCS (2) e o coeficiente de extinção conforme a IUPAC (16) da fração lipídica extraída dos grãos de soja em extrator tipo Butt, método Ac 3-44, modificado para utilizar 20 g de amostra e extração por 16 horas (2).

2.3 – Macerações

Grãos de soja íntegros e em boas condições, conforme seleção visual, foram submetidos a macerações em várias condições de tempo-temperatura. Água mineral foi empregada nas macerações, adquirida em vasilhame de 50 l, no comércio local, a fim de garantir que não houvesse diferença entre os tratamentos provocada por variações na sua composição. Pesaram-se 50g de grãos que foram imersos em água mineral (150 ml) à temperatura ambiente de 22°C e 50°, 60°, 70°, 80° e 98°C até absorção de água equivalente a 8 horas de maceração à temperatura ambiente (aproximadamente 1,1 vezes a massa inicial para o cultivar Davies) e depois de liofilizados tiveram a fração lipídica extraída e analisada. As macerações às temperaturas acima da ambiente foram realizadas em banho-Maria.

2.4 – Extração da fração lipídica

A extração da fração lipídica das amostras (grãos triturados em moinho tipo ciclone), submetidas às condições de maceração descritas, foi realizada pelo método de Hara & Radin (13) modificado. Uma extração inicial foi realizada com 8 ml de isopropanol (ISP), como em método utilizado por De La Roche & Andrews (8), seguida pela adição de 12 ml de isoctano (ISO), conforme o método de Hara & Radin (13), com a substituição da mistura hexano-isopropanol pela de isooctano-isopropanol. À miscela obtida adicionaram-se 12 ml de solução de sulfato de sódio (1g Na₂SO₄ anidro/15 ml de solução) misturando-se por 1 minuto em misturador tipo Potter e transferindo todo o conteúdo para tubo de vidro. Após a separação das fases, uma amostra de 5ml foi retirada da fase superior (rica em isoctano) com pipeta volumétrica e foi transferida para placa de Petri previamente tarada para determinação do conteúdo de óleo (base para o cálculo final). Outra amostra de 2ml foi transferida para balão volumétrico de 25 ml cujo volume foi completado com a mistura ISO-ISP 3:2, para análise espectrofotométrica.

2.5 – Análise da fração lipídica

Determinou-se o coeficiente de extinção pela fórmula (16):

onde: A_{232 nm (ou 270 nm)} é a absorbância no comprimento de onda de 232 nm (ou 270 nm);

C é a concentração de óleo em g/100 ml;

D é a largura da cubeta (1 cm).

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 encontra-se a composição química dos grãos de soja do cultivar Davies e na Tabela 2 os índices de acidez e de peróxido e o coeficiente de extinção (dienos conjugados a 232 nm) da fração lipídica extraída dos grãos de soja em extrator tipo Butt.

A composição química do cultivar Davies apresentou-se bastante próxima da encontrada, para o mesmo cultivar, por Mandarino et al. (17) e também por Turatti et al. (21).

Os limites máximos estabelecidos para óleo virgem comestível (extraído exclusivamente por processo mecânico), pela Resolução Nº 22/77 da Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos (6), são de 2,0% e 20mEq/Kg para os índices de acidez e de peróxido, respectivamente. Portanto, considerando que a extração do óleo para a obtenção dos dados da Tabela 2 foi por solvente em extrator tipo Butt e secagem em estufa a 105°C, pode-se dizer que a fração lipídica dos grãos estudados estava em boas condições.

O processo de maceração depende do tempo e da temperatura, além da variedade do grão de soja. A Figura 1 apresenta as curvas aproximadas de absorção de água pelo cultivar Davies em várias temperaturas. Observa-se, de imediato, que a velocidade de absorção de água é proporcional à temperatura de maceração. Os grãos de soja absorvem água rapidamente nas duas primeiras horas seguindo uma absorção mais lenta (22).

