Constituintes químicos da raiz e do talo da folha do açaí (Euterpe precatoria Mart., Arecaceae)

Chemical constituents from roots and leaf stalks of açaí (Euterpe precatoria Mart., Arecaceae)

Resumo

Phytochemical investigation of the hexane, ethyl acetate and methanolic extracts of roots and leaf stalks of Euterpe precatoria Mart. ("açaí"), afforded stigmast-4-en-6beta-ol-3-one (3); p-hydroxy benzoic acid (4); 3beta-O-D-glucopyranosyl-sitosterol (5); beta-sitosterol palmitate (6); mixtures of beta-sitosterol and stigmasterol (1 and 2), alpha-, beta-amirin and lupeol (7, 8 and 9), friedelin-3-one and 28-hydroxy-friedelin-3-one (10 and 11) and alpha-, beta-D-glucose (12, 13). Except for 1, 2 and 4, the other isolated constituents are described in the genus for the first time. Compounds 3 and 5 gave good results in the brine shrimp bioassay, which detects compounds with potential uses as antitumor agents, pesticides, etc..

steroids; triterpenoids; açaí

steroids; triterpenoids; açaí

ARTIGO

Constituintes químicos da raiz e do talo da folha do açaí (Euterpe precatoria Mart., Arecaceae)

Chemical constituents from roots and leaf stalks of açaí (Euterpe precatoria Mart., Arecaceae)

Ana Lúcia Queiroz de Assis Galotta^I; Maria Amélia Diamantino Boaventura^{*, II}

^IDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal do Amazonas, Av. Rodrigo Otávio Jordão Ramos, 3000, Campus Universitário, 69000-000 Manaus - AM

^IIDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627, 31270-970 Belo Horizonte - MG

ABSTRACT

Phytochemical investigation of the hexane, ethyl acetate and methanolic extracts of roots and leaf stalks of Euterpe precatoria Mart. ("açaí"), afforded stigmast-4-en-6b-ol-3-one (3); p-hydroxy benzoic acid (4); 3b-O-D-glucopyranosyl-sitosterol (5); b-sitosterol palmitate (6); mixtures of b-sitosterol and stigmasterol (1 and 2), a-, b-amirin and lupeol (7, 8 and 9), friedelin-3-one and 28-hydroxy-friedelin-3-one (10 and 11) and a-, b-D-glucose (12, 13). Except for 1, 2 and 4, the other isolated constituents are described in the genus for the first time. Compounds 3 and 5 gave good results in the brine shrimp bioassay, which detects compounds with potential uses as antitumor agents, pesticides, etc..

Keywords: steroids; triterpenoids; açaí.

INTRODUÇÃO

A família das palmeiras (Arecaceae), conhecida anteriormente como Palmae, é uma das maiores famílias vegetais do mundo e, pela forma e aspecto, é a mais característica da flora tropical¹. As palmeiras dividem-se em 6 subfamílias, que apresentam 200 gêneros e 1500 espécies^2,3.

O gênero Euterpe, que congrega cerca de 28 espécies e ocorre nas Américas Central e do Sul, está distribuído por toda bacia Amazônica. As três espécies que ocorrem com maior freqüência são oleraceae, edulis e precatoria⁴.

Euterpe precatoria, de ocorrência natural apenas no estado do Amazonas, é conhecida popularmente como açaí, açaí de terra firme, açaí solitário^5,6. Esta espécie tem alto potencial econômico, principalmente pelo seu fruto que é utilizado na preparação de sorvetes e sucos, e pelo palmito extraído de seus caules. As folhas são empregadas na cobertura de barracas provisórias e fechamento de paredes. Na etnomedicina, a raiz e o talo da folha são usados contra dores musculares e picadas de cobra e a folha, para aliviar dores no peito^6,7. A raiz também é utilizada no tratamento da malária e contra infecções hepáticas e renais^3,8. A semente fornece um óleo verde escuro, usado popularmente como antidiarréico⁸.

Estudos fitoquímicos e farmacológicos são bastante limitados neste gênero, sendo que dos frutos de E. oleraceae e E. edulis já foram isolados ácidos graxos, esteróides e antocianinas^9,10. Da raiz de E. precatoria foi descrito recentemente o isolamento do ácido p-hidroxibenzóico e da lignana, diidrodiconiferil dibenzoato, tendo esta última, apresentado uma acentuada atividade anti-malárica¹¹.

