Ocorrência de Vibrio vulnificus em alguns alimentos de origem marinha

Occurrence of Vibrio vulnificus in seafood

Ocorrência de Vibrio vulnificus em alguns alimentos de origem marinha

Occurrence of Vibrio vulnificus in seafood

Maria Luz Garcia Moreno; Mariza Landgraf

Prof^a, USP/Faculdade de Ciências Farmacêuticas/Laboratório de Microbiologia de Alimentos - Av. Prof. Lineu Prestes, 580 - 05508-900 - São Paulo - SP

RESUMO

Vibrio vulnificus é uma bactéria Gram-negativa que habita águas marinhas. É patogênica para o homem e a doença está associada ao consumo de frutos do mar, com aproximadamente 60% dos casos sendo fatais em pacientes imunocomprometidos. O objetivo desta pesquisa foi estudar a ocorrência de V. vulnificus em amostras de alguns alimentos de origem marinha. As amostras de ostras, mariscos e camarões foram coletadas nos períodos de abril-agosto de 1993, maio-setembro de 1994 e fevereiro de 1995. De 55 amostras de ostras, 36 (65%) foram positivas para V. vulnificus; das 19 amostras de mariscos, 8 (42,1%) foram positivas e das 7 amostras de camarão, 1 (4,3%) foi positiva para esta bactéria. Os resultados permitiram-nos concluir que a bactéria foi recuperada durante todos os meses de análise, demonstrando que estes alimentos, principalmente quando consumidos crus, são potencialmente perigosos para os seres humanos na faixa de risco.

ABSTRACT

Vibrio vulnificus is a Gram-negative bacterium that inhabits sea enviromnents. lt is pathogenic for human and the illness is associated with the ingestion of seafood, especially raw oysters. Approximately 60% of the cases are fatal, mainly in immunocompromised patients. The present research was carried out in order to study the presence of V. vulnificus in some seafood samples. The oysters, clams and shrimp samples were collected during April-August 1993, May-September 1994 and February 1995. 36% (65%) out of 55 oysters samples were positive for V. vulnificus; 8 (42.1%) out of 19 clams samples were positive, and 1 (14.3%) out of 7 shrimp samples harboured this bacterium. The presence of Vibrio vulnificus in these samples shows that they are potentially dangerous for human being, especially for those raw seafood consumers and at the risk group.

Key-words: Vibrio vulnificus, oysters, seafood.

1 — INTRODUÇÃO

V. vulnificus é um halófilo obrigatório com os pacientes apresentando relatos de consumo de frutos do mar contaminados com a bactéria ou por exposição de feridas à água do mar. KLONTZ et al. (13) descreveram os sinais clínicos e a epidemiologia das infecções causadas por V. vulnificus - septicemia primária, infecção de feridas e infecção gastrintestinal.

A ocorrência deste microrganismo no ambiente marinho é sempre favorecida por temperaturas acima de 13°C, e por salinidade abaixo de 16% (11), sendo que níveis de até 11 x 10⁴ número mais provável por grama (NMP/g) foram encontrados em amostras de ostras durante o verão (26).

Nos Estados Unidos, V. vulnificus foi isolado por TAMPLIN et al. (30) da água do mar e de frutos do mar tendo sido detectado, com maior frequência, entre julho e novembro. As contagens encontradas foram inferiores a 0,3NMP/g de V. vulnificus por 100mL de água e superiores a 3x10³ NMP/g de fruto do mar. OLIVER et al. (24) isolaram V. vulnificus de amostras de água de mar, sedimento, plâncton, caranguejo, pescados e frutos do mar, colhidas durante o verão em 80 pontos compreendidos entre Miami (Flórida) e Portland (Maine). Kaysner et al. (10) relataram a presença de V. vulnificus em amostras de água, frutos do mar e sedimentos de estuários, na costa oeste do Estados Unidos.

