Análise fisiológica em mudas de cafeeiro com cercosporiose submetida a diferentes lâminas de irrigação

Physiological analysis in coffee seedlings showing brown eye spot under different irrigation levels.

RESUMO

Cercosporiose é uma das principais doenças que comprometem o crescimento de mudas de café por causar desfolha e redução no crescimento. A doença apresenta maior severidade quando o cafeeiro está submetido ao déficit hídrico. O uso de irrigação é uma alternativa para minimizar os danos causados pela doença. Objetivou-se neste trabalho avaliar o impacto da doença na fisiologia do cafeeiro em função da redução da lâmina de irrigação. As plantas foram submetidas a três lâminas de irrigação (0.1, 0.6 e 1.2 mm.dia^-1); inoculadas e não inoculadas com C. coffeicola, em delineamento inteiramente casualizado com 35 repetições, totalizando 210 unidades experimentais. As mudas de cafeeiro com cercosporiose apresentaram reduções no potencial hídrico mínimo e na fotossíntese em função da lâmina de irrigação, com excessão da lâmina de irrigação com 0,6 mm.dia^-1. A atividade do sistema antioxidante foi superior nas mudas doentes apenas na maior irrigação. Os resultados comprovaram que a presença da doença incrementou o estresse hídrico nas mudas de café por reduzir o potencial hídrico e uso eficiente de água.

Palavras-chave
Sistema antioxidante; estresse hídrico; fotossíntese; déficit hídrico; trocas gasosas

ABSTRACT

Abstract: Brown eye spot is one of the major diseases that affect coffee seedling growth for causing defoliation and reducing the plant growth. The disease severity is higher when the coffee plant is subjected to water deficit. Using irrigation is an alternative to minimize the damage caused by this disease. The aim of this study was to evaluate the impact of this disease on the physiology of coffee plants as a function of the reduction in the irrigation level. The plants were subjected to three irrigation levels (0.1, 0.6 and 1.2 mm.day^-1), inoculated and not inoculated with Cercospora coffeicola, in a completely randomized design with 35 replicates, totaling 210 experimental units. Coffee seedlings showing brown eye spot presented reductions in the minimum water potential and in photosynthesis as a function of the lower irrigation level, except for the irrigation level 0.6 mm.day^-1. The activity of the antioxidant system in diseased seedlings was only higher under higher irrigation levels. Results proved that the presence of the disease increased water stress in coffee seedlings for reducing both water potential and efficient water use.

Keywords
Antioxidant system; water stress; photosynthesis; water deficit; gas exchange

Em condições de campo, as plantas estão expostas a um conjunto de fatores adversos de origem biótica e abiótica que reduzem a produtividade nas culturas agrícolas. O déficit hídrico é um dos principais fatores limitantes que resultam na queda de produção de alimentos no mundo (¹¹). No Brasil, as regiões de cultivo de café não irrigado, a limitação hídrica causaram reduções na produtividade dos cafeeiros por proporcionar uma diminuição na taxa fotossintética e um menor acúmulo de açúcares para ser destinado para formação do fruto (⁷).

Na fase de muda, o cafeeiro é sensível a limitação hídrica, plantas no estado de déficit hídrico apresentam desfolha e redução na taxa de crescimento. Além disso, o déficit hídrico também leva a perda da turgescência foliar e reduz a atividade fotossintética, implicando em uma menor disponibilidade de carbono para ser investido no crescimento da planta (⁵,⁶). Desta forma, o déficit hídrico pode tornar a planta susceptível a outros fatores adversos, como a infecção de Cercospora coffeicola nas folhas (²⁰).

C. coffeicola é um dos principais patógenos na cultura do cafeeiro que causa a doença chamada cercosporiose, responsável por reduzir em até 40% a produtividade do cafeeiro (21). As condições ambientais que favorecem a germinação dos esporos do fungo são temperatura de 17 ºC e luminosidade de 320 µmol m^-2 s^-1 (21). Os esporos germinam na folha e em seguida produzem hifas que penetram nos estômatos na face abaxial da folha, colonizando as camadas subestomáticas (22). A infecção do fungo promove alterações no metabolismo fotossintético da planta (10), causando prejuízos diretos na produção das mudas no viveiro devido ao aumento no tempo na formação das mudas e a produção de mudas com menor qualidade.