As curvas da Figura 1 mostram que os valores experimentais de água absorvida pelos grãos de soja, podem ser representados com boa aproximação, por funções polinomiais de 2ª ordem do tipo: M_{grãos = –At}^{2 + Bt + C} onde, M_grãos é a massa de grãos de soja, t é o tempo de maceração e, A e B são, por sua vez, funções da temperatura (T em °C) expressas por A = 5 x 10^{-6 T3,6974} (R² = 0,9704) e B = 0,0302 T^1,8705 (R² = 0,9725). Todas as curvas ajustadas apresentaram coeficiente de correlação, R² > 0,99, com exceção da temperatura de 98°C que apresentou R² = 0,9722. A absorção de água nesta temperatura é muito rápida, o que talvez justifique a menor homogeneidade dos resultados.

Para a verificação da ocorrência de oxidação, os grãos de soja foram macerados nas diferentes temperaturas até que absorvessem a quantidade de água equivalente a 8 horas de maceração à temperatura ambiente (bulbo seco ~26°C e bulbo úmido ~22°C). Nestas condições, a quantidade de água absorvida após 8 horas de maceração foi de 1,1 vezes o peso inicial, ou seja, a massa de grãos passou de 50g para 105g, aproximadamente. A velocidade de absorção de água pelos grãos, que pode-ser verificada pelos tempos necessários para se atingir 1,1 vezes o peso original dos grãos, foi de 1,83h (1h e 50min) a 50°C, 1,33h (1h e 20min) a 60°C, 0,87h (52min) a 70°C, 0,55h (33min) a 80°C e, 0,47h (28 min) a 98°C. A Figura 2 apresenta os coeficientes de extinção da fração lipídica destes grãos íntegros macerados em água nestas temperaturas e tempos. O coeficiente de extinção obtido para a fração lipídica de grãos macerados em água à temperatura ambiente foi de 5,88, valor intermediário entre os obtidos para a fração lipídica de grãos não macerados que foi de 3,4 e a de grãos triturados e misturados com água por uma hora, 8,92. Há indicação de formação de dienos conjugados no processo de maceração de grãosíntegros, da oxidação da fração lipídica na maceração. Era de se esperar que o nível de oxidação da fração lipídica de grãos íntegros fosse menor que a de grãos triturados e adicionados de água, pois nestes, tanto as lipoxigenases como seus substratos encontram-se descompartimentalizados e, portanto, liberados para a reação.

Através da Figura 2, observa-se também, que apenas os grãos macerados a 80 e 100°C não sofreram oxidação, uma vez que o coeficiente de extinção da fração lipídica está próximo do de grãos não macerados, o que está em concordância com outros trabalhos. Wilkens et al. (23) concluíram que a temperatura mínima da água de homogeneização da soja para que não haja formação de compostos voláteis, responsáveis pelo odor e sabor desagradáveis, é de 80°C. Baker & Mustakas (4) alcançaram a completa inativação das lipoxigenases após 15 minutos de cozimento em água a 82°C (180°F). Nenhuma inativação foi observada pelo autor a 49°C (120°F). Rice et al. (20) chegaram à completa inativação das lipoxigenases de grãos íntegros com umidade de 8%, após aproximadamente 3 minutos de aquecimento a 100°C com vapor vivo à pressão atmosférica. Brown et al. (7) obtiveram a inativação térmica das lipoxigenases dos cotilédones da soja sem perda da solubilidade das proteínas, através do ajuste da umidade dos cotilédones para 16,3% com um tampão de KOH/NaHCO₃, pH = 9,8, e aquecimento com vapor por aproximadamente 10 segundos. Em temperaturas superiores a 91°C, 99% das lipoxigenases podem ser inativadas com manutenção de solubilidade de proteínas acima de 70%. Hildebrand & Kito (14) estudaram a inativação térmica de cada isoenzima: 20 min, a 70°C foi suficiente para inativar completamente as L-2 e L-3 nos extratos brutos, enquanto a L1 permaneceu ativa; o aquecimento a 70°C por 120 min foi suficiente para inativar completamente todas as três isoenzimas. Engeseth et al. (9) verificaram que as isoenzimas lipoxigenases de farinhas de soja não foram completamente inativadas após 3 horas a 67°C.