Tendo em vista que a espécie originária do estado do Amazonas possui grande importância econômica, e é muito pouco descrita na literatura, foi proposto seu estudo para o trabalho de tese de Doutorado da Profa. A. L. Q. de A. Galotta.

Este trabalho descreve os resultados parciais do estudo fitoquímico de frações obtidas a partir dos extratos hexânicos e acetato de etila da raiz e do talo da folha e do extrato metanólico da raiz de E. precatoria Mart., em que foram identificados uma substância fenólica, cinco esteróides, cinco triterpenos e dois açúcares.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros na região do infravermelho foram obtidos com uso de pastilhas de KBr a 1% em aparelho modelo Spectrun 2000 FT-IR, da Perkin Elmer. Os espectros de RMN ¹H, RMN ¹³C, DEPT 135, HMQC, HMBC e ¹H-¹H COSY foram obtidos em espectrômetros da Bruker Advance DX-200 e DRX-400. Os deslocamentos químicos foram registrados em unidade d e as constantes de acoplamento dadas em Hz. O tetrametilsilano, TMS, foi usado como referência interna e como solventes, clorofórmio, metanol, piridina e água deuterados. Os pontos de fusão foram determinados em um bloco Kofler adaptado a microscópio. Os valores, obtidos em graus centígrados, não foram corrigidos. A detecção das placas de cromatografia em camada delgada analítica de sílica foram feitas por borrifamento com reagente de Lieberman-Bouchard e vanilina/ácido sulfúrico 20%.

Material vegetal

O material botânico foi coletado no Mini Campus da Universidade Federal do Amazonas em 09/09/2000 às 9 h. A exsicata foi depositada no Herbário da mesma Instituição (nº. 7297).

Isolamento dos constituintes

A partir do pó da raiz (1,8 kg) e do talo da folha (2,7 kg), secos, por sucessivas e exaustivas extrações, foram obtidos os extratos hexânicos (1,6 e 3,3 g, respectivamente), em acetato de etila (5,6 e 13,9 g, respectivamente) e metanólicos (106,3 e 26,5 g, respectivamente). Estes extratos foram submetidos a uma coluna de sílica gel, utilizando-se hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol, em polaridades crescentes.

Misturas de b-sitosterol (1) e estigmasterol (2) foram isoladas por cromatografia em coluna de sílica gel, a partir de todos os extratos estudados, utilizando-se misturas de hexano/acetato de etila, como eluentes: extratos hexânicos da raiz (32,2 mg/1,6 g de extrato) e do talo da folha (29,3 mg/3,3 g de extrato); extratos em acetato de etila da raiz (30,3 mg/5,6 g de extrato) e do talo da folha (15,2 mg/13,9 g de extrato) e extrato metanólico da raiz (10,3 mg/5,0 g de extrato).

O estigmast-4-en-6b-ol-3-ona (3) foi isolado por cromatografia em coluna de sílica gel, a partir dos extratos hexânicos da raiz (11,9 mg/1,6 g de extrato) e do talo da folha (9,3 mg/3,3 g de extrato), utilizando-se mistura de hexano/acetato de etila 7:3, como eluentes. As frações da raiz, eluídas com hexano/acetato de etila 6:4, foram novamente fracionadas em sílica gel, obtendo-se o ácido p-hidroxibenzóico (4, 9,8 mg) e o 3b-O-b-D- glicopiranosil sitosterol (5, 35,4 mg). Estas duas substâncias foram também isoladas, por cromatografia em coluna de sílica gel, a partir do extrato em acetato de etila da raiz (4, 9,0 mg e 5, 31,5 mg/5,6 g de extrato). Do extrato em acetato de etila da raiz também foram isolados o palmitato de b-sitosterila (6, 21,3 mg/5,6 g de extrato) e uma mistura (12,3 mg) de a- e b-amirina (7 e 8) e lupeol (9).

