Caracterização das O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas isoladas da madeira de Eucalyptus urograndis

Characterization of O-acetil-(4-O-methylglucurono)xylans from Eucalyptus urograndis

Eucalyptus urograndis; xylans; NMR

ARTIGO

Caracterização das O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas isoladas da madeira de Eucalyptus urograndis

Characterization of O-acetil-(4-O-methylglucurono)xylans from Eucalyptus urograndis

Andréia da Silva Magaton^{I, *}; Dorila Piló-Veloso^I; Jorge Luiz Colodette^II

^IDepartamento de Química, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627, 31270-901 Belo Horizonte – MG, Brasil

^IIDepartamento de Engenharia Florestal, Universidade Federal de Viçosa, Campus Universitário, 36571-000 Viçosa - MG, Brasil

ABSTRACT

The O-acetyl-4-O-methyl-(glucurono)xylans were isolated from E. urograndis by extraction with dimethyl sulfoxide, analysed for monosaccharide composition and structurally characterized by NMR spectroscopy. These xylans contained one 4-O-methyl-glucuronic acid substituent and 5.5 acetyl groups for approximately 10 xylose residues. About 10% of 4-O-methyl-glucuronic acid (MeGlcA) units were branched at O-2. The O-acetyl-4-O-methyl-(glucurono)-xylans were composed of the following (1 → 4)-linked β-D-xylopyranosyl structural elements: unsubstituted (51 mol%), 2-O-acetylated (12 mol%), 3-O-acetylated (20 mol%), 2,3-di-O-acetylated (6 mol%) and [MeGlcA α-(1 → 2)] [3-O-acetylated] (11 mol%). The weight-average molar mass and polydispersity of this xylan were 34.9 kDa and 1.16, respectively, as measured by size-exclusion chromatography.

Keywords:Eucalyptus urograndis; xylans; NMR.

INTRODUÇÃO

Atualmente a madeira de eucalipto representa a principal fonte de fibras em países da América do Sul e da Península Ibérica e tem se tornado muito atrativa para a produção de celulose e papel em outras regiões do mundo.¹ O Brasil ocupa lugar de destaque na fabricação mundial de celulose de fibra de eucalipto, respondendo por 31% da capacidade global para o produto, de aproximadamente 22 milhões de t por ano. Para 2010, estima-se que a capacidade anual chegue a 8,2 milhões de t de um total global próximo a 27 milhões.² Apesar da relevância da indústria de celulose e papel na economia nacional, o conhecimento fundamental da principal matéria-prima, o eucalipto, ainda é bem escasso.

A qualidade da celulose ou papel está diretamente relacionada à composição química da madeira. Dentre seus constituintes, as hemiceluloses têm despertado grande interesse mundial nos últimos anos, devido, principalmente, à sua influência nas propriedades da polpa celulósica produzida a partir de fibras da madeira.^3,4

As hemiceluloses são encontradas entre as fibras de celulose na parede celular e representam cerca de 30% da massa seca da madeira. Entre as hemiceluloses, especial atenção tem sido direcionada à estrutura das O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas, que são as principais hemiceluloses do eucalipto. Embora a estrutura química de xilanas de algumas espécies de madeira tenha sido elucidada entre as décadas de 40 e 60,^5-8 vários trabalhos recentes têm sido publicados, visando encontrar detalhes estruturais, utilizando metodologias analíticas mais avançadas, dentre estas a espectroscopia de RMN, a cromatografia de exclusão por tamanho e a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.^9-14 Além disso, novas espécies têm sido submetidas a estudos, pois xilanas de diferentes espécies apresentam diferentes graus de polimerização e diferentes graus de substituição por grupos acetila e ácidos 4-O-metilglicurônicos.¹⁵

