Variabilidade genética entre acessos do gênero Manihot por meio de marcadores moleculares ISSR

Genetic variation among accessions of the genus Manihot by ISSR markers

GENÉTICA

Variabilidade genética entre acessos do gênero Manihot por meio de marcadores moleculares ISSR

Genetic variation among accessions of the genus Manihot by ISSR markers

Kaliny Veiga Pessoa da Silva^I; Alfredo Augusto da Cunha Alves^II; Maria Isabel Gomes Martins^III; Cláusio Antônio Ferreira de Melo^IV; Reginaldo de Carvalho^I

^IUniversidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Departamento de Biologia/Genética, Laboratório de Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA, Avenida Dom Manuel de Medeiros, s/nº, CEP 52171‑900 Recife, PE. E‑mail: [e-mail], [e-mail]

^IIEmbrapa Labex‑USA, USDA‑ARS National Center for Genetic Resources Preservation, 1111, S. Mason St., Fort Collins, CO 80526, EUA. E‑mail: [e-mail]

IIIUFRPE, Programa de Pós‑Graduação em Biotecnologia. E‑mail: [e-mail]

IVUniversidade Estadual de Santa Cruz, Programa de Pós‑Graduação em Genética e Biologia Molecular, Campus Soane Nazaré de Andrade, Km 16, Rodovia Ilhéus‑Itabuna, CEP 45662‑900 Ilhéus, BA. E‑mail: [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética intra e interespecífica de acessos de Manihot por meio de marcadores ISSR. Foram analisadas cinco espécies e duas variedades de Manihot, além de duas espécies do gênero Croton, utilizadas como grupo externo, por meio de 20 oligonucleotídeos iniciadores (Olii) ISSR UBC. Para análise do índice de similaridade entre as espécies e os acessos foram utilizados os coeficientes de Jaccard e de 'simple matching'. Os 20 Olii testados foram altamente polimórficos para todas as espécies analisadas, e 89,7% dos locus foram polimórficos. Há maior similaridade genética entre espécies diferentes de Manihot, como M. dichotoma var. undulata e M. caerulescens, do que entre indivíduos da mesma espécie, como M. dichotoma e M. dichotoma var. undulata.

Termos para indexação: germoplasma, diversidade genética, mandioca, polimorfismo.

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate the genetic diversity within and among accessions of Manihot by using ISSR markers. Five species and two varieties of Manihot, besides two species of the genus Croton, used as the out‑group, were analyzed by using 20 oligonucleotide (Olii) ISSR UBC primers. To analyze the similarity index between species and accessions, the Jaccard and simple matching coefficients were used. The 20 Olii tested were highly polymorphic in all species analyzed, and 89.7% of the loci were polymorphic. A higher genetic variability is observed among different species of Manihot, such as M. dichotoma var. undulata and M. caerulescens, than among individuals of the same species, such as M. dichotoma and M. dichotoma var. undulata.

Index terms: germplasm, genetic diversity, cassava, polymorphism.

Introdução

O gênero Manihot, originário do continente americano, abrange desde os Estados Unidos até a Argentina. São 98 espécies distribuídas em 19 seções, das quais 13 ocorrem no Brasil. A área abrangida pelo sul de Goiás e o oeste de Minas Gerais é considerada o maior centro de diversificação, seguido do sudeste do México, do Nordeste do Brasil, do sudeste do Mato Grosso e da Bolívia (Nassar, 1978, 2000). As espécies de Manihot podem ocorrer em todas as regiões tropicais e subtropicais do mundo e variam quanto ao padrão de crescimento, podendo assumir a forma de arbustos, subarbustos ou árvores (Umanah & Hartmann, 1973).

A mandioca tornou-se uma das culturas alimentares mais importantes e difundidas no mundo, já que suas raízes são valiosa fonte de carboidratos. Tanto a parte aérea como as raízes tuberosas da mandioca podem ser aproveitadas para o consumo humano ou animal, na fabricação de farinha ou como parte da composição de diversos outros produtos e subprodutos. Sua utilização é especialmente intensa em países em desenvolvimento, onde as deficiências calóricas e a subnutrição são generalizadas. A mandioca pode ser classificada como de "mesa" ou mansa, também conhecida como macaxeira ou aipim, e é comumente consumida após cozimento, e apresenta baixo teor de ácido cianídrico, até 100 ppm. Outras cultivares com taxas maiores de cianeto ou mandiocas bravas são processadas artesanal ou industrialmente na fabricação de, principalmente, farinha e féculas (Fukuda et al.,1996; Valle et al., 2004). Assim, a mandioca é consumida por mais de 600 milhões de pessoas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (El‑Sharkawy, 2006).