As frações, obtidas a partir de primeira coluna do extrato em acetato de etila do talo da folha, foram submetidas a uma coluna de sílica gel empregando-se como eluentes diclorometano/acetato de etila 9:1. Deste procedimento foram isolados o palmitato de b-sitosterila (6, 12,1 mg/13,9 g de extrato) e uma mistura (36,0 mg) de friedelan-3-ona (10) e 28-hidroxi-friedelan-3-ona (11).

Parte do extrato metanólico da raiz (85,0 g) foi dissolvido em 350 mL de metanol e a esta solução foram adicionados 350 mL de clorofórmio. O filtrado (31,8 g) foi cromatografado em coluna de sílica gel. A partir das frações eluídas com acetato de etila/metanol (7:3) foi obtida uma mistura (22,7 mg) de a-D-glicose (12) e b-D-glicose (13).

Estigmast-4-en-6b-ol-3-ona (3). Sólido branco. Recristalização em acetona. P.F. 210-212 °C (lit¹² 208-210 ºC).

3b-O-b-D-glicopiranosil sitosterol (5) Sólido branco amorfo. P.F. 289-291 °C (lit.¹³ 295-300 ºC).

Palmitato de b-sitosterila (6) Sólido branco. P.F. 85-88 °C (lit.¹⁴ 85-86 ºC).

Teste de atividade citotóxica

O teste de atividade citotóxica foi realizado utilizando-se Artemia salina e foi feito de acordo com a metodologia descrita por Meyer et al.¹⁵.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir dos extratos hexânicos da raiz e do talo da folha, dos extratos em acetato de etila da raiz e do talo da folha e do extrato metanólico da raiz foram isoladas, pela utilização de técnicas cromatográficas, substâncias na forma pura ou de misturas. Com exceção do b-sitosterol (1), estigmasterol (2) e ácido p-hidroxibenzóico (4), todas as substâncias isoladas, apesar de conhecidas, estão sendo descritas pela primeira vez no gênero Euterpe. A presença de triterpenos em Arecaceae é relativamente rara; os esteróides são mais freqüentes, principalmente b-sitosterol e estigmasterol¹⁰.

A identificação estrutural dessas substâncias foi baseada na análise dos dados espectrais e pela comparação destes com dados de RMN ¹H, ¹³C e técnicas correlatas descritos na literatura.

A relação entre o b-sitosterol (1) e o estigmasterol (2) nas misturas isoladas a partir dos extratos da raiz e do talo da folha de E. precatoria foi obtida através dos espectros de RMN ¹H; as percentagens dos dois constituintes foram calculadas com base na integração dos sinais correspondentes aos hidrogênios H-6 (b-sitosterol + estigmasterol) e H-22 e H-23 do estigmasterol (Tabela 1)¹⁶. Em levantamento bibliográfico¹⁷ pode ser verificado que o b-sitosterol apresenta-se, em geral, distribuído em todas as partes das plantas e, quando isolado em mistura com o estigmasterol, está praticamente sempre em maior proporção. Em E. precatoria, esta mistura foi encontrada em todas as partes da planta estudadas até agora, mas o interessante é que se observou um aumento progressivo da proporção de estigmasterol em relação ao b-sitosterol a partir da raiz em direção ao talo. O grau de incidência de luz na bioconversão do b-sitosterol em estigmasterol poderia ser considerado, neste caso, como o fator determinante. Infelizmente, a maioria dos trabalhos obtidos da literatura não descrevem análises quantitativas sobre a proporção entre as duas substâncias, nos extratos estudados.

O espectro no Infravermelho de estigmast-4-en-6b-ol-3-ona (3) apresentou banda larga com absorção em 3400 cm^-1, característica de estiramento de grupo hidroxila. A absorção intensa centrada em 1690 cm^–1 foi atribuída à presença de grupo cetona de sistema a,b-insaturado¹². O espectro de RMN ¹H apresentou sinais múltiplos na região entre d 0,74-2,55, que foram atribuídos a hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos compatíveis com a estrutura de esteróides. Além disso, foram observados sinais relativos a um hidrogênio vinílico (d 5,81, 1H, s) e a um hidrogênio geminal a um grupo hidroxila em (d 4,35, 1H, t, J= 2,70 Hz). Análise comparativa dos espectros de RMN ¹³C e DEPT-135 foi usada para caracterizar a presença de seis grupos metila, dez metilênicos, nove metínicos e quatro carbonos quaternários. A presença do grupo carbonila a,b-insaturado foi confirmada pelos sinais de carbono em d 200,5, 126,3 e 168,6. Estes dados, bem como a confirmação do sistema metínico carbinólico pelo sinal em d 73,2, sugeriram a estrutura de um ceto-álcool.