O crescente interesse pela química das xilanas deve-se ao comportamento destas hemiceluloses durante os processos de polpação alcalina e branqueamento. Por exemplo, durante a polpação kraft, as cadeias de xilanas podem ser despolimerizadas, resultando em polissacarídeos de menor massa molecular, ou ainda, ser dissolvidas no licor de cozimento, mantendo parcialmente a natureza polimérica. Quando o pH decresce, no final do cozimento, parte das xilanas dissolvidas pode precipitar ou ser adsorvida na superfície da polpa.¹⁶ Este processo de sorção das xilanas leva a um aumento do rendimento da polpação, afetando a qualidade da polpa e, portanto, tem impulsionado muitas pesquisas cujos objetivos visam esclarecer o mecanismo envolvido e encontrar as melhores condições de sorção na polpa.^16-18 Além disso, a estrutura das xilanas é quimicamente modificada pela conversão, via β-eliminação, de parte dos seus grupos de ácidos 4-O-metilglicurônicos a ácidos hexenurônicos.^19-21 Estes protegem as xilanas contra a reação de despolimerização terminal e, portanto, sua presença na polpa preserva o rendimento. No entanto, as ligações duplas conjugadas na estrutura dos ácidos hexenurônicos influenciam negativamente o processo de branqueamento da polpa.^22-26

Embora as O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas presentes na madeira influenciem muito no processo de produção de celulose, não há na literatura estudo referente à estrutura destas hemiceluloses das principais espécies de eucalipto utilizadas na indústria nacional de celulose e papel. Dessa forma, o presente trabalho relata o primeiro estudo de caracterização química de O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas da madeira do Eucalyptus urograndis.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A estrutura das xilanas isoladas da madeira de Eucalyptus urograndis foi confirmada através de análises espectroscópicas no infravermelho e de ressonância magnética nuclear de ¹H, ¹³C, 2D ¹H-¹H COSY e TOCSY e de correlação heteronuclear ¹H-¹³C HSQC.

O espectro de absorção na região do infravermelho mostra claramente absorções típicas de hemiceluloses. A banda mais característica foi observada em 1043 cm^-1, atribuída aos estiramentos da ligação C-O-C das unidades de xilose. Na região característica de deformação de C-H de hidrogênios anoméricos (950-700 cm^-1), uma banda pouco intensa em 901 cm^-1 indica a presença de β-anômeros, revelando a dominância de ligações β-xilosídicas entre as unidades de xilose nas hemiceluloses.²⁷

A presença de grupos acetila é evidenciada pela absorção em 1738 cm^-1, atribuída aos estiramentos da ligação C=O de ésteres. Próximo a esta banda observa-se uma absorção em 1641 cm^-1, que se deve, principalmente, à absorção de água. A ausência da absorção ao redor 1720 cm^-1, característica de carbonilas cetônicas, devidas à oxidação de grupos hidroxilícos hemicelulósicos, permite inferir que não ocorreu oxidação das hemiceluloses durante o procedimento de isolamento sob as condições empregadas.

Os sinais observados no espectro de RMN de ¹H próximos a δ_H 2,20 (2,18; 2,13; 2,12 e 2,07) e os sinais observados no espectro de RMN de ¹³C na região próxima de δ_C 22,00 (22,16; 21,99; 21,77 e 21,59) atribuídos respectivamente aos hidrogênios e carbonos de CH₃CO, bem como os sinais próximos a δ_C 170,00 (171,00; 170,93; 170,68 e 170,60) devidos a carbonilas de grupos acetilas, respectivamente, indicam que a xilana está acetilada.

O espectro de RMN de ¹H das O-acetil-(4-O-metilglicu-rono)xilanas apresentou vários sinais presentes na região entre δ_H 4,4 e 5,5, mostrando a complexidade da estrutura. Como os núcleos de carbono apresentam sinais mais resolvidos, de freqüências características e de atribuição mais simples, para facilitar a interpretação utilizou-se a técnica de correlação heteronuclear HSQC, objetivando identificar as ressonâncias dos hidrogênios anoméricos e separá-las daquelas dos demais hidrogênios do anel piranosídico da xilose. As regiões de ressonância dos hidrogênios e carbonos anoméricos são, respectivamente, δ_H 4,4-5,5 e δ_C 90-105, enquanto a região de hidrogênios ligados a carbonos substituídos por grupos OAc corresponde a δ_H 4,4-5,5 e δ_C 70-80.

