Caracterização de acessos de pimenta-do-reino com base em sistemas enzimáticos

Characterization of black pepper accessions using isozymes

PESQUISA

Caracterização de acessos de pimenta-do-reino com base em sistemas enzimáticos

Characterization of black pepper accessions using isozymes

José MD Gaia^I; Milton GC Mota^I; Maria Tereza VC Derbyshire^II; Viseldo R Oliveira^II; Maria R Costa^III; Carlos da S Martins^III; Marli C Poltronieri^III

^IUniversidade Federal Rural da Amazônia, C. Postal 917, 66077-530 Belém-PA

^IICentro de Energia Nuclear na Agricultura, C. Postal 96, 13400-970 Piracicaba-SP

^IIIEmbrapa Amazônia Oriental, C. Postal 48, 66095-100 Belém-PA; [e-mail]

RESUMO

Setenta e oito acessos de pimenta-do-reino, incluindo algumas espécies silvestres foram submetidos à análise eletroforética de isoenzimas em gel de poliacrilamida, visando distinguir diferenças fenotípicas que auxiliem na discriminação e seleção dos acessos. Foram utilizados os sistemas enzimáticos SKDH, GOT, ACP, ACO, PGI, FUM, 6PGDH e G6PDH. O polimorfismo de isoenzimas foi avaliado pelo número de alozimas com diferentes mobilidades por sistema enzimático, pelas freqüências de alozimas dentro de cada sistema enzimático em relação ao total de bandas do sistema e pela análise da similaridade genética, com base na ausência e presença de bandas. Todos os sistemas enzimáticos utilizados tiveram boa resolução e definição de bandas, com ênfase para SKDH, 6PGDH, PGI e ACP. Em sua totalidade, os sistemas apresentaram polimorfismo capaz de caracterizar e identificar acessos ou grupos de pequeno número de acessos, sendo que o sistema GOT foi o que apresentou maior variabilidade de alozimas e de perfis; e o que apresentou menor variabilidade foi o sistema FUM, com três alozimas e quatro perfis. Cinqüenta e sete por cento das alozimas podem ser usadas para caracterizar e identificar clones ou grupos de clones. Cerca de 64% dos acessos analisados podem ser identificados por um a seis fenótipos individuais de sistemas enzimáticos. A análise da similaridade indicou os grupos G1, G2 e G3 como os mais divergentes da coleção, os quais são indicados para cruzamentos intraespecíficos e interespecíficos visando a obtenção de clones superiores.

Palavras-chave:Piper nigrum L., eletroforese, isoenzimas, polimorfismo, germoplasma.

ABSTRACT

Seventy and eight accessions of black pepper, including some wild species, were analyzed through isozyme electrophoresis in polyacrylamide gel, aiming to distinguish phenotypic differences to discriminate and select accessions. The enzymatic systems SKDH, GOT, ACO, ACP, PGI, FUM, 6PGDH and G6PDH were studied. The polymorphism of isozymes was evaluated based on number of alozymes with different mobility for each enzymatic system, the frequencies of alozymes within each enzymatic system in relation to the total of bands of the system and, the analysis of the genetic similarity, based on the absence or presence of bands. All the enzymatic systems presented good resolution and definition of bands, with emphasis on SKDH, 6GPDH, PGI and the ACP. All the systems presented sufficient polymorphism to characterize and to identify accessions or groups with little number of accessions, where the GOT system presented better variability of alozymes. On the other hand, FUM system revealed only three alozymes and four profiles. Fifty seven percent of alozymes are efficient to characterize and to identify clones or groups of clones. About sixty four percent of the analyzed accessions can be identified per one to six individual phenotypes of enzymatic systems. The analysis of similarity indicated the G1, G2 and G3 groups as the most divergent, being appropriate for intra or interspecific crossings aiming to obtain superior clones.

Keywords:Piper nigrum L., electrophoresis, isozymes, polymorphism, germplasm.

A pimenta-do-reino é uma espécie perene da família das piperáceas, introduzida no estado do Pará por imigrantes japoneses. Originária da Índia, sua importância maior está no fato de possuir elevados teores de alcalóides em seus frutos, que lhe conferem a pungência característica, sendo por isso, quando secos, utilizados como condimento alimentar.

Um dos principais problemas da cultura da pimenta-do-reino é a homogeneidade dos clones cultivados associada à suscetibilidade a doenças e a dificuldade de se encontrar variedades resistentes devido à reduzida base genética da espécie (Pillay, 1995).