Na África, SCHANDENYL et al. (27) isolaram o microrganismo a partir de peixe de águas costeiras de Dakar, Senegal, quando a temperatura era de 24±3°C.

No Brasil, ZEBRAL et al. (35) isolaram a bactéria de mexilhões colhidos na baía de Guanabara, Rio de Janeiro. MATTÉ et al. (17,18), estudando a distribuição de diferentes espécies de vibrio em mariscos colhidos no litoral do estado de São Paulo, durante um ano, verificaram a presença de V. vulnificus em 12% das amostras de ostras analisadas, em concentrações inferiores a 3NMP/100g. LANDGRAF et al. (14) em um estudo de 100 amostras, entre ostras, mariscos e camarões, encontraram 51,8% de positividade para a presença desta bactéria em concentração de 3 a 3,5x 10²NMP/g.

O isolamento de V. vulnificus é dificultado pela enorme variedade de bactérias presentes nos ambientes marinhos e estuários onde são encontrados. Além disso, nem todas estas bactérias já foram caracterizadas fenotipicamente e muitas delas podem ser confundidas com V. vulnificus. Segundo OLIVER et al., (22) 50% ou até mais dessas bactérias são vibrios.

Com freqüência, na metodologia de isolamento de V. vulnificus são utilizados caldos de enriquecimento. SLOAN et al. (29), comparando cinco caldos de enriquecimento seletivo utilizando a técnica do Número Mais Provável (NMP), verificaram que a água peptonada alcalina recuperou o maior número de células de V. vulnificus.

Em relação aos meios de isolamento utilizados, comumente emprega-se o ágar tiosulfato-citrato-sais biliares-sacarose (TCBS) (17, 18, 23, 24, 30). Entretanto, este meio é capaz de promover o crescimento de muitas outras bactérias além dos vibrios, não permitindo a diferenciação de V. vulnificus de outros não fermentadores de sacarose, como por exemplo o V. parahaemolyticus. Esse fato levou ao desenvolvimento de novos meios de isolamento, mais seletivos como o ágar dodecil-sulfato de sódio-polimixina B-sacarose (SPS), desenvolvido por KITAURA et al., mencionados por BRYANT et al. (2), e o ágar celobiose-ppolimixina B-colistina (ágar CPC) (16). Este último meio sofreu modificações, conforme relatado por ELLIOT et al. (4).

Assim como para outros microrganismos causadores de doenças de origem alimentar, a identificação completa de V. vulnificus requer vários dias. Na tentativa de sanar este problema, têm sido propostos métodos mais rápidos e específicos de identificação que podem ser aplicados sobre a bactéria isolada ou ainda diretamente no alimento. Estas técnicas incluem métodos imunoenzimáticos (5,25, 28, 31) e métodos moleculares (1, 6, 9, 19, 33, 34).

O objetivo desta pesquisa foi estudar a ocorrência de V. vulnificus em alguns alimentos de origem marinha coletados no litoral do Estado de São Paulo, Brasil, utilizando os meios TCBS e mCPC como meios de isolamento.

2 — MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 - Materiais

Foram analisadas 81 amostras de alimentos de origem marinha, agrupadas da seguinte forma:

– 55 amostras de ostras (Crassostrea gigas)

– 19 amostras de mexilhão (Perna perna)

– 7 amostras de camarão (Penaeus spp.)

As amostras de frutos do mar (in natura) colhidas nas regiões de Cananéia, Iguape, Ilha Comprida e São Sebastião no litoral do Estado de São Paulo, foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Microbiologia Alimentar do Instituto Adolfo Lutz. As amostras de camarão foram coletadas em uma planta processadora da cidade de Santos, Estado de São Paulo. A coleta das amostras foi realizada nos seguintes períodos: abril-agosto 1993, maiosetembro 1994 e fevereiro de 1995. Todas as amostras foram transportadas até o laboratório de análise em local seco e em temperatura de refrigeração.

