Caracterização imunoquímica da ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em frutos climatéricos

Immunochemical characterization of ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxilic acid) oxidase in climacteric fruits

CARACTERIZAÇÃO IMUNOQUÍMICA DA ACC (ÁCIDO 1-CARBOXÍLICO-1-AMINOCICLOPROPANO) OXIDASE EM FRUTOS CLIMATÉRICOS¹

CHAVES², Ana Lúcia; BIERHALS², Jaqueline Dettmann; ZIMMER², Paulo Dejalma; SILVA³, Jorge Adolfo & ROMALDI⁴, Cesar Valmor

RESUMO

Com o objetivo de caracterizar, por via imunoquímica, a enzima ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em frutos climatéricos, foram preparados anticorpos policlonais específicos para esta proteína. Utilizou-se, como antígeno, uma proteína recombinante, produzida em Escherichia coli K38/pGP_1,2, contendo o vetor de expressão pT7-7A4 no qual foi inserido um clone de DNA da ACC oxidase. A especificidade dos anticorpos foi demonstrada pela técnica de "Western blot", a partir de extratos protéicos de maçãs e tomates em diferentes estágios de maturação. Verificou-se que o aumento da produção de etileno, quando os frutos passaram do estágio pré-climatérico para o climatérico, está diretamente correlacionada com o aumento da síntese da ACC oxidase. Em estágios de maturação mais avançados houve uma redução da produção de etileno e da atividade ACC oxidase, mas esta proteína continuava presente. Quando o "Western blot" foi realizado com tomates transgênicos, onde a produção de etileno e a síntese da ACC oxidase foram inibidos em mais de 95%, nenhuma reação imunoquímica foi detectada. O conjunto de resultados obtidos indica que os anticorpos detectam especificamente ACC oxidase.

Palavras-chave: etileno, ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase, anticorpos, frutos climatéricos.

SUMMARY

IMMUNOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF ACC (1-AMINOCYCLOPROPANE-1-CARBOXILIC ACID) OXIDASE IN CLIMACTERIC FRUITS. Polyclonal antibodies were prepared to characterize the enzyme ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxilic acid) oxidase from climateric fruits. The antigen was a recombinant protein obtained from an Escherichia coli K38/pGP_1,2, which contained the expression vector pT7-7A4 with one ACC oxidase DNA clone inserted. Antibody specificity was demonstrated by the Western blot technique with protein extracts from apples and tomatoes in different maturation stages. It was observed that the increase in ethylene production which happened when the fruits changed from pre-climateric to climateric stage is directly correlated with an increase in ACC oxidase syntesis. In more advanced maturation stages there was a reduction in ethylene production and ACC oxidase activity, however the protein was still present. There was no immunochemical reaction in Western blot performed with transgenic tomatoes, which had a 95% reduction of etylene production and ACC oxidase syntesis. This results suggest that the antibodies detects ACC oxidase specifically.

Key-words: ethylene, ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxilic acid) oxidase, antibodies, climacteric fruits.

1 — INTRODUÇÃO

O etileno é um fitoregulador de crescimento associado a praticamente todas as etapas fenológicas do desenvolvimento, desempenhando, entretanto, papel fundamental na indução da maturação/senescência de frutos climatéricos. A síntese do etileno é fortemente estimulada por fatores exógenos como as infecções fúngicas, bacterianas e/ou virais, as injúrias físicas ("chilling injury") e mecânicas (danos mecânicos), os estresses térmicos e hídricos, além da resposta autocatalítica. Este envolvimento generalizado nos eventos fisiológicos do crescimento e desenvolvimento dos vegetais faz com que este hidrocarboneto seja, em alguns casos, causa (maturação, por exemplo) e, em outros, conseqüência do processo (resposta a estresses, por exemplo) (10, 13, 14, 20).

A via de biossíntese do etileno compreende a conversão da S-adenosil metionina em ácido 1-carboxílico-l-aminociclopropano (ACC), sob a ação da ACC sintetase e a conversão do ACC em etileno, pela ação da enzima formadora do etileno (EFE) ou ACC oxidase. Dezenas de trabalhos citados por KENDE (10), foram realizados buscando caracterizar, isolar, purificar à homogeneidade e seqüenciar algumas isoformas de ACC sintetase, bem como dos respectivos clones de DNA e os genes envolvidos.

Grande parte destas descobertas se deu graças aos avanços obtidos nas técnicas de Biologia Molecular e de Imunoquímica, onde foram preparados anticorpos mono e policlonais dirigidos para as diferentes isoformas de ACC sintetase. Isto permitiu melhor compreender mecanismos de expressão desta enzima.