Os clones cultivados são afetados por diversas doenças causadas por fungos, nematóides e vírus. As maiores perdas são causadas pela podridão das raízes e murchamento dos ramos, causado pelo fungo Nectria haematococca Berck & Br. F. sp. piperis Albuq. (Fusarium solani f. sp. piperis). Este fungo tem causado sérios prejuízos à pipericultura no estado do Pará, pois todos os clones cultivados são suscetíveis. O controle é possível com a utilização de porta-enxertos de outras piperáceas resistentes à fusariose, tais como P. aduncum L., P. hispidinervium C. DC., P. colubrinum Link. (Duarte & Albuquerque, 1999; Duarte et al., 1999). Some-se a isto o fato de que, um novo agente etiológico foi observado em alguns municípios do estado do Pará, causando murchamento dos ramos, identificado como Fusarium oxysporum Schlecht. (Duarte et al., 1999).

Uma opção viável para evitar maior erosão genética na espécie é a quantificação da variabilidade genética do germoplasma visando identificar genótipos que permitam obter recombinantes por meio de intercruzamentos. Para tanto, a análise do polimorfismo de isoenzimas é uma ferramenta que possibilita verificar a variação genética em nível de proteínas, com a vantagem de possuir herança codominante, permitindo, assim, a identificação de heterozigotos, além de ser uma técnica molecular de baixo custo. Os caracteres morfoagronômicos, ao contrário, possuem a expressão condicionada por alelos recessivos, os quais podem ser deletérios em homozigose, além do que a quantidade de marcadores pode ser reduzida consideravelmente em função da existência de efeitos epistáticos, pleiotrópicos ou ambos (Barros, 1991).

Martins et al. (1996) detectaram, inicialmente, pelo método de eletroforese em gel de amido diferenças genéticas (polimorfismo) entre acessos de pimenta-do-reino do banco de germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental por meio de análise de isoenzimas dos sistemas MDH, SKDH, 6PGDH, IDH, PGI e ME. Gaia (1999), posteriormente, pelo método de eletroforese em gel de poliacrilamida, observou polimorfismo em SKDH, GOT, ACP, ACO, PGI, 6PGDH, G6PDH e FUM, sendo que o método em gel de poliacrilamida mostrou-se mais eficiente na análise de isoenzimas em pimenta-do-reino.

Gaia et al. (2005), em estudos sobre a genética de pimenta-do-reino envolvendo parâmetros de diversidade e similaridade baseados em locos de isoenzimas, encontraram variabilidade correlata com a estreita base genética da espécie.

O atual programa de melhoramento da Embrapa Amazônia Oriental prevê, para 15 anos, obter novas cultivares de pimenta-do-reino com métodos de hibridação intraespecífica e interespecífica para resistência ou tolerância à fusariose associada a caracteres que contribuam para aumentar a produtividade e para maior facilidade no manejo em campo (Poltronieri et al., 1999).

O objetivo deste trabalho foi gerar conhecimentos sobre a variabilidade genética intraespecífica e interespecífica da pimenta-do-reino e caracterizar acessos por meio de polimorfismo de isoenzimas, para melhor identificação e seleção dos acessos para uso em programas de melhoramento que visem a obtenção de cultivares produtivas e resistentes às principais doenças da pimenta-do-reino.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 78 acessos de pimenta-do-reino, incluindo algumas espécies silvestres, da coleção de germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental (CPATU), em Belém, sob condições de sombreamento. Cerca de 63% dos acessos são originários da Índia, 27% foram obtidos em programas de melhoramento do CPATU e os 10% restantes são originários da Malásia, Indonésia, Tailândia e Brasil (Tabela 1).

Utilizou-se eletroforese em gel de poliacrilamida com 30% (p/v) de acrilamida e 0,8% (p/v) de bis-acrilamida no gel separador; e 7,5% (p/v) de acrilamida e 1,25% (p/v) de bis-acrilamida no gel concentrador. Os procedimentos utilizados para coleta de tecido vegetal, extração de proteínas, eletroforese e revelação das enzimas foram os adotados por Tsumura et al. (1990), com as seguintes adaptações para pimenta-do-reino: (1) utilizou-se 50 mg de tecido foliar jovem para a maceração sob nitrogênio líquido e cerca de 75 mg de polivinilpolipirrolidona (PVPP) foram adicionados a 1 mL do tampão de extração; (2) a eletroforese foi realizada sob condições de 16 mA durante cerca de cinco horas; (3) as soluções corantes fosfoglucoisomerase (PGI) e fosfatase ácida (ACP) foram modificadas para 50 mL de Tris-HCl, 50 mM, pH 8,0; 1 mL de D-frutose-6-fosfato (20 mg/mL); 1 mL de NADP (6,6 mg/mL) 2 mL de MTT (5 mg/mL); 1 mL de PMS (5mg/mL), 1 mL de cloreto de magnésio (10,17 g/100 mL) e 10 unidades de G6PDH (PGI); 50 mL de " ACP buffer" (1,6 g de acetato de sódio tri-hidratado, 4,83 mL de ácido glacial acético e 500 mL de água destilada); 100 mg de a-naftil fosfato, sal dissódico e 12 mg de " Fast garnet GBC salt" (ACP).