A disponibilidade hídrica no solo está diretamente associado com a severidade da cercosporiose no cafeeiro. Plantas de café submetidas a irrigação apresentaram uma menor ocorrência de cercosporiose, enquanto em condição de déficit hídrico há um aumento na severidade da doença (⁸,20). Entretanto, a presença da doença no cafeeiro submetido ao déficit hídrico incrementou a taxa fotossintética (10). Ainda é desconhecido se o incremento na fotossíntese nas plantas doentes seria proporcionado por um efeito benéfico da infecção do patógeno ou ser proveniente de um transtorno fisiológico na planta. Quando a planta está submetida a mais de um fator adverso, as alterações fisiológicas desencadeadas por um estresse inicial poderão minimizar ou intensificar os danos de outro estresse na planta (¹⁹,⁵).

A atividade do sistema antioxidante é uma das ferramentas para avaliar o estado de estresse das plantas, a partir do combate das espécies reativas de oxigênio (EROS). As EROS podem ser produzidas nos cloroplastos, mitocôndrias e peroxisossomo e sua taxa irá variar de acordo com estado fisiológico da planta. Em baixas concentrações as EROS atuam como sinalizador intercelular, participando da regulação de diversos processos fisiológicos em resposta aos estímulos ambientais (³). Contudo, o excesso de EROS na célula pode resultar em danos nas estruturas celulares e biomoléculas, como a peroxidação lipídica, desnaturação de proteínas e mutações no DNA (¹⁷). Contudo, as plantas possuem um sistema antioxidante enzimático e não enzimático que combatem o excesso de EROS produzido por seu metabolismo. Enzimas como dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT) e peroxidase do ascorbato (APX) são responsáveis por eliminar o excesso de EROS (17). Ainda faltam esclarecimentos sobre as alterações fisiológicas causadas pela cercosporiose associado a uma menor lâmina de irrigação. Deste modo, objetivou-se neste estudo verificar se a presença de cercosporiose nas mudas de café poderá atenuar ou intesificar o estresse hídrico nas plantas com a redução lâmina de irrigação.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

O experimento foi conduzido em casa de vegetação, utilizando mudas de cafeeiro cv. Mundo Novo 376/4 com seis meses de idade. As mudas foram cultivadas em sacos de polietileno (24,0 x 13,5 cm) com volume de 3,5 litros de substrato. As plantas foram adubadas com solução nutritiva de Hoagland e Arnon (¹³) e irrigadas por sistema de gotejamento até atingirem a capacidade de campo. As condições ambientais na casa de vegetação foram monitoradas através do sensor datalogger, sendo registrados a temperatura, umidade relativa e o déficit de pressão de vapor durante o dia.

O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3 x 2, com três lâminas de irrigação (0.1, 0.6 e 1.2 mm.dia^-1), associado à inoculação do fungo Cercospora coffeicola (plantas inoculadas e não inoculadas) com 35 repetições por tratamento, totalizando 210 plantas. As avaliações fisiológicas nas plantas foram realizadas aos 12 dias (T1) e 36 dias (T2) após a implantação dos tratamentos. Os dados obtidos foram inicialmente avaliados pelo teste de normalidade Shapiro-Wilk e posteriormente foi realizado uma análise de variância dos dados. Diferença entre os tratamentos foram obtidas a partir do erro padrão (±EP).

Obtenção de esporos de cercospora coffeicola

Para obtenção de esporos de Cercospora coffeicola utilizou-se a metodologia proposta por Souza com algumas adaptações (22). Oito discos de micélio (0,5 mm de diâmetro) do isolado CML 2984 foram retirados da borda da colônia do fungo e transferidos para 20 ml de meio V8 (100 ml de V8^® plus 900 ml de água destilada) em erlenmeyer de 25 ml os quais foram continuamente agitados (120 rpm) a 25 ºC. Após 4 dias, o conteúdo do erlenmeyer foi vertido em placas de petri contendo meio com ágar 1,5%. As placas foram mantidas abertas em incubadora tipo BOD a 40 cm de distância da lâmpada de luz fluorescente de 40 W, para fornecer 165 µmol s^-1 m^-2 para promover o crescimento do fungo. A condição de incubação foi colocada na temperatura de 25ºC e fotoperíodo de 12 horas. Após a desidratação do meio de cultura (aproximadamente 4 dias de incubação), foi adicionado em cada placa 10 mL de água destilada esterilizada para a remoção dos esporos com o auxílio da alça de Drigaslki. O líquido obtido foi filtrado em gaze para a retirada dos resíduos e a esporulação foi quantificada em câmara de Neubauer. A suspensão utilizada na inoculação foi calibrada para a concentração de 2x10⁴ conídios mL^-1 e aplicada nos três primeiros pares de folhas da planta utilizando um pulverizador ‘De Vilbiss’ nº 15.