Demonstrou-se também, que a inativação térmica das lipoxigenases, bem como a insolubilização das proteínas, podem ser descritas como reações de primeira ordem, ou seja, a taxa de atividade da enzima diminui exponencialmente com o tempo de aquecimento (10, 19, 20). O coeficiente de extinção (E) da fração lipídica dos grãos macerados diminuiu com a temperatura de maceração e pode ser representada pela equação polinomial de segunda ordem, E = 0,0003T² - 0,0646T + 7,2095 (R²=0,9923).

Rice et al. (20) estudaram o efeito da umidade de grãos íntegros na inativação das lipoxigenases a 100°C e constataram que o tempo para a inativação diminuiu lentamente com o aumento da umidade até esta se aproximar de 18%, acima deste valor o tempo necessário para inativação diminuiu rapidamente. Este dado completa as informações deste estudo, uma vez que quanto maior a temperatura, mais rápida é a absorção de água e, com mais água, mais rápida é a inativação das lipoxigenases.

Estes resultados fornecem forte indicação de que o método utilizado neste trabalho permite o acompanhamento da ação das lipoxigenases através da análise espectrofotométrica da fração lipídica em 232 nm.

4 — CONCLUSÕES

O método de extração da fração lipídica modificado de Hara & Radin (13), aplicado aos grãos de soja macerados e depois liofilizados, para a verificação da ocorrência de oxidação, é simples, rápido, de baixo custo e, permite a análise direta da miscela por espectrofotometria.

Para os grãos macerados em temperaturas superiores à ambiente, as análises espectrofotométricas da fração lipídica permitiram observar, de forma indireta, o nível de atuação das lipoxigenases e, portanto, o grau de oxidação (pelo menos relativo) sofrido pela fração lipídica. Quanto maior a temperatura, mais rápida foi a absorção de água e menor a oxidação sofrida pela fração lipídica. Embora os danos provocados pela rápida absorção de água sejam maiores em temperaturas mais elevadas, isto é compensado pela mais rápida inativação das lipoxigenases.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

² Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial - ESALQ/USP, C.P. 09, CEP 13418-900 Piracicaba, SP. E-mail: [e-mail]