Foram avaliados oito sistemas enzimáticos: fosfoglucoisomerase (PGI, 5.3.1.9), fosfatase ácida (ACP, 3.1.3.2), aconitase (ACO, 4.2.1.3), 6-fosfogluconato desidrogenase (6PGDH, 1.1.1.44), fumarase (FUM, 4.2.1.2), glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH, 1.1.1.49), glutamato oxaloacetato transminase (GOT, 2.6.1.1) e xiquimato desidrogenase (SKDH, 1.1.1.25). Os padrões das alozimas (bandas) foram expressos em zimogramas, convertidos em um esquema simplificado alfa-numérico. O sentido de migração e denominação das alozimas foram baseados no método de Neale et al. (1984), pelo qual as alozimas de maior migração recebem os menores números. O grau de polimorfismo da coleção foi avaliado pelo número de alozimas com diferentes mobilidades relativas por sistema enzimático, pelas freqüências das alozimas com a mesma mobilidade relativa em relação ao total de bandas por sistema enzimático, pelo número de fenótipos eletroforéticos por sistema e pelos níveis de similaridade genética estimados pela média de grupo utilizando o coeficiente de semelhança simples (" simple matching'') como índice de similaridade. A análise de agrupamento foi realizada pela utilização do programa Fitopac (Shepherd, 2001). A análise da similaridade foi baseada num sistema binário de ausência (0) e presença (1) de bandas, considerando-se somente as bandas bem definidas após a revelação do gel.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De modo geral, os oito sistemas enzimáticos utilizados mostraram boa resolução e definição dos perfis bioquímicos e elevado polimorfismo. No sistema GOT foram observadas 18 alozimas com diferentes migrações, sendo o sistema que apresentou maior variabilidade de bandas, seguido pelos sistemas ACP e PGI, ambos com 13 alozimas diferentes; e ACO, com 12. O sistema 6PGDH teve 11 alozimas diferentes. Os sistemas que apresentaram menor grau de polimorfismo foram G6PDH, com seis, SKDH, com quatro e FUM, com três. Considerando todos os sistemas, totalizaram 80 alozimas diferentes. Todos os sistemas podem ser, portanto, utilizados para caracterização de pimenta-do-reino (Tabela 2).

Lopes et al. (2003) caracterizaram oito acessos de erva-de-bicho, também conhecida como pimenta-d'água (Polygonum punctatum Ell.) por meio dos padrões de variação de bandas observados em oito sistemas enzimáticos, verificando elevado nível de polimorfismo. Apesar disto, a análise de agrupamento revelou alto grau de proximidade genética entre os acessos, sendo que o autor atribuiu o polimorfismo observado à pressão de seleção em favor de determinados produtos gênicos.

Onus & Pickersgill (2000), analisando isoenzimas de acessos de Capsicum baccatum, C. eximium, C. cardenasii e dois híbridos interespecificos (C. baccatum X C. eximium e C. baccatum X C. cardenasii), observaram que C. baccatum pode ser identificado por padrões de isoenzimas dos sistemas ACO, GOT, PGI e SKDH, embora não tenha sido possível distinguir C. eximium de C. cardenasii, podendo ser discriminados por meio de descritores morfológicos.

No sistema SKDH foi observada uma zona de atividade enzimática com estrutura monomérica correspondendo, provavelmente, a um loco controlado por quatro alelos. No sistema ACP foi detectada uma zona de atividade enzimática, que se referem, possivelmente, a um loco controlado por três alelos, localizado entre as alozimas ACP2 e ACP7. No sistema GOT foram visualizadas duas zonas de atividade enzimática correspondendo, provavelmente, a dois locos gênicos. A primeira zona, da alozima GOT2 à GOT7, é provavelmente condicionada por quatro alelos e a segunda zona, da alozima GOT8 à GOT13, possivelmente por três, sendo que ambos os locos codificaram alozimas com estrutura dimérica.

O sistema Fumarase evidenciou uma zona de atividade constituída por três alozimas com estrutura quaternária monomérica, codificada, provavelmente, por três alelos. No sistema ACO foi observada uma zona de atividade enzimática localizada entre as alozimas ACO4 e ACO7, com perspectiva de controle por quatro alelos codificando alozimas com estrutura monomérica. Em 6PGDH, houve a possibilidade de apresentar-se constituído por um loco com dois alelos e estrutura dimérica e dois locos com três alelos e estrutura monomérica.