Parâmetros fisiológicos

O estado hídrico das plantas foi monitorado a partir da avaliação do seu potencial hídrico, utilizando a câmera de pressão de Scholander para determinação do potencial hídrico máximo (Ψ_pd máximo) entre os horários 3:00 a 5:00h da manhã e potencial hídrico mínimo (Ψ_md mínimo) entre os horários 12:00 a 14:00h da tarde.

A assimilação de CO₂ (A), condutância estomática (g_s) e transpiração (E) foram aferidas entre 9:00 e 11:00 horas, utilizando um analisador portátil de gás infravermelho (IRGA modelo LI-6400 xt), com intensidade luminosa de 1000 µmol m² s^-1 e fluxo 400 umol CO₂ mol^-1 de ar do ambiente. Determinou-se a eficiência do uso da água (EUA), e eficiência do uso da luz (EUL), a partir das equações: EUA= A/E; EUL= A/DFFFA.

Atividade do sistema antioxidante

A quantificação da atividade das enzimas dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT) e peroxidase do ascorbato (APX) foram realizadas em tecidos foliares conforme proposto por (12,15). As amostras foram obtidas utilizando almofariz e nitrogênio líquido, contendo 60 mg de PVPP e 1,5 mL usando os seguintes meios de extração: para SOD (100 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,8; 0,1 mM EDTA e 0,1% Triton X-100); para CAT (100 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,8 e 0,1 mM EDTA) e para APX (50 mM de tampão de fosfato de potássio, pH 7,8 e 1 mM de ascorbato).

Para medir a atividade da SOD, foi adicionada 10µl de alíquota do extrato de proteína com tampão de incubação (100 µl de fosfato de potássio 100 mM, pH 7,8, 40 µl de metionina 70 mM, 3 µL EDTA 10 µM, 31 µL de água, 15 µL de NBT a 1 mM e 2 µL de riboflavina 0,2 mM). Os tubos foram iluminados por 7 minutos com lâmpada fluorescente de 20 W. O branco foi feito apenas com tampão de incubação sem a adição da alíquota da amostra. A atividade da SOD foi determinada pela inibição da fotoredução do azul de nitrotetrazólio (¹²). A leitura foi feita em 560 nm, sendo calculado a atividade da enzima através da equação: % inibição = (A560 amostra com enzima extraída - A560 controle sem extrato da enzima).

Para medir a atividade da CAT, foi adicionado 10 µL da alíquota do extrato de proteína com 170 µL tampão de incubação (90 µL de fosfato de potássio 200 mM, pH 7,0, 71 µL de água e 9 µL de peróxido de hidrogênio 250mM, incubados em 28ºC). A atividade enzimática foi determinada pelo monitoramento do consumo de peróxido de hidrogênio através do decréscimo da absorbância 240 nm. O coeficiente de extinção molar utilizado foi 36 mM^-1 cm^-1.

Para medir a atividade da APX, foi adicionado 10 µL de extrato de proteína com 170 µL de tampão de incubação (90 µL de fosfato de potássio 200 mM, pH 7.0, 9 µL ácido ascórbico 10mM, 62 µL de água e 9 µL de peróxido de hidrogênio) (¹⁶). O coeficiente de extinção molar foi 2.8 mM^-1 cm^-1. Atividade da APX foi determinada por meio do monitoramento da taxa de oxidação do ascorbato em 290 nm avaliado por 15s durante 3 minutos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os dados de temperatura e déficit de pressão de vapor (DPV) registrados na casa de vegetação não apresentaram diferença significativa durante o período de condução do experimento. Com 12 dias de inoculação (T1), os valores de temperatura e DPV_atm médio na casa de vegetação foram de 44,0 + 3,9 °C e 6,5 + 2,0 kPa. Com 36 dias após a inoculação (T2) a média de temperatura e pressão de vapor na casa de vegetação foram de 36,0 + 5,2 °C e 3,6 + 2,5 kPa.