O gênero Manihot apresenta variabilidade genética natural, o que favorece projetos de pesquisa que visam o melhoramento genético com a mandioca cultivada (Nassar & Grattapaglia, 1986). Os marcadores moleculares são ferramentas eficazes no estudo dos genomas, pois detectam polimorfismos diretamente no DNA, não sofrem influência ambiental e são independentes do estádio de desenvolvimento da planta (Ferreira & Grattapaglia, 2008). Em geral, os marcadores moleculares são baseados na amplificação de fragmentos de DNA por reação em cadeia da polimerase (PCR) e têm sido grandemente utilizados nos programas de melhoramento de plantas. Os marcadores podem ser usados, por exemplo, no estudo da diversidade genética de populações, na avaliação do potencial dos recursos genéticos disponíveis, na construção de mapas de ligação e na detecção de locus de caracteristicas quantitativas ("quantitative traits loci", QTLs) e de suas associações com características agronômicas (Benko‑Iseppon et al., 2003).

A "inter simple sequence repeat" (ISSR) é uma técnica alternativa para estudar polimorfismos baseados em microssatélites, por meio dos genomas. O marcador molecular ISSR tem se mostrado uma poderosa ferramenta para análise da diversidade genética, bem como para a caracterização de acessos e cultivares de diversas espécies, como o cacau e espécies do gênero Solanum (Charters & Wilkinson, 2000; Isshiki et al., 2008). Por se tratar de um marcador multiloco que não requer conhecimento prévio do DNA a ser avaliado (Gupta et al., 1994), o ISSR é uma técnica de baixo custo, de fácil uso e de grande reprodutibilidade (Matthews et al., 1999). O ISSR utiliza uma sequência simples repetida como oligonucleotídeo iniciador (Olii) para amplificar um fragmento de DNA delimitado por dois microssatélites invertidos, o que gera um alto nível de polimorfismo. Bornet & Branchard (2004), ao utilizar nove Olii ISSRs, observaram diferentes níveis de polimorfismo entre Brassica e Arabidopsis, e maior abundância de sequências de microssatélites no genoma de Brassica.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade genética intra e interespecífica de acessos de Manihot por meio de marcadores ISSR.

Material e Métodos

Foram avaliadas cinco espécies e duas variedades do gênero Manihot: M. esculenta Crantz var. cruvela; M. esculenta var. mandiocaba; M. caerulescens Pohl.; M. dichotoma Ule; M. dichotoma var. undulata Allem; e M. flabellifolia Pohl.; todas provenientes da coleção de Manihot da Embrapa Mandioca e Fruticultura, Cruz das Almas, BA. Também foi avaliada uma espécie não publicada, identificada como M. noronhensis, do arquipélago de Fernando de Noronha, PE. Utilizou-se como material controle Croton fruticulosus Engelm. ex Torr. e C. rhamnifolius Willd.

Três a cinco folhas jovens, com peso entre 0,3 e 0,5 g, situadas no terço superior, foram coletadas de dois indivíduos de cada espécie para extração de DNA, conforme Doyle & Doyle (1990). As amostras foram quantificadas em gel de agarose a 0,8% e visualizadas sobre luz ultravioleta. Aliquotas de 5 ng μL^‑1 foram retiradas para posterior utilização em reações de PCR.

Vinte Olii ISSR UBC – University of British Columbia –, (Tabela 1), foram amplificados via PCR segundo o protocolo de Bornet & Branchard (2001), com algumas modificações: as reações de PCR foram conduzidas em volume final de 20 μL contendo 0,4 U de enzima Taq DNA polimerase, tampão da enzima 1x, 2,5 mmol L^‑1 de MgCl₂, 1 mmol L^‑1 de dNTP, 50 μmol L^‑1 de iniciador e 25 ng de DNA genômico. O programa consistiu de desnaturação inicial a 94ºC por 4 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 30 s, anelamento do Olii a 49,7–58ºC (dependendo do Olii) por 35 s e extensão a 72ºC por 2 min, seguida de extensão final por 7 min a 72ºC. Os produtos amplificados por PCR foram corados com Sybr Green (LGC Biotecnologia Ltda., Cotia, São Paulo), separados por eletroforese em gel de agarose a 1,2% em tampão de TAE 10X, e visualizados e fotografados sob luz ultra‑violeta.