2.2 - Métodos

2.2.1 - Amostragem de frutos do mar

A parte externa da concha foi raspada e esfregada com o auxílio de uma escova rígida, sob água corrente tratada. Em seguida, as con

Doze ostras foram abertas, assepticamente, com o auxílio de um estilete estéril que era inserido entre as conchas na posição ventral. Em seguida, após a secção do músculo aductor, o líquido e a carne foram coletados em frasco estéril. Este material foi homogeneizado em copo de liquidificador estéril por 60 segundos.

Uma amostra composta de vinte mexilhões recebeu tratamento igual ao das ostras.

2.2.2 - Amostragem de camarão

Os camarões foram lavados com água corrente tratada, colocados em bandeja para secagem e cortados em pequenos pedaços.

2.2.3 - Isolamento e identificação de V. vulnificus

Utilizou-se a técnica do número mais provável (NMP), segundo Elliot et al. (4). Foram pesados 25g do homogeneizado de ostras ou 25g do homogeneizado de mexilhões ou 25 gramas de camarão. Este material foi transferido, assepticamente, para um frasco contendo 225mL de solução NaCl 2% estéril e, a partir desta primeira diluição 10^-1, foram realizadas diluições decimais seriadas até 10^-5 em solução NaCl 2% estéril. Um mL de cada diluição foi inoculado, em triplicata, em tubos contendo 10,0mL de água peptonada alcalina. Os tubos foram incubados por 12-16 horas a 35°C. A partir de cada tubo positivo, isto é, apresentando turbidez, semeou-se, de maneira a obter colônias isoladas, em placas contendo ágar TCBS e ágar mCPC (ágar colistina polimixina celobiose modificado). As placas foram incubadas por 24h a 35°C e 24h a 40°C, respectivamente.

De 2-3 colônias verdes (microrganismos não fermentadores de sacarose), com bordas regulares, centro mais escuro em ágar TCBS e colônias amarelas (microrganismos fermentadores de celobiose), com 1-2 mm de diâmetro, achatadas e translúcidas em ágar mCPC, foram inoculadas em tubos contendo ágar Kliger e ágar PVP (7). Os tubos foram incubados por 24 horas a 35°C. A colônia cujo crescimento apresentou fermentação da glicose sem produção de gás, não fermentou a lactose e não produziu arginina dehidrolase, não produziu H₂S em ágar PVP, foi semeada em placa contendo ágar TSA adicionado de NaCl 2%. Após 24 horas de incubação a 35°C, a cepa foi submetida aos testes de produção de oxidase e motilidade. A cepa produtora de oxidade e móvel foi submetida às provas de halofilia em caldo nutriente com concentrações de cloreto de sódio de 0, 3, 6 e 8%. As colônias com crescimento em 3% e 6%, mas não em 0 e 8% foram identificadas bioquimicamente, com o auxílio do sistema de identificação API 20E (Analytab Products Inc., Plainview, NY), utilizando solução de NaCl 2% como diluente (15).

As cepas com características de V. vulnificus foram mantidas à temperatura ambiente em ágar TSA adicionado de NaCl 2%.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

Estudos ecológicos demonstram que V. vulnificus é uma bactéria normalmente encontrada em ambientes marinhos (3) e a sua presença está determinada por fatores ambientais como salinidade e temperatura (8, 11). V. vulnificus tem sido isolado com muita freqüência de amostras de moluscos bivalvos (14, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 30, 32).

A presença desta bactéria nas ostras, segundo KETTLY & DINUZZO (12), ocorre através da filtração passiva da água contaminada com esse microrganismo. Muitos microrganismos podem sobreviver a este processo digestivo, entre eles os vibrios. Quando utilizados como alimento e pelo fato de serem consumidos crus e inteiros, os bivalvos convertem-se em vetor para a transmissão de doenças. Portanto, o seu consumo pode representar um importante problema para a saúde pública.

Na presente pesquisa, V. vulnificus foi isolado durante todos os meses de amostragem.

