Purificação parcial de um inibidor de tripsina/papaína de sementes de <i>Hymenaea courbaril</i> L. e atividade antibacteriana de suas frações proteicas

Brito, Mônica Silva de; Melo, Mônica Brandão; Alves, Jamille Perdigão de Andrade; Fontenelle, Raquel Oliveira dos Santos; Mata, Marlene Feliciano; Andrade, Lúcia Betânia da Silva

doi:10.1590/2236-8906-23/2015

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ARTICLES • Hoehnea 43 (1) • Jan-Mar 2016 • https://doi.org/10.1590/2236-8906-23/2015 copiar

Purificação parcial de um inibidor de tripsina/papaína de sementes de Hymenaea courbaril L. e atividade antibacteriana de suas frações proteicas

Autoria SCIMAGO INSTITUTIONS RANKINGS

RESUMO

O extrato bruto e frações proteicas de sementes de Hymenaea courbaril foram investigados para a presença de inibidores de tripsina e papaína e atividade antimicrobiana contra Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus e Escherichia coli. As frações foram obtidas após precipitação do extrato bruto com sulfato de amônio em três faixas de saturação (0-30%, 30-60% e 60-90%) e denominadas Hc030, Hc3060 e Hc6090, respectivamente. O extrato bruto e as frações apresentaram diferente especificidade em inibir a atividade da tripsina e papaína. A atividade antimicrobiana foi observada nas frações Hc030 e Hc3060 e somente contra V. parahaemolyticus. O inibidor isolado a partir de Hc3060 foi mais eficiente na inibição da tripsina (100% de inibição) do que da papaína (54% de inibição), e mostrou uma massa molecular aparente de 20 kDa. Este estudo mostra que as sementes de H. courbaril possuem inibidores de proteases e proteínas com atividade antibacteriana, indicando que a espécie é uma fonte de compostos bioativos.

Palavras-chave:
antimicrobiano; cistatina; Fabaceae; protease

Autoria

Mônica Silva de Brito

Universidade Estadual Vale do Acaraú, Centro de Ciências Agrárias e Biológicas, Laboratório de Microbiologia, Av. da Universidade, 850, Bairro Betânia, 62040-370 Sobral, CE, BrasilUniversidade Estadual Vale do AcaraúBrazilSobral, CE, BrazilUniversidade Estadual Vale do Acaraú, Centro de Ciências Agrárias e Biológicas, Laboratório de Microbiologia, Av. da Universidade, 850, Bairro Betânia, 62040-370 Sobral, CE, Brasil

Mônica Brandão Melo

Universidade Estadual Vale do Acaraú, Centro de Ciências Agrárias e Biológicas, Herbário Prof. Francisco José de Abreu Matos, Av. da Universidade, 850, Bairro Betânia, 62040-370 Sobral, CE, BrasilUniversidade Estadual Vale do AcaraúBrazilSobral, CE, BrazilUniversidade Estadual Vale do Acaraú, Centro de Ciências Agrárias e Biológicas, Herbário Prof. Francisco José de Abreu Matos, Av. da Universidade, 850, Bairro Betânia, 62040-370 Sobral, CE, Brasil

Jamille Perdigão de Andrade Alves

Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle

Marlene Feliciano Mata

Universidade Estadual Vale do Acaraú, Centro de Ciências Agrárias e Biológicas, Laboratório de Biologia Experimental, Av. da Universidade, 850, Bairro Betânia, 62040-370 Sobral, CE, BrasilUniversidade Estadual Vale do AcaraúBrazilSobral, CE, BrazilUniversidade Estadual Vale do Acaraú, Centro de Ciências Agrárias e Biológicas, Laboratório de Biologia Experimental, Av. da Universidade, 850, Bairro Betânia, 62040-370 Sobral, CE, Brasil