No sistema G6PDH possivelmente houve a expressão de dois locos gênicos, sendo que o primeiro pode estar evidenciando duas formas alélicas em indivíduos homozigotos. A primeira, ocorreu em cerca de 90% dos acessos, e a segunda, em cerca de 3% dos acessos. Os sete por cento restantes podem estar apresentando alelos nulos para este loco. Acredita-se que o segundo loco tenha revelado duas formas alélicas codificando alozimas com estrutura dimérica. No sistema PGI foi observada uma zona localizada entre as alozimas PGI1 e PGI3, na qual não foi detectado bandeamento em 38 acessos, o que pode ser devido à ocorrência de alelos nulos. Uma outra zona, localizada entre as alozimas PGI4 e PGI13, é pretensamente constituída por três locos e seis alelos, denotando herança monomérica. Gaia et al. (2005) relataram que, embora comumente se observe estrutura dimérica em plantas no sistema PGI, modificações na herança de isoenzimas podem ser atribuídas à perda da banda heterodimérica no transcorrer do processo evolutivo ou às características específicas relacionadas à diploidização de poliplóides, como é o caso de pimenta-do-reino.

Schuelter et al. (1999), analisando o polimorfismo da malato desidrogenase (MDH) em pimenta-silvestre (capsicum flexuosum Sendt.), descreveram a ocorrência de sete perfis eletroforéticos, sendo que cinco locos gênicos foram possíveis detectar, dos quais um monomórfico e quatro polimórficos. Dentre os locos polimórficos, um revelou estrutura quaternária monomérica, outro com estrutura dimérica; porém para um quarto loco, não foi possível definir a estrutura quaternária, sendo provável que mais de um gene estejam controlando a expressão deste loco.

Quatorze alozimas (GOT1, GOT16, GOT18, PGI6, PGI12, PGI13, ACP1, ACP4, ACO1, ACO3, ACO8, ACO10, ACO11 e 6PGDH10) expressaram em apenas um genótipo. Nove destas ocorreram em acessos das outras espécies de Piper incluídas na análise e cinco, em acessos de pimenta-do-reino. As alozimas GOT1, ACP1 e ACO3 ocorreram somente no acesso de P. columbrinum Link (C27); de forma análoga, PGI12, PGI13, ACO8 e ACO11 foram evidenciadas somente no acesso de P. betle (C24); a alozima GOT18 foi observada no acesso de P. atenuattum-F (C30); e PGI6 foi percebida somente no acesso P. atenuattum-M3 (C10).

As alozimas detectadas somente em acessos de pimenta-do-reino foram: GOT16, no acesso Kottanadan-1 (C26); 6PGDH10, no acesso Chumala-S (C37); ACO1, em Balankotta Jones (C73); ACO10 em Karimunda-2 (C25); e ACP4 em X26 (C50). O clone X26 é resultante de cruzamentos intraespecíficos, sendo que a banda ACP4 pode ter sido resultante de uma mutação de ponto do alelo codificante da alozima ACP5, pois houve uma pequena diferença na sua mobilidade no gel. George et al. (2005) relataram que bandas não parentais presentes em algumas progênies de pimenta-do-reino podem ser resultado de mutação ou perda de segmentos cromossômicos durante a meiose (crossing-over), por isso são observados em indivíduos mutantes ou recombinantes, mas não nos genitores.

Quarenta e seis tipos de alozimas representaram 57,5% de um total de 80 tipos e foram observados em acessos que variaram de um a oito, sendo 12 no sistema GOT (GOT1, GOT3, GOT6, GOT7, GOT9, GOT10, GOT12, GOT14, GOT15 a GOT18); oito nos sistemas ACP (ACP1, ACP4 e as alozimas de ACP8 a ACP13) e ACO (ACO1, ACO2, ACO3, ACO7, ACO8, ACO10, AC011 e AC012); sete no sistema PGI (PGI2, PGI3, PGI4, PGI6, PGI9, PGI12 e PGI13); duas nos sistemas G6PDH (G6PDH2 e G6PDH3) e FUM (FUM2 e FUM3); cinco no sistema 6PGDH (6PGDH1, 6PGDH2, 6PGDH4, 6PGDH8 e 6PGDH10); e uma no sistema SKDH (SKDH4). Estas alozimas, por possuírem baixa freqüência de variação, podem ser utilizadas para identificar acessos ou grupos com pequeno número de genótipos.