No mapa de contornos HSQC, na região característica de ressonância de carbonos anoméricos, foram encontradas sete correlações δ ¹H/¹³C: 5,27/98,50; 4,73/100,30; 4,69/101,50; 4,63/101,00; 4,53/102,13; 4,45/102,25; 4,37/103,40, indicando a presença de sete diferentes unidades de açúcares. Para a atribuição dos sinais baseou-se em dados da literatura, tomando-se como referência os estudos realizados sobre a estrutura de xilanas acetiladas isoladas de fibre flax²⁸ e da madeira de Populus tremula,²⁹ assim como de glicuronoxilanas isoladas do E. globulus.⁹ O sinal do hidrogênio anomérico em δ_H 5,27 e o simpleto atribuído ao grupo metoxila em δ_H 3,45 são característicos do ácido 4-O-metilglicurônico, ligado à unidade de xilose através da ligação α-(1 → 2).³⁰ Pelo mapa de contornos COSY foi possível atribuir o sinal em δ_H 3,56 ao H-2 do ácido 4-O-metilglicurônico e a técnica TOCSY permitiu atribuir mais dois sinais neste sistema de spin, em δ_H 3,78 e δ_H 3,20. Pelo mapa de contornos HSQC foi possível verificar as seguintes correlações δ_H 3,78/ δ_C 73,3 e δ_H 3,20 / δ_C 83,12 e concluir que o sinal em δ_H 3,78 é devido ao H-3 e o sinal em δ 3,20 é devido ao H-4, por estar ligado ao carbono de deslocamento químico 83,12 característico de carbono ligado à metoxila. O sinal do carbono do grupo metoxila foi encontrado em δ_C 60,80.

Em relação às unidades de xilose, os sinais dos hidrogênios anoméricos foram divididos em seis tipos, conforme apresentados na Tabela 1: i- Xilose interna não acetilada e não vizinha à xilose acetilada (Xil); ii- Xilose interna não acetilada e vizinha à xilose acetilada [Xil-(Xil-Ac)]; iii- Xilose acetilada no O-2 (Xil-2Ac); iv- Xilose acetilada no O-3 (Xil-3Ac); v- Xilose acetilada no O-2 e no O-3 (Xil-2,3Ac); vi- Xilose acetilada no O-3 e substituída no O-2 pelo ácido 4-O-metilglicurônico (Xil-3Ac-2AMeGlc). Partindo-se dos sinais dos hidrogênios anoméricos, os sinais de H-2 foram atribuídos pela análise do mapa de contornos COSY e com o auxílio do mapa de contornos TOCSY montaram-se os sistemas de spins (A, B, C, D, E e F) referentes aos seis diferentes tipos de xilose presentes na estrutura das O-acetil-(4-O-metilglicu-rono)xilanas, conforme mostra a Tabela 1.