A partir dos produtos amplificados, foi construída uma matriz binária baseada na presença e ausência de bandas características de cada iniciador para cada um dos acessos. Para análise de similaridade, utilizou-se o coeficiente de Jaccard e de "simple matching", por meio do programa NTSYS–pc 2.1 (Rohlf, 2000), e o dendrograma foi construído com base no agrupamento estatístico UPGMA. O índice PCO também foi utilizado para análise comparativa, com uso do programa FAND 1.23 (Schlüter & Harris, 2006), e as espécies foram agrupadas com base no coeficiente de Jaccard. A análise de "bootstrap" foi realizada para 1.000 repetições, com uso do programa Winboot (Yap & Nelson, 1996).

Resultados e Discussão

Os 20 oligonucleotídeos testados foram altamente polimórficos e amplificaram um total de 584 bandas (Tabela 1). O número de bandas variou de 13 a 48, nos Olii UBC 841 e UBC 810, respectivamente, que apresentaram entre 200 e 2.000 pb. O número total de locus foi 155 e variou de 3, nos Olii UBC 816 e 841, a 16, no UBC 810. Desse total, 99,3% dos lócus foram polimórficos. O menor valor polimórfico ocorreu no Olii UBC 887. No entanto, em 15 dos 155 locus, o polimorfismo ocorreu exclusivamente em função da presença do grupo externo e, consequentemente, houve homogeneidade nesses locus para as espécies de Manihot (Tabela 1). Portanto, o polimorfismo existente entre os acessos avaliados do gênero Manihot foi de 89,7%. Ao utilizar marcadores ISSR no estudo da variabilidade genética em etnovariedades de mandioca, Mühlen et al. (2000) obtiveram 97,96% de Olii polimórficos e uma média geral de 4,5 alelos por loco. Segundo Freitas et al. (2000), os resultados de estudos com marcadores obtidos para espécies cultivadas, como o trigo (similaridade média equivale a 73%), mostraram menor índice de polimorfismo e estreita relação entre domesticação e similaridade genética entre variedades.

A similaridade genética apresentada pelo coeficiente de Jaccard, para as espécies do gênero Manihot, indicou maior proximidade entre M. dichotoma var. undulata e M. caerulescens (0,5098), além de menor proximidade entre M. esculenta var. mandiocaba e M. dichotoma (0,3137) (Tabela 2). A análise de similaridade realizada por meio do coeficiente "simple matching" mostrou maior similaridade entre M. esculenta var. mandiocaba e M. esculenta var. cruvela (0,6967), enquanto a menor relação de proximidade genética foi observada entre M. noronhensis e M. dichotoma (0,5290). Nos dendrogramas gerados pelos dois coeficientes, foram formados três grupos distintos: duas espécies do grupo externo; M. caerulescens, M. dichotoma e M. dichotoma var. undulata; e M. esculenta var. mandiocaba, M. esculenta var. cruvela e M. flabellifolia (Figura 1). No entanto, M. noronhensis ficou excluída dos grupos formados, o que indica distância genética maior entre essa espécie e as demais analisadas no presente trabalho. Isso pode ser atribuído à distância geográfica existente entre essa espécie e as demais espécies do gênero, já que M. noronhensis foi introduzida na ilha de Fernando de Noronha, PE, onde pode ter adquirido diferenças adaptativas. A maior distância genética observada por Vieira et al. (2009), entre 32 variedades de mandioca, por meio de marcadores microssatélites, foi de 0,9100. Esse resultado pode ser explicado pelo maior número de variedades analisadas e pelo fato de todas elas pertencerem a uma mesma espécie.

A análise de "bootstrap" foi realizada para verificar e dar suporte estatístico aos nós internos dos dendrogramas gerados por meio do método de agrupamento UPGMA. O dendrograma gerado a partir dos dados de similaridade de Jaccard (Figura 1) apresentou valores de "bootstrap" baixos (33,3, 40,7, 42,3 e 47,5%). No entanto, a similaridade de 83,4%, para M. esculenta var. mandiocaba e M. esculenta var. cruvela, dá maior suporte estatístico para a relação genética existente entre as espécies. Os valores de "bootstrap" obtidos no dendrograma gerado por meio do coeficiente de similaridade "simple matching" também foram baixos (34,6, 41,6 e 47,3%). Contudo, valores de similaridade maiores que 80,9, 86,8 e 98% também foram observados; este último para o nó entre as espécies de Croton. Assim, a análise de "bootstrap" observada entre os dois dendrogramas indica maior suporte estatístico para a árvore gerada por meio do cálculo do coeficiente de "simple matching" e do agrupamento UPGMA.