Lúcia Betânia da Silva Andrade ⁴4 Corresponding author:lubetania@yahoo.com.br

4 Corresponding author:lubetania@yahoo.com.br

SCIMAGO INSTITUTIONS RANKINGS

Figuras

Figuras (3)

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Figure 1
Papain and trypsin inhibitory activity (specific activity = IU*/mg protein) in crude extracts (EHc) and protein fractions of H. courbaril seeds. Hc030, Hc3060, and Hc6090 represent the fractions obtained by precipitation with ammonium sulfate at respective saturation ranges of: 0-30%, 30-60% and 60-90%. *One unit of inhibitory activity (IU) was defi ned as the amount of inhibitor that decreased absorbance by 0.01, under assay conditions.

Papain,

Trypsin.

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Figure 2
SDS-PAGE of the crude extract (EHc) and Hc030 (1), Hc3060 (2), and Hc6090 (3) fractions of H. courbaril seeds. The gel concentration was 3.5% and the running gel concentration was 12.5%. In each well, 40 µg protein was applied. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R 250. M: Molecular weight markers (LMW-SDS, GE Healthcare).

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Figure 3
Elution profi le in a trypsin–Sepharose affi nity column of P1 from the Hc3060 fraction of H. courbaril seeds. The column was equilibrated with 50 mM Tris-HCl pH 7.5. The retained peak (ITHc) was eluted with 1 mM HCl. The protein concentration was monitored at 280 nm (-) and the fractions were assayed against trypsin (--●--) and papain (^...■^...). Figure 3 inset: 12.5% SDS-PAGE. (ITHc) trypsin/papain inhibitor, (M) Molecular weight markers. The protein band was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250.

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Papain,

Trypsin.

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Figure 1 Papain and trypsin inhibitory activity (specific activity = IU/mg protein) in crude extracts (EHc) and protein fractions of H. courbaril* seeds. Hc030, Hc3060, and Hc6090 represent the fractions obtained by precipitation with ammonium sulfate at respective saturation ranges of: 0-30%, 30-60% and 60-90%. *One unit of inhibitory activity (IU) was defi ned as the amount of inhibitor that decreased absorbance by 0.01, under assay conditions. Papain,Trypsin.

Figure 2 SDS-PAGE of the crude extract (EHc) and Hc030 (1), Hc3060 (2), and Hc6090 (3) fractions of H. courbaril seeds. The gel concentration was 3.5% and the running gel concentration was 12.5%. In each well, 40 µg protein was applied. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R 250. M: Molecular weight markers (LMW-SDS, GE Healthcare).

Figure 3 Elution profi le in a trypsin–Sepharose affi nity column of P1 from the Hc3060 fraction of H. courbaril seeds. The column was equilibrated with 50 mM Tris-HCl pH 7.5. The retained peak (ITHc) was eluted with 1 mM HCl. The protein concentration was monitored at 280 nm (-) and the fractions were assayed against trypsin (--●--) and papain (^...■^...). Figure 3 inset: 12.5% SDS-PAGE. (ITHc) trypsin/papain inhibitor, (M) Molecular weight markers. The protein band was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250.

Figure 1 Papain and trypsin inhibitory activity (specific activity = IU/mg protein) in crude extracts (EHc) and protein fractions of H. courbaril* seeds. Hc030, Hc3060, and Hc6090 represent the fractions obtained by precipitation with ammonium sulfate at respective saturation ranges of: 0-30%, 30-60% and 60-90%. *One unit of inhibitory activity (IU) was defi ned as the amount of inhibitor that decreased absorbance by 0.01, under assay conditions. Papain,Trypsin.

Figure 2 SDS-PAGE of the crude extract (EHc) and Hc030 (1), Hc3060 (2), and Hc6090 (3) fractions of H. courbaril seeds. The gel concentration was 3.5% and the running gel concentration was 12.5%. In each well, 40 µg protein was applied. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R 250. M: Molecular weight markers (LMW-SDS, GE Healthcare).

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