A inspeção do espectro de HSQC na região δ_H 4,4-5,5/ δ_C 70-80 permitiu distinguir as unidades de xilose acetiladas no O-2 e/ou O-3. Nesta região, foram obtidas as seguintes correlações: δ_H 5,09/ δ_C 72,50; δ_H 5,02/ δ_C 75,00; δ_H 4,93/ δ_C 76,26; δ_H 4,75/ δ_C 74,47; δ_H 4,64/ δ_C 74, 55, que se referem, como pode ser visto na Tabela 1, aos sistemas A, B, D, A e C, respectivamente. De posse destes resultados, foi possível concluir que o sistema de spin A se refere às unidades de xilose acetiladas no O-2 e O-3, pois os hidrogênios H-2 (δ_H 4,75) e H-3 (δ_H 5,09) são os mais desblindados em relação aos H-2 e H-3 das outras unidades, por serem adjacentes aos grupos acetila. O sistema de spin, que possui o H-3 (δ_H 5,02) ligado a um carbono acetilado, pode se referir tanto à xilose acetilada no O-3, quanto à xilose acetilada no O-3 e substituída no O-2 pelo ácido 4-O-metilglicurônico. Tal dúvida foi solucionada a partir da correlação H-2 δ_H 3,69/ C-2 δ_C 77,20 deste sistema de spin observada no mapa de contornos HSQC, revelando que se trata da xilose acetilada no O-3 e substituída no O-2 pelo ácido 4-O-metilglicurônico. O carbono 2 da xilose neste elemento estrutural apresenta desblindagem caracteristicamente experimentada pelos átomos de carbono que estão envolvidos em ligações glicosídicas.³⁰ Este elemento estrutural foi detectado pela primeira vez em xilanas de folhosas de Populus tremula no estudo realizado por Teleman et al..²⁹ Neste estudo foi relatado que todas as unidades de ácido 4-O-metilglicurônico estão ligadas a unidades de xilose acetiladas no O-3. Em trabalho posterior, realizado por Teleman et al.³¹ em xilanas de folhosa de birch e beech, foi encontrado que 80% dos ácidos 4-O-metilglicurônicos estão ligados a xiloses acetiladas no O-3. Pela integração do sinal do hidrogênio H-3 (δ_H 5,02) do elemento estrutural Xil-3Ac-2AMeGlc e do sinal do hidrogênio H-1(δ_H 5,27) dos ácidos 4-O-metilglicurônicos encontrou-se a razão 1:1, indicando que todos os ácidos 4-O- metilglicurônicos estão ligados a xiloses acetiladas no O-3. O sistema C refere-se à xilose acetilada no O-2 e o sistema D à xilose acetilada no O-3, conforme demonstrado pelas correlações H-2 δ_H 4,64/ C-2 δ_C 74,55 e H-3 δ_H 4,93/ C-3 δ_C 77,40, respectivamente. O H-3 do sistema C foi atribuído a partir do mapa de contornos do COSY. A distinção entre as unidades de xilose acetiladas isoladas e xilose vizinha a xilose acetilada foi baseada na literatura.²⁸ O sistema de spin E refere-se à xilose isolada e o sistema F, à xilose vizinha à xilose acetilada.

Adicionalmente, foi encontrado, na região de hidrogênios anoméricos do espectro de RMN de ¹H, o sinal em δ_H 5,39, que está, geralmente, ausente em xilanas de folhosas. Este sinal foi atribuído ao H-1 do ácido 4-O-metilglicurônico substituído no O-2, sendo desblindado por aproximadamente 0,12 ppm, em relação ao H-1 do ácido 4-O-metilglicurônico terminal. Este elemento estrutural também foi encontrado em xilanas de E. globulus, e foi proposto que a posição O-2 do ácido 4-O-metilglicurônico constitui um ponto de ligação com outros polissacarídeos da parede celular, tal como as galactanas.^9,10 Nas xilanas do E. globulus encontrou-se que aproximadamente 30% dos ácidos 4-O-metilglicu-rônicos estão substituídos no O-2. Pela integração dos sinais dos hidrogênios anoméricos referentes aos ácidos 4-O-metilglicurônicos terminais e aos substituídos no O-2 das xilanas de E. urograndis foi calculado que 10% destes ácidos estão substituídos.