No que concerne à ACC oxidase, somente em 1991 é que VERVERIDES & JOHN (19) conseguiram isolar esta enzima num sistema acelular e dosar sua atividade in vitro. A descoberta da natureza e das propriedades da ACC oxidase resultou em importantes avanços no esclarecimento dos mecanismos fisiológicos e moleculares da maturação de frutos climatéricos. Assim, foram isolados clones de DNA e genes da ACC oxidase em tomate (08), maçã (06) e melão (12).

HAMILTON et al. (08) foram os primeiros pesquisadores a isolar um clone de DNA da ACC oxidase de tomate, denominado pRC13. Eles demonstraram que leveduras transformadas com o pRC13, quando incubadas em presença de ACC, ferro e ascorbato, eram capazes de sintetizar etileno. Já naquelas não transformadas com este clone nenhuma quantidade de etileno foi produzida.

Com base nessas informações e utilizando o pRC13 como sonda heteróloga, DONG et al. (06) isolaram um clone de DNA da ACC oxidase em maçã, cv. Golden Delicious, e BALAGUÉ et al. (02), um clone desta mesma enzima em melão, cv. Galia.

Mais recentemente, LASSERE et al. (12) caracterizaram três genes funcionais da ACC oxidase em melão: ACCO1, envolvido na maturação dos frutos; ACCO2, na elongação de hipocótilos; e ACCO3, na antese. Na mesma época, BARRY et al. (03) também caracterizaram três genes da ACC oxidase em frutos de tomate: TOM1, expresso durante a maturação dos frutos; TOM2, expresso em tecido submetido à injúrias mecânicas; e TOM3, em material infectado por fungos. Em todos os casos, a homologia das seqüências das regiões traduzidas dos genes é superior a 85%.

A combinação de técnicas de Biologia Molecular, de Bioquímica, de cultura in vitro e de fisiologia pós-colheita permitiu a obtenção de plantas transgênicas, produtoras de frutos com baixa produção de etileno e maturação retardada. Este material, praticamente desprovido de atividade ACC oxidase, tem servido de modelo vegetal para o estudo dos efeitos específicos do etileno sobre as principais alterações detectadas durante o amadurecimento de frutos: bioconversão de açúcares, síntese de pigmentos, metabolismo de ácidos orgânicos, degradação da parede celular, insuficiências do sistema endomembranário, formação de zona de abscisão, dentre outras (01, 13, 14, 16).

Os estudos da fisiologia de pós-colheita de frutos climatéricos carece, no entanto, de metodologias com boa sensibilidade e rapidez para a detecção direta da enzima ACC oxidase, já que a medida de sua atividade exige, para cada espécie, a calibração das condições de extração e dosagem. A produção de etileno, nem sempre está correlacionada com os níveis de ACC oxidase.

Dentro deste contexto, o presente trabalho objetiva estudar a expressão da ACC oxidase em frutos climatéricos por via imunoquímica. Será apresentado o sistema de preparo do antígeno, a caracterização dos anticorpos anti-ACC oxidase e sua utilidade na detecção de uma das enzimas chaves da via de biossíntese do etileno.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Preparo do vetor

O clone de DNA, denominado pA4 (06), contendo a seqüência codificadora para uma ACC oxidase, foi utilizado para construção de um vetor destinado à produção da respectiva proteína recombinante. Um fragmento, de aproximadamente 1,2 kb, foi isolado do pA4 por digestão com as enzimas de restrição Hind III e Pst I, tratado com "Klenow" DNA Polimerase I e Fosfatase Alcalina e, em seguida, inserido no vetor de expressão pT7-7 (18), linearizado por Sma I. Esta nova construção, denominada pT7-7A4, foi introduzida em células competentes de Escherichia coli k₃₈pGP_1-2, segundo o protocolo descrito por SAMBROOK et al. (17). As colônias selecionadas em meio Luria Broth-LB (17) sólido, contendo Kanamicina e Ampicilina nas concentrações de 75 µg.ml^-1 e 60 µg.ml^-1, respectivamente, foram submetidas a uma minipreparação de DNA plasmidial e ao estudo do perfil de digestão por enzimas de restrição. Uma delas, contendo o plasmídeo pT7-7A4, foi utilizada para a produção da proteína recombinante ACC oxidase.

2.2 – Produção da ACC oxidase

Para a produção da proteína recombinante, uma colônia de Escherichia coli k₃₈pGP_1-2, contendo o plasmídeo pT7-7A4 (cepa transformada), foi inoculada em meio LB líquido contendo os antibióticos de seleção e mantida em agitação a 200 rpm, a 30°C, até que a suspensão atingisse uma DO₆₀₀ em torno de 0,4. Em seguida, a suspensão foi aquecida a 42°C durante 30 minutos; resfriada para 37°C, e, após, foi mantida sob agitação durante 2 horas. Estas três etapas correspondem, respectivamente, à multiplicação celular, à indução do gene da T7-polimerase presente no vetor de expressão e à tradução da proteína recombinante ACC oxidase propriamente dita (18). Como controle do processo, utilizou-se uma suspensão celular de Escherichia coli k₃₈pGP_1-2 não transformada com o plasmídeo pT7-7A4.