• (1) A.O.A.C. - ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - Official methods of analysis, 11ª ed., Washington, 1970.
• (2) A.O.C.S. - AMERICAN OIL CHEMISTS’ SOCIETY - Official methods and recommended practices, 4ª ed., Champaign, 1991.
• (3) AXELROD, B.; CHEESBROUGH, T.M.; LAAKSO, S. Lipoxygenase from soybeans. Methods in enzymology, New York. v.71, p.441-451, 1981.
• (4) BAKER, E.C. & MUSTAKAS, G.C. Heat inactivation of trypsin inhibitor, lipoxygenase and urease in soybeans: effect of acid and base additives. Journal of the American Oil Chemists Society, Champaign. 50:137-141, 1973.
• (5) BEWLEY, J.D. & BLACK, M. SEEDS - Physiology of development and germination. 2ed. N.Y., London: Plenum Press, 1994. 445p.
• (6) BRASIL. Ministério da Saúde. Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos - C.N.N.P.A., Res. 22/77. In: ABIA , São Paulo, 1981.
• (7) BROWN, B.D.; WEI, L.S.; STEINBERG, M.P.; VILOTTA, R. Minimizing protein insolubilization during thermal inactivation of lipoxygenase in soybean cotyledons. Journal of the American Oil Chemists Society, Champaign. 59(2): 88-92, 1982.
• (8) DE LA ROCHE, I.A.& ANDREWS,C.J. Changes in phospholipid composition of a winter wheat cultivar during germination at 2°C an 24°C. Plant Physiology, Rockville. 51: 468-473, 1973.
• (9) ENGESETH, N.J.; KLEIN, B.P.; WARNER, K. Lipoxygenase isoenzymes in soybeans: effects on crude oil quality. Journal of Food Science, Champaign. 52(4):1015-1019, 1987.
• (10) FARKAS, D.F. & GOLDBLITH, S.A. Studies on the kinetics of lipoxidase inactivationusing thermal and ionizing energy. Journal of Food Science, Champaign. 27: 262-276, 1962.
• (11) FRANKEL, E.N. Chemistry of autoxidation: mechanism, products and flavor significance. In: MIN, D.B. & SMOUSE, T.H. Flavor Chemistry of Fats and Oils Champaign: AOCS, 1985. cap.1, p.1-37.
• (12) GRAY, J.I. Simple chemical and physical methods for measuring flavor quality of fats and oils. In: MIN, D.B. & SMOUSE, T.H. Flavor Chemistry of Fats and Oils. Champaign: SOCS, 1985. Cap 12, p. 223-239.
• (13) HARA, A. & RADIN, N. S. Lipid extration of tissues with a low-toxicity solvent. Analytical Biochemistry, New York. 90:420-426, 1978.
• (14) HILDEBRAND, D.F. & KITO, M. Role of lipoxygenase in soybean seed protein quality. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Easton. 32:815-819, 1984.
• (15) INSTITUTO ADOLFO LUTZ - Normas Analíticas, 3Ş ed., São Paulo, 1985. 533p.
• (16) I.U.P.A.C. - INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY - Standard methods for the analysis of oils, fats and derivatives. 6ª ed., London: Pergamon Press, 1979.
• (17) MANDARINO, J.M.G.; CARRÃO-PANIZZI; OLIVEIRA, M.C.N. Chemical composition of soybean seeds from different production areas of Brazil. Arquivos de Biologia e Tecnologia, Curitiba. 35(4): 647-653, 1992.
• (18) NELSON, A.I.; STEINBERG, M.P.; WEI, L.S. Illinois process for preparation of soymilk. Journal of Food Science, Champaign. 41:57-61, 1976.
• (19) PAULA, A.C.O. de; CARVALHO Jr, I.C.; CABRAL, L.C.; VIEIRA, C.R.; BASTOS, A.M.M. Estudo cinético da inativação térmica da lipoxigenase e da insolubilização protéica na soja. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas. 15(3): 262-267, 1995.
• (20) RICE, R.D.; WEI, L.S.; STEINBERG, M.P.; NELSON, A.I. Effect of enzyme inactivation on the extracted soybean meal and oil. Journal of the American Oil Chemists Society, Champaign. 58: 578-83, 1981.
• (21) TURATTI, J.M.; SALLES, A.M.; SANTOS, L.C.; MORI, E.E.M.; FIGUEIREDO, I.B. Estudos preliminares com cultivares de soja para produção de leite. Boletim do Instituto Tecnológico de Alimentos, Campinas 16(3): 289-305, 1979.
• (22) WANG, H. L.; SWAIN, E. W.; HESSELTINE, C. W.; HEATH, H. D. Hydration of whole soybeans affects solid losses and cooking quality. Journal of Food Science, Champaign 44:1510-1513, 1979.
• (23) WILKENS, W.F.; MATTICK, L.R.; HAND, D.B. Effect of processing method on oxidative off-flavors of soybean milk. Food Technology, Champaign, 21:1630-1633, 1967.
• (24) WILSON, R.F. Seed Metabolism. In: WILCOX, J.R. SOYBEANS: Improvement, production and uses 2.ed. Madison: Academic Press, 1987. cap.16, p.643-683.

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Recebido para publicação em 22/04/97. Aceito para publicação em 04/12/97.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Dez 2004
• Data do Fascículo
  Dez 1997

Histórico

• Recebido
  22 Abr 1997
• Aceito
  04 Dez 1997