A quantificação e distribuição dos grupos acetila na estrutura das xilanas foi realizada empregando-se espectroscopia de RMN de ¹H, utilizando-se a metodologia descrita por Teleman et al..²⁹ Pode-se concluir que a proporção entre as unidades de xilose e grupos acetila é de 10:5,3. O grau de acetilação destas xilanas ficou dentro do esperado, pois é sabido que as folhosas apresentam de 4 a 7 grupos acetila para cada 10 unidades de xilose.³² Nas unidades de xilose acetiladas, aproximadamente 33% dos grupos acetila das xilanas de E. urograndis estão ligados no O-2 e 67% no O-3, sendo 36% em Xil-3Ac, 11% em Xil-2,3Ac e 20% em Xil-3Ac-2AMeGlc. Quanto ao teor de ácidos 4-O-metilglicurônicos foi encontrada 1,1 unidade de ácido 4-O-metilglicurônico para 10 unidades de xilose para as O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas. Esta relação ficou bem próxima à encontrada para as folhosas birch, beech e Populus tremula. Em xilanas de birch e beech a relação molar (ácido 4-O-metilglicurônico: xilose) foi de 0,7:10 ³¹ e para Populus tremula a relação foi de 1:10.²⁹ Os deslocamentos químicos de ¹H e ¹³C para as O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas isoladas da madeira do E. urograndis estão em excelente acordo com os valores relatados na literatura para as xilanas isoladas de Populus tremula²⁹ e de birch e beech.³¹

A análise de carboidratos foi realizada empregando-se metanólise ácida, seguida por sililação e separação por cromatografia a gás. Este procedimento possibilita a determinação de ácidos urônicos e açúcares neutros, uma vez que os monossacarídeos liberados são estabilizados pela conversão em seus metilglicosídeos e os grupos carboxílicos dos ácidos urônicos esterificados com grupos metílicos. Dessa forma, evita-se a perda de açúcares neutros e a descarboxilação dos ácidos urônicos, comuns na hidrólise ácida convencional com H₂SO₄ 72%.¹⁴ A composição de carboidratos das O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas está apresentada na Tabela 2.

Os principais monossacarídeos encontrados, como já era esperado, foram xilose e ácidos 4-O-metilglicurônicos, sendo revelada a presença de aproximadamente 0,9 unidade de ácido para 10 unidades de xilose. Esta relação ficou bem próxima à encontrada pela análise do espectro de RMN de ¹H (1,1 ácido 4-O-metilglicu-rônico:10 xiloses). Adicionalmente, foram encontradas galactose e glicose, que podem estar ligadas quimicamente à cadeia de xilana através do ácido 4-O-metilglicurônico, uma vez que 10% destes apresentaram-se substituídos no O-2, como calculado pela análise de RMN de ¹H. Foram identificadas também pequenas quantidades de arabinose e manose. A análise cromatográfica de exclusão por tamanho das xilanas revelou uma distribuição de massa molecular uniforme, indicando que estas foram isoladas sem impurezas de outros carboidratos poliméricos. A massa molecular média e a polidispersividade para as O-acetil-(4-O-metilglicu-rono)xilanas foram 34,9 kDa e 1,16, respectivamente.

PARTE EXPERIMENTAL

Isolamento das O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas

A amostra de madeira do Eucalyptus urograndis foi coletada em árvore com 7 anos de idade, proveniente da região de Mucuri, na Bahia. A madeira foi transformada em serragem e foi submetida à extração em soxhlet utilizando-se etanol:tolueno 1:2 para remoção dos extrativos, que podem interferir na análise. Para a deslignificação, foram pesados aproximadamente 10 g de serragem livre-de-extrativos em erlenmeyer de 1000 mL onde foram adicionados 500 mL de solução de ácido peracético 100 g L^-1. Deixou-se a mistura sob agitação constante a 80 ºC por 40 min. Após a deslignificação, o meio reacional foi diluído duas vezes com água destilada e filtrado em funil de placa sinterizada. A holocelulose obtida após deslignificação foi submetida à extração com dimetilsulfóxido por 12 h, sob atmosfera de N₂. Ao extrato foram adicionados etanol e ácido fórmico para acidificação do meio até pH 3,5. Após a precipitação, as xilanas foram isoladas por centrifugação, lavadas com metanol e secadas sob vácuo.