A análise das seções expandidas dos mapas de contornos HMBC, HMQC e H-H COSY permitiu determinar a posição da carbonila em C-3, conjugado com D^(4-5) e o grupo metínico carbinólico em C-6. A determinação da configuração relativa da hidroxila em b e, conseqüentemente, a posição a equatorial para H-6 foram estabelecidas com base na ausência de sinal de octeto, no espectro de RMN ¹H, referente aos acoplamentos entre (H-6/H-7a, H-6/H-7b, (axial-axial e axial-equatorial, respectivamente) e H-6/H-4, alílico, aliadas à presença do sinal de H-6 (d 4,35, 1H, t, J= 2,7 Hz), cuja multiplicidade caracteriza o acoplamento com H-7 (d 2,01, 2H, m)¹⁸. A comparação desses dados com valores de RMN ¹H e ¹³C encontrados na literatura permitiram a identificação de 3 como estigmast-4-en-6b-ol-3-ona¹². O espectro de RMN ¹H de 5 apresentou, além de sinais referentes aos hidrogênios de sistema esteroidal entre d 0,67-2,40, sinais entre d 3,49-4,14, característicos de hidrogênios de natureza glicosídica. A atribuição da configuração b da glicose foi baseada na observação de um dupleto em d 4,61 com constante de acoplamento de 7,4 Hz, diaxial entre H-1'e H-2'. Estes dados, além de sinal em d 5,32 (relativo a hidrogênio olefínico), compatíveis com sinais observados no espectro de RMN ¹³C e DEPT-135 em d 140,7 e 121,7 estão de acordo com aqueles da literatura para o 3b-O-b-D-glicopiranosil sitosterol¹³.

O espectro no infravermelho do palmitato de b-sitosterila (6) apresentou bandas em 1712 cm^-1, compatível com estiramento de carbonila de éster, em 1585 cm^-1 relativa a estiramento C-H de sistema olefínico e em 721 cm^-1 de deformação de ligação (CH₂)n para n > 7.Os espectros de RMN ¹H, RMN ¹³C e DEPT-135 permitiram propor para 6 a estrutura do carboxilato de b-sitosterila [CH₃(CH₂)_nCOOC₂₉H ₄₉]. O comprimento da cadeia alifática de 6 foi determinado como n=14, com base na integração do espectro de RMN ¹H e RMN de ¹³C quantitativo (além de ser confirmado por dados da literatura¹⁴).

A identificação de 4 e das misturas de esteróides e triterpenos (1 e 2; 7, 8 e 9; 10 e 11) e dos açúcares 12 e 13 foi feita por análise dos espectros de RMN e por comparação desses dados com aqueles da literatura^16,19-23.

O espectro de RMN ¹³C da mistura de 3 triterpenos 7, 8 e 9 apresentou sinais relativos a carbonos olefínicos em d 124,40 e 139,57; d 121,70 e 144,50; d 109,31 e 150,96, característicos de a- e b-amirina e lupeol, respectivamente^20,22.

A análise combinada dos espectros de RMN ¹³C e DEPT135 da mistura constituída por 10 e 11 permitiu identificar a friedelan-3-ona (10) como componente principal da mistura²¹ e a 28-hidróxi-friedelan-3-ona (11) como o componente minoritário.

O ácido 4 e a mistura de açúcares 12 e 13 foram identificados através da comparação dos seus dados dos espectros de RMN ¹³C e ¹H com aqueles da literatura^19,23.