As freqüências das alozimas observadas variaram de 0,004 (6PGDH10) a 0,855 (FUM1). Yamada & Guries (1994) observaram menor freqüência (0,17) para uma alozima de diaforase (DIA) e maior freqüência de 0,85 em uma alozima de IDH em clones de cacau. Volis et al. (2002), examinando freqüências de alozimas em populações de aveia silvestre (Hordeum spontaneum Koch.), verificaram a menor freqüência de variação para EST3, no valor de 0,49 e a maior freqüência para PGI1 e PGI2, no valor de 0,99.

A Figura 1 revelou que os 78 acessos de pimenta-do-reino puderam ser divididos em 12 grupos, com uma faixa de similaridade genética variando de 65% a 100%, sendo que os grupos mais divergentes foram G1, G2 e G3, constituídos por acessos de pimenta-do-reino e de outras piperáceas. Tais acessos são os mais recomendados para hibridação intraespecífica e interespecífica para o programa de melhoramento da espécie, visando à obtenção de cultivares superiores.

A partir do grupo G4, os grupos se tornam mais próximos, apresentando, entre si, diferenças de similaridade menores que aquelas observadas nos três primeiros grupos, constituindo 84% dos acessos presentes numa faixa de similaridade variando de 80% a 100%, reforçando a proposição de que a base genética da espécie é reduzida e a de que os clones cultivados possuem elevada homogeneidade. Os clones mais cultivados no estado do Pará (Cingapura:C02, Guajarina:C11 e Bragantina:C38) detiveram níveis de similaridade acima de 90%; estes resultados também foram encontrados por Gaia et al. (2003), em estudo preliminar sobre a diversidade genética do germoplasma de pimenta-do-reino do CPATU e também confirmados pela análise da diversidade genética da espécie por meio de parâmetros genéticos de polimorfismo (Gaia et al., 2005). Gaia et al. (2004) realizaram um estudo comparativo de agrupamentos gerados pelo coeficiente de semelhança simples e pelo índice de Jaccard e observaram que bandas ausentes em um par de unidades taxonômicas (não consideradas no índice de Jaccard, mas consideradas no coeficiente de semelhança simples) não tiveram muita influência sobre os agrupamentos formados, havendo pouca diferença entre eles, podendo-se considerar os grupos estáveis, sendo que um ou outro pode ser utilizado para seleção dos acessos visando a obtenção de clones superiores.

No sistema SKDH foram identificadas quatro alozimas constituindo oito perfis eletroforéticos. Algumas alozimas destacaram-se por serem de maior intensidade do que as outras, mas não pareceu tratar-se de sobreposição de alozimas (bandas muito próximas). O perfil um, apresentando somente a alozima SKDH1, foi constatado apenas no acesso Mangueira (C59). A forma alozimática SKDH4 foi observada somente nos acessos de P. columbrinum Link (C27), P. betle (C24) e nos acessos S-1 (C22) e G-1 (C23) (perfil sete). O perfil quatro e o perfil seis, detectados, respectivamente, nos acessos P. atenuattum-M3 (C10) e P. atenuattum-F (C30) (uma espécie silvestre de Piper), apresentaram pequena diferença na mobilidade das bandas que os compõem, em relação às bandas dos acessos de pimenta-do-reino, o que poderia ser atribuído ao fato de constituírem acessos de espécies diferentes; no entanto a alozima SKDH3 foi observada nos acessos de pimenta-do-reino (P. nigrum L.) e no acesso de P. colubrinum Link. que, apesar de constituírem espécies distintas, apresentaram a mesma mobilidade no gel. Alozimas de SKDH também foram utilizadas para descriminar acessos de diferentes espécies do gênero Capsicum por Onus & Pickersgill (2000).

No sistema ACP detectaram-se 13 alozimas constituindo 11 perfis eletroforéticos, que evidenciaram uma zona principal de atividade enzimática localizada entre as alozimas ACP2 e ACP7. Outras duas zonas de atividade (uma anterior e outra posterior à zona principal) foram detectadas, sendo que a anterior, correspondente à alozima ACP1, pertencente à espécie P. columbrinum Link. (perfil nove) e à posterior, localizada entre as alozimas ACP8 e ACP13 foi observada nos acessos S-1 (C22) e G-1 (C23) (perfil cinco) e nos acessos Perunkóide-S (C07), Cz-4x11 (C36), P. atenuattum-M1 (C08), P. atenuattum-F (C30) e P. betle (C24) (perfil oito). O perfil sete, onde se observou a alozima ACP4 no acesso X26 (C50) apresentou, como já referido, uma pequena diferença de mobilidade em relação à ACP5, sendo possivelmente resultante de uma mutação de ponto. Anti (2000), estudando herança de isoenzimas em germoplasma de soja (Glycine Max L. Merrill) e feijão (Phaseolus vulgaris L.) observou que houve diferença acentuada nos perfis eletroforéticos das duas cultivares de soja, apesar destas possuírem progenitores comuns, evidenciando a possibilidade de haver também polimorfismo em outros sistemas enzimáticos. Entretanto, as linhagens de feijão não diferiram entre si, podendo uma ter sido originada de outra por mutação de ponto, uma vez que apresentaram pequenas diferenças em suas mobilidades no gel para os sistemas ACP, MDH e LAP. O perfil 11 (P. atenuattum-M2: C09, Guajarina: C11) não possibilitou definição de bandas.