Espectroscopia no infravermelho e de RMN

Os espectros na região do infravermelho foram registrados em pastilhas de KBr em espectofotômetro ABB Bomem, modelo FTLA 1000, na região de 4000 a 600 cm^-1. Para obtenção dos espectros de RMN, a amostra de xilana foi dissolvida em D₂O e o 3-trimetilsililpropionato de sódio-d₄ foi utilizado como padrão interno (δ 0.00). Os experimentos foram realizados a 70 ºC em espectrômetro Bruker Avance DRX400.

Análise de carboidratos

As O-acetil-(4-O-metilglicurono)-xilanas foram submetidas à metanólise e sililação conforme metodologia descrita na literatura.¹⁴ A amostra foi analisada por cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas, utilizando o aparelho da marca Shimadzu, modelo GC-MS PQ5050A, contendo coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m; 0,25 µm de diâmetro interno; filme de 0,25 mm) e hélio como gás de arraste. A temperatura do injetor foi de 260 ºC. Para a coluna, a temperatura inicial foi de 100 ºC, aumentando de 100 a 290 ºC na taxa de 6 ºC/min, permanecendo nesta por 10 min. A temperatura do detector foi de 290 ºC e na interface CG-EM foi de 290 ºC. O detector de massas operou com ionização por impacto de elétrons (70 eV) e varredura de massas entre o intervalo de 30 a 600. A identificação dos carboidratos foi realizada através da comparação dos espectros de massa com aqueles existentes no banco de dados do aparelho (Wiley, 7ª ed.) e com a injeção de padrões.

Cromatografia de exclusão por tamanho

A massa molecular média e a polidispersividade das amostras de xilanas foram determinadas pela cromatografia de exclusão por tamanho. Estas amostras foram dissolvidas em solução de LiCl 8% em dimetilacetamida e injetadas em um cromatógrafo Shimadzu SCL-10A, equipado com quatro colunas e uma pré-coluna PL-gel Mixed B (Polymer Laboratories). As colunas, o injetor e o detector de índice de refração foram mantidos a 80 ºC durante a análise. O fluxo do eluente (0,5% LiCl em dimetilacetamida) foi 1,0 mL min^-1. As colunas analíticas foram calibradas com os padrões Pullulan (Polymer Laboratories).

CONCLUSÃO

Os resultados obtidos levaram a concluir que as O-acetil-(4-O-metilglicurono)xilanas isoladas da madeira de Eucalyptus urograndis são muito semelhantes às encontradas em outras folhosas. As relações molares de unidades de xilose e grupos de ácidos 4-O-metilglicurônicos foram 10:1,1 e 10:0,9, fornecidas pela análise do espectro de RMN de ¹H e pela análise de carboidratos por metanólise, respectivamente. Estas hemiceluloses apresentaram grau de acetilação de 0,55 AcO/xilose e mostraram, assim como as xilanas do E. globulus, a presença de ácidos 4-O-metilglicu-rônicos cujos O-2 encontram-se substituídos. A massa molecular média foi de 34,9 kDa e a polidispersividade 1,16.

MATERIAL SUPLEMENTAR

O material suplementar apresenta a estrutura geral das xilanas e os espectros no IV e de RMN de ¹H e de ¹³C das xilanas de Eucalyptus urograndis obtidas neste trabalho. Este material está disponível em http://quimicanova.sbq.org.br, com acesso gratuito, em arquivo PDF.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e à Sociedade de Investigações Florestais (SIF), pelo apoio financeiro.

Recebido em 20/4/07; aceito em 26/10/07; publicado na web em 8/7/08

Material Suplementar

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Set 2008
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Recebido
  20 Abr 2007
• Aceito
  26 Out 2007