Ao se observar os dois coeficientes, a distância genética existente entre as variedades de M. esculenta e os dois acessos de M. dichotoma fica clara. As duas variedades de M. esculenta, cruvela e mandiocaba, aparecem muito próximas, por pertencerem à mesma espécie. Como estão agrupadas com M. flabellifolia, vários autores apontam essa espécie como provável ancestral da mandioca cultivada, com base no uso de marcadores moleculares (Olsen & Schaal, 2001; Olsen, 2004). Outro fato que chamou a atenção foi a similaridade existente entre M. dichotoma var. undulata e M. caerulescens, que foi maior do que a similaridade entre M. dichotoma e M. dichotoma var. undulata, identificadas como sendo da mesma espécie, mas que apresentam diferenças botânicas marcantes quanto ao formato e ao tamanho dos frutos, das folhas, da quantidade de látex e do porte da planta. M. dichotoma var. undulata e M. caerulescens apresentam maior semelhança morfológica.

Com base no coeficiente de Jaccard, também foi gerado o gráfico de distribuição em coordenadas principais (PCO), (Figura 2). Neste gráfico, assim como nos dois dendrogramas gerados, os acessos de M. esculenta, cruvela e mandiocaba, aparecem muito próximos, e houve proximidade entre M. dichotoma var. undulata e M. caerulescens. Entretanto, observou-se que as duas espécies do grupo externo são distantes entre si, com C. fruticulosus acima do eixo Z e C. rhamnifolius abaixo, com apenas 0,1639 de similaridade genética. M. caerulescens, M. dichotoma, M. dichotoma var. undulata e M. flabellifolia estão dispostas no mesmo bloco, enquanto as variedades mandiocaba e cruvela estão agrupadas em outro bloco, sustentadas por um coeficiente de similaridade de Jaccard de 0,5.

Marcadores ISSR têm sido amplamente utilizados para detectar polimorfismos intraespecíficos em diversas espécies cultivadas, incluindo as do gênero Citrus e outras culturas, como amendoim e arroz (Pharmawati et al., 2004). Blair et al. (1999) obtiveram, em arroz, maior percentagem de fragmentos polimórficos com marcadores ISSR, em comparação a marcadores AFLP. Apesar de serem marcadores dominantes, os ISSR podem ser utilizados para analisar locus múltiplos em uma única reação (Goulão & Oliveira, 2001) e para produzir fragmentos com grande reprodutibilidade, em comparação a outros marcadores com base em PCR não específico, como RAPD (Wolfe & Liston, 1998). Para o gênero Manihot, a alta reprodutibilidade dos marcadores ISSR revelou claras divergências genéticas entre as espécies avaliadas no presente trabalho, tendo-se observado polimorfismo genético entre as variedades cultivadas e as demais espécies.

A utilização de dois coeficientes estatísticos, Jaccard e "simple matching", para avaliar o nível de similaridade genética, permitiu a comparação entre resultados e, consequentemente, aumentou sua confiabilidade, o que indica que tanto os dendrogramas, quanto o gráfico PCO, seguiram a mesma linha no padrão de polimorfismo e que, embora a maioria dos trabalhos não utilize o "simple matching" para análise de dados binários, esse coeficiente, para Manihot, mostrou-se satisfatório.

Conclusões

1. Há divergências genéticas intra e interespecíficas entre os acessos de espécies de Manihot avaliadas, o que identifica, como eficiente, o marcador molecular ISSR.

2. Há maior similaridade genética entre diferentes espécies de Manihot, como M. dichotoma var. undulata e M. caerulescens, do que entre indivíduos da mesma espécie, como M. dichotoma e M. dichotoma var. undulata.

Agradecimentos

À Embrapa, pelo apoio financeiro; e à Universidade Federal Rural de Pernambuco, pela disponibilização da estrutura laboratorial.

Recebido em 14 de junho de 2011 e aprovado em 26 de agosto de 2011

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Dez 2011
• Data do Fascículo
  Set 2011

Histórico

• Recebido
  14 Jun 2011
• Aceito
  26 Ago 2011