No sistema GOT foram observadas 18 alozimas e 42 fenótipos bioquímicos. Duas zonas principais de atividade enzimática e duas zonas secundárias de atividade enzimática, uma anterior e outra posterior às zonas principais foram observadas. A primeira zona principal variou da alozima GOT2 a GOT7. A segunda zona principal variou da alozima GOT8 a GOT13. A zona secundária anterior foi representada por uma única alozima (GOT1) pertencente ao acesso de P. columbrinum Link (perfil 42). Na zona posterior (da alozima GOT15 a GOT18) destaca-se GOT15, que foi observada somente nos acessos de P. betle (perfil 35), S-1 (perfil 11) e G-1 (perfil 12). O perfil 16 (F6-PL1: C21) não evidenciou formação de bandas.

A alozima GOT17 evidenciou fraca resolução em 57,1% dos perfis eletroforéticos de GOT e possivelmente está constituindo um loco de estrutura quaternária monomérica com GOT15 e GOT18. Gaia et al. (2005) relataram que bandas de resolução discreta estão relacionadas com a macho-esterilidade, que é um caráter muito útil para a produção de híbridos.

A alozima GOT16 só foi evidenciada em dois acessos (F1-PL8: C45 e X26: C50) e, conseqüentemente, pode tratar-se de uma mutação de ponto em relação a GOT17. A alozima GOT18, observada no perfil bioquímico 37 (P. atenuattum-F: C30), destacou-se por apresentar-se bem definida. A sucessão de bandas proveniente de espécies silvestre apresentou a mesma mobilidade relativa quando comparada àquela observada na sucessão de bandas correspondentes nos acessos de pimenta-do-reino, com exceção da alozima GOT11, que apresentou pequena diferença de mobilidade.

As alozimas GOT9, GOT12 e GOT14 podem também ser resultantes de mutação de ponto, pois apresentaram diferença na mobilidade em relação a GOT8, GOT11 e GOT15, respectivamente. Onus & Pickersgill (2000), estudando híbridos interespecíficos F₁ do gênero Capsicum verificaram diferentes formas homozigóticas nos parentais e heterozigotos tri-bandeados nos híbridos F₁, inferindo-se a estrutura quaternária dimérica para a herança.

No sistema ACO detectaram-se 12 alozimas e 29 fenótipos eletroforéticos evidenciando uma zona principal de atividade enzimática (localizada entre as alozimas ACO4 e ACO7) e duas zonas secundárias, uma anterior (entre ACO1 e ACO3) e outra posterior (entre ACO8 e ACO12) à zona principal. A zona principal conteve alozimas com maior intensidade na coloração e no tamanho quando comparada às zonas secundárias anterior e posterior, além de que esteve presente na maioria dos acessos, ao passo que as zonas secundárias apresentaram menor presença nos acessos. A expressão de ACO3 foi observada somente na espécie P. columbrinum Link (C27) (perfil 29). A espécie P. betle (C24) (perfil 15) apresentou o maior número de alozimas. Nos perfis 10 (G-1: C23), 11 (Karimunda-2: C25) e 21 (Djambi: C15, Karimunda-3: C29 e P. atenuattum-F: C30) não foram visualizadas bandas na zona principal, porém apresentaram alozimas visualmente perceptíveis na zona secundárias posterior. O perfil 29 (Kottanandan-2: C28 e Diemberg: C31), igualmente, não apresentou nenhum sinal histoquímico de formação de bandas. Bi et al. (1999) detectaram polimorfismo em aconitase, controlado por dois locos gênicos em feijão-lima, relatando que similar resultado tem sido encontrado em outras espécies.

O sistema fumarase evidenciou três alozimas e quatro fenótipos eletroforéticos com somente uma zona de atividade. O perfil dois foi observado em alguns acessos de pimenta-do-reino (0697: C01, Diemberg-2: C35, Karimunda: C12 e Karimunda-2: C25) e P. atenuattum-M: C08 e C10) formando uma banda de maior intensidade, o que pareceu tratar-se de sobreposição de bandas. Rodrigues (1995) observou sobreposição de bandas em urucum (Bixa orellana L.) evidenciada pela intensidade relativa das bandas em perfis de 6PGDH. Tal fato deve ser considerado, pois há a possibilidade de haver dois alelos relacionados com uma banda, causando variabilidade genética. Schuelter et al. (1999), estudando herança de MDH em pimenta-silvestre por meio de eletroforese em gel de amido, observou a possibilidade de haver sobreposição de bandas baseado na distribuição dos locos entre as progênies.