Teste de citotoxicidade sobre a Artemia salina

Um método simples, barato e eficiente de determinação de toxicidade aguda de substâncias é o ensaio sobre a Artemia salina Leach, um micro crustáceo utilizado no estágio larval, muito dependente do meio onde se encontra e, portanto, sensível a bioensaios. A técnica e sua utilização sistemática, como meio de se obterem substâncias ativas de extratos vegetais, é descrita por Meyer e colaboradores¹⁵. Extratos com DL₅₀<1000 µg/mL são apropriados para biomonitoramento utilizando-se este teste²⁴. Substâncias cuja DL₅₀ estiverem na faixa de 80 µg/mL<DL₅₀>250 µg/mL podem apresentar atividade tripanomicida, por outro lado, substâncias com toxicidade DL₅₀<145 µg/mL podem apresentar atividade anti-tumoral²⁵.

Estudo anterior da raiz de E. precatoria indicou atividade anti-malárica¹¹, nada mais tendo sido encontrado na literatura quanto a atividades biológicas detectadas na espécie. Como é usual em nossos laboratórios de fitoquímica, uma triagem foi realizada sobre os extratos obtidos, utilizando o teste de A. salina, visando a detecção de atividade citotóxica, que pode ser correlacionada com atividade anti-malárica, além de outras.

O extrato em acetato de etila do talo da folha, bem como o extrato metanólico da raiz não apresentaram atividade citotóxica (DL₅₀>1000 µg/mL). Os extratos hexânicos do talo da folha e da raiz responderam positivamente ao teste de toxicidade frente à A. salina com DL₅₀<150 µg/mL e DL₅₀<500 µg/mL, respectivamente.

A estigmast-4-en-6b-ol-3-ona (3) apresentou excelente atividade citotóxica com uma DL₅₀= 39 µg/mL, pela primeira vez, em nosso conhecimento, descrita na literatura.

O 3b-O-b-D-glicopiranosil sitosterol (5) também mostrou forte atividade citotóxica (DL₅₀= 67 µg/mL), fato já observado por Ratnayake et al.²⁶.

É interessante observar que apenas os extratos de onde se isolou a substância 3 foram ativos; com relação a 5, isolado a partir dos extratos hexânico e em acetato de etila da raiz, a grande diferença de concentração da substância nos extratos (2,21 e 0,56%, respectivamente) poderia explicar a ausência de atividade do segundo, mostrando a confiabilidade do teste.

O palmitato de b-sitosterila (6) apresentou fraca atividade, com DL₅₀= 617 µg/mL (Tabela 2).

As misturas não foram testadas, mas o b-sitosterol é inativo, de acordo com dados da literatura^27,28; a- e b-amirina apresentaram DL₅₀= 200 µg/ml²⁹ e DL₅₀= 23 µg/ml²⁸, respectivamente; o lupeol é descrito como possuindo DL₅₀ > 300²⁸ e o ácido p-hidroxibenzóico, DL₅₀= 260 µg/ml³⁰.

Apesar de as substâncias isoladas, descritas neste trabalho serem todas já conhecidas, é preciso se levar em conta que a espécie, de grande importância econômica, além de apresentar inúmeras atividades na medicina popular, foi muito pouco estudada; estas são novas informações, pois este é o primeiro relato da presença dessas substâncias na espécie. Além disso, o teste de citotoxicidade sobre A. salina mostrou resultado positivo inédito para uma substância conhecida, mas ainda não testada. Testes mais específicos (atividades anti-tumoral, anti-malárica e pesticida) serão realizados sobre 3.

Recentemente, Mors e colaboradores³¹ testaram várias substâncias naturais de diferentes classes, com histórico de neutralizar efeitos dos venenos de cobra. O teste realizado foi aquele do efeito antiletal sobre o veneno da Bothrops. Os autores observaram que substâncias amplamente difundidas no reino vegetal como o b-sitosterol, estigmasterol e 3b-glicopiranosídeo de b-sitosterila, dentre outras, apresentaram 70% de proteção contra o efeito antiletal deste veneno. A abundância de esteróides nos extratos de E. precatoria pode justificar a ação anti-ofídica atribuída à espécie na medicina popular.

AGRADECIMENTOS

À CAPES, ao CNPq e à FAPEMIG por bolsas e por suporte financeiro.

Recebido em 29/4/04; aceito em 19/11/04; publicado na web em 13/4/05

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Ago 2005
• Data do Fascículo
  Ago 2005

Histórico

• Recebido
  29 Abr 2004
• Aceito
  19 Nov 2004