Um método analítico empregando cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência para a determinação simultânea de abamectin e ivermectin em leite bovino foi desenvolvido e validado. Os melhores resultados de recuperação foram obtidos empregando acetonitrila na extração dos compostos, com purificação do extrato por extração em fase sólida em cartuchos contendo C18. A derivação pré-coluna foi realizada com N-metilimidazol e anidrido trifluoracético. Os limites de detecção (LOD) do método para abamectin e ivermectin foram 0,10 e 0,14 µg L-1 e os limites de quantificação (LOQ) foram 0,18 e 0,36 µg L-1, respectivamente. As recuperações foram de 75 a 101%, com valores de RSD abaixo de 10%. Os valores de LOD e LOQ obtidos são inferiores aos limites máximos de resíduos em leite estabelecidos pelo Codex Alimentarius, União Européia e legislação brasileira.