A alozima FUM1 (perfil quatro) não foi observada em nenhum acesso de espécies silvestres e esteve ausente em somente alguns acessos de pimenta-do-reino. A alozima FUM3, ocorreu com menor freqüência (acessos G-1: C23, P. atenuattum-F: C30 e P. columbrinum Link: C27). O perfil um (acesso S-1: C22) não apresentou formação de bandas. Com exceção dos possíveis casos de sobreposição de bandas, todos os acessos analisados apresentaram genótipos homozigóticos. Bi et al. (1999), examinando germoplasma de feijão-lima, não obtiveram sucesso na utilização do sistema fumarase para análise de acessos, porém observaram 74% de polimorfismo por meio de outros 17 sistemas, dentre os quais SKDH, PGI e ACO.

No sistema PGI foram observadas 13 alozimas constituindo 28 fenótipos eletroforéticos evidenciando uma zona principal de atividade enzimática localizada entre as alozimas PGI4 e PGI13 e presente em todos os acessos, com possível exceção do perfil 28 (P. columbrinum Link: C27), que não apresentou resolução em bandas (apenas um arraste no gel); e uma zona secundária anterior à zona principal localizada entre as alozimas PGI1 e PGI3, na qual não foi detectado bandeamento em 38 acessos, o que pode ser devido à ocorrência de alelos nulos codificando alozimas nesta zona de atividade. Segundo Robinson (1998) tais alelos controlam alozimas que não expressam atividade durante o processo de coloração e podem representar enzimas defeituosas ou instáveis durante os procedimentos de extração, conservação e eletroforese das amostras. A ausência de bandas em alguns perfis também foi observada nos sistemas GOT, ACO e FUM. Em estudos realizados por Onus & Pickersgill (2000), o sistema PGI, assim como GOT e ACO, foram úteis para identificar acessos de C. baccatum, de C. eximium e de C. cardenazii.

Quanto ao padrão eletroforético 6PGDH, foram evidenciadas 11 alozimas constituindo 15 fenótipos bioquímicos. O perfil 10 apresentou somente uma alozima (6PGDH8) presente no acesso P. atenuattum-F (C30) e apresentou migração equivalente à constatada nos acessos Kotavally (C60) (perfil oito), X32 (C54) (perfil sete), Kottanadan-1 (C26) (perfil seis). Nestes acessos, a banda 6PGDH8 mostrou-se de maior tamanho do que em outros acessos na qual ela aparece, a saber: P. atenuattum-M (C09) (perfil 11) e Trang (C64) (perfil cinco). Este tipo de polimorfismo no tamanho da banda pode ser resultado de mutação de ponto, o que não implica em mudança no padrão de migração, mas sim na conformação da alozima. Ferreira (2003) relata que mudanças em bases aminadas do DNA de um gene podem resultar na formação de um polipeptídeo de carga ou configuração diferente. É possível, também, admitir a hipótese de que uma mudança na configuração da alozima não implica, necessariamente, em aumento de peso ou em alteração da carga líquida, pois há implicação também do balanço de perdas e ganhos dos aminoácidos envolvidos.

Os perfis dois (F6-PL1: C21, F1-PL8: C45, Kottanadan-2: C28); seis (Kottanadan-1: C26) e oito (Kottavally: C60) revelaram pequena variação na mobilidade das alozimas 6PGDH4 e 6PGDH6 em relação às alozimas 6PGDH5 e 6PGDH7, respectivamente, podendo tratar-se de mutação de ponto. Este sistema foi também útil para descrever variação genética em populações juvenis e adultas de pinheiro (Pinus cembra), que com base também em outros sistemas, dentre os quais ACO, PGI e SKDH, observou-se uma média de 25% de polimorfismo nas populações estudadas (Klump & Stefsky, 2004).

Em relação a G6PDH, foram observados seis padrões de banda constituindo 11 fenótipos bioquímicos. Duas zonas de atividade enzimática foram observadas, sendo que a mais anódica apresentou melhor definição e separação. A primeira zona evidenciou três alozimas (G6PDH1, G6PDH2 e G6PDH3), o mesmo ocorrendo com a segunda zona, de migração mais lenta, que também apresentou três alozimas (G6PDH4, G6PDH5 e G6PDH6), que formaram um perfil tri-bandeado presente em cerca de 83% dos acessos, constituindo provavelmente genótipos heterozigóticos, vez que este sistema apresenta comumente estrutura quaternária dimérica; isto pode estar em função de que espécies com propagação assexuada, como é o caso da pimenta-do-reino, apresentam elevado grau de heterozigose.