A Tabela 1 apresenta a ocorrência de V. vulnificus em alimentos de origem marinha, provenientes do litoral do Estado de São Paulo, nos período de abril-agosto 1993, maio-setembro 1994 e fevereiro de 1995.

Da Tabela 1, observa-se que a maior freqüência de contaminação por esse microrganismo foi encontrada nas amostras de ostras (65,4%). Estes resultados são superiores aos obtidos por O'NEIL et al. (21) que encontraram positividade em 37,8% das amostras analisadas, apesar da metodologia ser a mesma nos dois trabalhos. A região de coleta das amostras na pesquisa de O'NEIL et al. (21) apresentava temperaturas inferiores a 10°C e salinidade inferior a 5%durante os meses de inverno, condições estas desfavoráveis ao crescimento e conseqüente isolamento da bactéria.

Observa-se, também, que a percentagem para a recuperaçãode V. vulnificus de amostras de camarões foi de 14,3% e de 42,1% para as de mariscos.

O maior número de amostras de ostras deve-se ao fato de o laboratório de Microbiologia Alimentar do Instituto Adolfo Lutz ter recebido durante o período estudado, um maior número de amostras desse alimento.

O'NEIL et al. (20) isolaram V. vulnificus de 15 amostras (19,2%) de um total de 78 amostras de água e ostras. Dessas, 8 (53,4%) eram de água e 7 (46,6%) eram provenientes de amostras de ostras. Por sua vez, KAYSNER et al. (10) isolaram a bactéria em apenas 6,4% das amostras de frutos do mar nas regiões dos estados de Washington, Oregon e Califórnia (USA).

MATTÉ et al. (17), estudando a ocorrência de Vibrio spp em amostras de ostras comercializadas na cidade de São Paulo, encontraram 12% das amostras positivas para V. vulnificus, cerca de 5 vezes menor do que a relatada neste trabalho. Esta diferença nos resultados pode ser explicada pelo uso de diferentes metodologias para o isolamento da bactéria, principalmente no que se refere ao meio de isolamento.

O ágar mCPC apresentou maior percentagem de isolamento de colônias suspeitas de V. vulnificus do que o ágar TCBS como pode ser constatado pela Tabela 2 que apresenta o número e a percentagem de amostras de alimentos positivas para V. vulnificus em ágar TCBS, ágar mCPC e em ambos os meios.

Apesar da superioridade do ágar mCPC em relação ao ágar TCBS, este último possibilitou o isolamento de uma cepa de V. vulnificus de camarões que não foi recuperada em ágar mCPC.

Das colônias típicas no meio mCPC, isto é, as de cor amarela, fermentadoras de celobiose, a maioria foi identificada como V. vulnificus. Dentre as colônias amarelas, aquelas não identificadas como V. vulnificus, não apresentavam tamanho e características da verdadeira colônia de V. vulnificus, isto é, 1-2 mm de diâmetro, achatadas e translúcidas.

Essas colônias atípicas apresentavam-se mucóides.

4 — CONCLUSÕES

– Apesar de não se ter casos documentados de infecções por V. vulnificus no Brasil, sua presença em 55,5% das amostras analisadas neste trabalho é preocupante, tendo em vista que além do litoral brasileiro ser extenso, todo ele se encontra em regiões de clima tropical e temperado, com temperaturas propícias ao desenvolvimento dessa bactéria.

– A presença de cepas de V. vulnificus em ostras, mariscos e camarões demonstra que esses alimentos são veículos desta bactéria sendo, portanto, potencialmente, perigosos para a saúde pública, principalmente quando ingeridos crus por pessoas consideradas na faixa de risco, isto é, imunocomprometidos, com doença hepática crônica, hemolítica ou renal.

5 — REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Recebido para publicação em 1/12/96

Aceito para publicação em 07/07/97

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  04 Out 2012
• Data do Fascículo
  Ago 1997