As mudas de café decresceram seu (p < 0,05) potencial hídrico máximo (Ψ_pd) e mínimo (Ψ_md) em função da lâmina de irrigação e da presença de cercosporiose. Nas mudas de cafeeiro com lâmina de irrigação 1,2 mm.dia^-1, observou-se que a presença do patógeno decresceu o Ψ_pd -0,75 Mpa em relação ao controle com Ψ_pd -0,45 Mpa (Figura 1A). Com a redução na lâmina de irrigação para 0,6 mm.dia^-1 e 0,3 mm.dia^-1, houve menor Ψ_md nas mudas de cafeeiro doentes no segundo tempo de avaliação_{. .} O aumento do tempo de exposição nas plantas aos dois fatores adversos reduziu o Ψ_pd da planta (Figura 1).

Figura 1
Potencial hídrico foliar de mudas de cafeeiro (Coffea arabica) submetido a diferentes regimes hídricos, com presença e ausência de inoculação com C. coffeicola. A) máximo (Ψ_pd); B) mínimo (Ψ_md). Diferença significativa entre os tratamentos ± EP (p= 0,05), não diferiram quando houve sobreposição dos erros entre as médias.Legenda:● inoculado T1 ○ não inoculado T1, ▼ inoculado T2 e ∆ não inoculado T2.

Os valores de assimilação CO₂ (A), condutância estomática (gs) e transpiração (E) decresceram proporcionalmente (p < 0,05) com a redução do Ψ_pd foliar (Figura 2). As mudas com lâmina de irrigação 1,2 mm.dia^-1 não exibiram diferença em função da presença do patógeno. Com a redução lâmina de irrigação para 6 mm.dia^-1,as plantas doentes exibiram superior A e E do que as plantas sadias nos dois tempos observados. O aumento proporcionado pela doença nos valores A e E foram causados pela maior gs exibido pelas plantas doentes. Com lâmina de irrigação de 0,3 mm.dia^-1 as plantas doentes obtiveram menor taxa fotossintética que as plantas sadias apenas no primeiro tempo de avaliação. Mesmo havendo superior A que as plantas doentes, as plantas sadias exibiram menor gs. O maior valor de A nas plantas sadias não foi causado pela gs. A taxa de transpiração foi superior nas plantas doentes em relação as plantas sadias apenas no segundo tempo.

Figura 2
Trocas gasosas na folhas de cafeeiro arábica submetido a diferentes regimes hídricos, com presença e ausência de inoculação com C. coffeicola. A) assimilação de CO₂ (A) ; B) condutância estomática (gs); C) transpiração (E). Diferença significativa entre os tratamentos foram obtidas através ± EP(p= 0,05). Os tratamentos não diferiram quando houve sobreposição dos erros entre as médias. Legenda: ● inoculado T1 ▼ não inoculado T1, ▼ inoculado T2 e ∆ não inoculadoT2.

O uso eficiente da luz (EUL) obteve diferença entre as lâminas de irrigação em função da presença do patógeno (p < 0,05). As mudas doentes exibiram maior EUL que as plantas sadias sobre lâmina de irrigação 0,6 mm.dia^-1. Entretanto com a diminuição da irrigação para 0,3 mm.dia^-1 as mudas sadias obtiveram maior valor EUL apenas na primeira avaliação. O uso eficiente da água (EUA) foi superior (p < 0,05) nos tratamentos com ausência de C. coffeicola em todas as lâminas de irrigação (Figura 3). O menor EUA nas plantas doentes foi proporcionado pela menor relação A/gs.

Figura 3
Eficiência no uso da água (A) e no uso da luz (B) em mudas de cafeeiro arábica submetido a diferentes regimes hídricos, com presença e ausência de inoculação com C. coffeicola. Diferença significativa entre tratamento foi feito a partir ± EP(p= 0,05), tratamentos não diferiram quando houve sobreposição dos erros nas médias. Legenda: ● inoculado T1 ▼ não inoculado T1, ▼ inoculado T2 e ∆ não inoculadoT2.

As mudas de café submetidas a uma menor lâmina de irrigação, apresentaram redução da taxa fotossintética devido a menor gs (⁶). Com exceção das mudas doentes irrigadas com 0,6 mm.dia^-1, que apresentaram maior taxa fotossintética nos dois tempos avaliados em relação as mudas sadias. A maior condutância estomática encontrada nas mudas doentes pode ser causada pela presença das hifas do fungo penetrarem nos estômatos na face abaxial da folha, (22), que consequentemente formam uma barreira física ao fechamento estomático. Desta forma, aumento da fotossíntese nas plantas infectadas com C. coffeicola com lâmina de irrigação de 0,6 mm.dia^-1, pode estar relacionado com o aumento difusão de CO₂, proporcionado pela maior condutância estomática produzida pela presença do patógeno (¹⁸). Resultados similares também foram encontrados em outros trabalhos com café (¹⁰) e também em outras culturas (¹), onde a infecção dos fungos aumentaram a condutância estomática e a taxa fotossintética. O aumento da difusão de CO₂ associado ao melhor uso da energia para redução do CO₂ levou ao aumento da fotossíntese nas plantas doentes.