A alozima G6PDH1 foi observada em quase todos os acessos de pimenta-do-reino, com exceção de S-1 (C22) e de G-1 (C23). A alozima G6PDH2 foi observada nos perfis três (P. atenuattum-M: C08 e C10) e seis (P. atenuattum-F: C30), denotando uma mutação de ponto de G6PDH3, pois apresentou uma pequena diferença na mobilidade relativa. A alozima G6PDH3 foi observada no perfil 10 (P. betle: C24) e no perfil cinco (G-1: C23). O perfil 10 (P. betle: C24) evidenciou uma banda de G6PDH4 de menor tamanho que as demais com a mesma mobilidade relativa de G6PDH4 observadas em outros acessos. O perfil 11 (Guajarina: C11) não possibilitou definição de bandas. Neste sistema, Bi et al. (1999) observaram, em germoplasma de feijão-lima (Phaseolus lunatus Linn.), polimorfismo de alozimas em duas zonas de atividade no gel, com estrutura quaternária monomérica, mas isto pode ter sido influenciado pelo estádio e comportamento fisiológico das sementes donde foram extraídas as isoenzimas, o que gerou incerteza com relação à herança da estrutura da proteína.

Cinqüenta acessos, representando 64,1% dos genótipos analisados, puderam ser caracterizados por 91 fenótipos eletroforéticos, sendo que (Tabela 2) houve casos em que um só acesso pôde ser identificado por apenas um perfil eletroforético; em outros casos, puderam ser caracterizados em grupos, igualmente por um só perfil, com constituição variando de dois a seis acessos, sendo que metade dos acessos (25) pôde ser identificada no primeiro caso e a outra metade pelos demais casos.

Os acessos que puderam ser identificados por apenas um perfil eletroforético foram C03, C05, C06, C11, C12, C14, C16, C18, C19, C20, C28, C29, C33, C42, C43, C46, C47, C48, C59, C63, C66, C69, C73, C76 e C77.

A contribuição de perfis individuais por sistema enzimático foi de 30 (GOT), 20 (ACO), 18 (PGI), 11 (6PGDH) e dois (ACP e SKDH). De modo geral, em caso de necessidade de uma rápida identificação, o sistema GOT, como apresentou maior número de perfis individuais, poderá ser utilizado para identificar 60% dos acessos que apresentaram tais perfis (os 30 acessos constantes na Tabela 2, abaixo dos perfis de GOT). Para os 40% restantes, GOT pode ser complementado pelos demais sistemas. O sistema ACO poderá identificar nove acessos (C14, C16, C17, C18, C28, C46, C54, C73 e C74); PGI, cinco (CO5, C42, C43, C48 e C64) e os sistemas 6PGDH, G6PDH e SKDH, poderão identificar, cada um, dois acessos, respectivamente, C08 e C09, C11 e C20, e C03 e C59.

Pode-se concluir que todos os sistemas apresentaram boa resolução, com ênfase para xiquimato desidrogenase (SKDH), 6-fosfogluconato desidrogenase (6PGDH), fosfoglucoisomerase (PGI), e fosfatase ácida (ACP). Todos os sistemas apresentaram polimorfismo de isoenzimas e, mesmo nos sistemas menos polimórficos, observaram-se isoenzimas capazes de identificar acessos, sendo que GOT foi o que apresentou a maior variabilidade de perfis eletroforéticos e FUM, a menor. Cinqüenta e sete por cento das alozimas podem ser utilizadas para caracterizar e identificar clones individuais ou grupos de até oito clones desta coleção. Cerca de 64% dos acessos avaliados podem ser identificados por um a seis fenótipos individuais dos sistemas enzimáticos analisados. A análise da similaridade indicou G1, G2 e G3 como os grupos que detiveram os clones mais divergentes para serem usados em cruzamentos intraespecíficos e interespecíficos visando aumentar a variabilidade genética da coleção dos acessos.

AGRADECIMENTOS

À JICA pelos materiais, equipamentos e reagentes cedidos durante o convênio de cooperação científica e tecnológica com a Embrapa Amazônia Oriental e ao FUNTEC, que complementou este estudo.

(Recebido para publicação em 10 de janeiro de 2006; aceito em 12 de julho de 2007)

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Jan 2008
• Data do Fascículo
  Set 2007

Histórico

• Aceito
  12 Jul 2007
• Recebido
  10 Jan 2006