Entretanto as plantas doentes com lâmina de irrigação 0,3 mm.dia^-1 exibiram em T1 uma menor A e maior gs e E. Desta forma, em condições moderadas de déficit hídrico a doença provoca aumento da taxa fotossintética por aumentar gs. Contudo, com menor lâmina de irrigação, a cercosporiose aumenta o estresse hídrico na planta. As plantas doentes exibiram menor potencial hídrico em decorrência de um menor uso eficiente da água.

Para comprovar a nível bioquímico que a infecção C. coffeicola, aumenta o estado de estresse na planta em função da lâmina de irrigação, foi avaliado a atividade do sistema antioxidante nas mudas de café, através da atividade SOD e CAT e APX. A atividade da SOD, CAT e APX (Figura 4A, 4B e 4C) diferiram apenas em função da presença do patógeno.

As mudas de café submetidas a 1,2 mm.dia^-1 apresentaram maior atividade da SOD na presença C. coffeicola a partir da segunda avaliação. Já a atividade da APX foi inferior no tratamento com 1,2 mm.dia^-1 com ausência do patógeno. Nas mudas de café submetidas a irrigação com 0,6 mm.dia^-1 e 0,3 mm.dia^-1 não houve diferença na atividade da SOD. A atividade da CAT foi superior nas mudas doentes submetidas as lâminas de irrigação 1,2 e 0,6 mm.dia^-1 no segundo tempo de avaliação. Na lâmina de 0,3 mm.dia^-1 não foi observado diferença na atividade de CAT entre os tratamentos.

A redução da lâmina de irrigação aplicada nas mudas de café provocou um aumento na atividade CAT e APX, indicando um aumento do estresse nas plantas com menor lâmina de irrigação. As mudas de café sob um menor regime hídrico incrementaram a atividade da SOD e CAT (⁴). Pois o aumento na atividade das enzimas é resultado da maior formação de espécies reativas de oxigênio geradas por seu metabolismo (¹⁵).

Figura 4
Atividade enzimática do sistema antioxidante foliar de cafeeiro arábica submetido a diferentes regimes hídricos, com presença e ausência de patógeno. Diferença significativa entre tratamento foi feito a partir ± EP (p= 0,05), tratamentos não diferiram quando houve sobreposição dos erros entre as médias. Legenda: ● inoculado T1 ▼ não inoculado T1, ▼ inoculado T2 e ∆ não inoculadoT2.

Neste trabalho foi verificado que as plantas doentes exibiram maior atividade da SOD e APX apenas na maior lâmina de irrigação durante o segundo tempo de avaliação. Além disso as mudas doentes com lâmina de irrigação de 0,6 mm.dia^-1, exibiram menor potencial hídrico e maior a atividade da CAT. Esses resultados demonstram que a presença do patógeno potencializa o estresse na planta (Figura 4). Andrade et al. (²) verificaram que cafeeiro infectado com duas raças de C. coffeicola elevaram a atividade da SOD e CAT ao longo do tempo. O mesmo resultado ocorreu no café infectado com Hemileia vastatrix, observando um aumento na atividade de CAT nas mudas de café (¹⁴). Portanto, a presença de cercosporiose na muda de café proporcionou o aumento atividade das enzimas SOD e APX. Contudo, não foi verificado uma correlação do aumento na atividade das enzimas um em função da presença de cercóspora nas mudas de café em detrimento da redução na lâmina de irrigação.

Nosso estudo comprovou que a presença de Cercospora coffeicola potencializou o estresse hídrico, pela planta doente apresentar maior condutância estomática em condições de baixa lâmina de irrigação que resultou no decréscimo do potencial hídrico e no menor uso eficiente da água da planta.

AGRADECIMENTO

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) pela concessão da bolsa PROCESSO 169260/2017-8. Agradecemos Joel, Odorêncio e Dartagnan pelo suporte técnico nos experimentos.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Mar 2019

Histórico

• Recebido
  28 Set 2017
• Aceito
  15 Mar 2018