A separação da biomassa da suspensão celular foi efetuada por centrifugação a 5000g a 4°C, durante l0 minutos. Para a extração das proteínas, o material foi, na ordem, incubado em uma solução aquosa de lisozima a 1% (m/v) durante 10 minutos; com DNAse I a 10 µg/ml^-1 durante 1 hora, e, finalmente, suplementado com 2 volumes de uma solução aquosa de uréia a 3,0M. O material não dissolvido foi separado por centrifugação a 15000g durante 20 minutos a 4°C e em seguida, dissolvido em tampão LAEMMLI (11) para migração eletroforética.

2.3 – Eletroforese de proteínas

A separação eletroforética das proteínas foi realizada em condições desnaturantes, do tipo SDS-PAGE ("Sodium Dodecylsulfate- Polyacrylamide Gel") utilizando um sistema descontínuo de dois géis: um denominado gel de concentração, constituído de Tris-HCl 125 mM com pH 6,8, 0,l% (m/v) de SDS, 4% (m/v) de acrilamida, 0,03% (m/v) de persulfato de amônio e 0,04% de N’,N’,N’- Tetrametil etilenodiamina, e outro, denominado de separação, onde a concentração de acrilamida foi aumentada para 12% (m/v), o tampão utilizado foi Tris-HCl 375 mM com pH 8,9. A migração foi realizada a 150V durante 90 minutos num tampão contendo 25 mM de Tris, 192 mM de glicina e 0,1% (m/v) de SDS. A coloração do gel foi efetuada a 40^oC, numa solução contendo 0,5% (m/v) de azul de Comassie R-250, 15% (m/v) de ácido tricloroacético e 20% (v/v) de metanol. Para a descoloração, utilizou-se uma solução contendo 10% (v/v) de ácido acético, 15% (v/v) de metanol e 10% (m/v) de glicerol.

O peso molecular dos diferentes polipeptídeos foi determinado a partir de uma curva padrão preparada com as proteínas fosforilase B (97,4 kDa), albumina do soro bovino (66,2 kDa), ovoalbumina (43,0 kDa), anidrase carbônica (31,5 kDa), inibidor de tripsina (21,5 kDa) e lisozima (14,0 kDa). A dosagem de proteínas foi realizada de acordo com método descrito por BRADFORD (04).

2.4 – Isolamento da proteína e preparo de anticorpos

A proteína ACC oxidase foi isolada por eletroeluição da respectiva banda protéica removida do gel de eletroforese preparativa, corado com uma solução de CuCl₂ a 0,5% (m/v). Os resíduos de CuCl₂ foram eliminados dos fragmentos de gel através de lavagens sucessivas em soluções de EDTA a 0,3M. O isolamento da proteína foi efetuado utilizando um eletroeluidor Bio Rad II, à temperatura ambiente durante 5 horas, num tampão contendo 25 mM de Tris, 192 mM de glicina e 0,1% (m/v) de SDS. As proteínas do eluato, precipitadas com acetona a –20°C, foram utilizadas para a imunização de coelhos New Zeland, visando a produção de anticorpos policlonais, segundo metodologia descrita por HARLOW & LANE (09). A especificidade do soro obtido foi testada, pela técnica de "Western blot", em extratos protéicos de frutos climatéricos.

2.4 – Material vegetal

Foram utilizados frutos de maçã (Malus domestica Borck), cv. Jonagold, em três estágios de maturação: pré-climatérico, climatérico e pós-climatérico, e tomates (Lycopersicum esculentum L), cv. Kadá, nos estágios verde-maduro (pré-climatérico), "breaker" (climatérico) e maduro/senescente (pós-climatérico). Também analisaram-se tomates deste mesmo cultivar transformados geneticamente com um clone "antisense" da ACC oxidase, doravante denominados transgênicos (16). A evolução da maturação foi acompanhada pela evolução da coloração e pelas medidas da produção de etileno e da atividade ACC oxidase in vivo. Para as duas primeiras determinações utilizou-se o protocolo descrito por ROMBALDI et al. (16). A atividade ACC oxidase in vivo foi determinada a partir da incubação, durante 2 horas, de 1g de material vegetal em frascos de 10 ml, em 3 ml de tampão Tris-HCl 0,1M, pH 7,2, 10 µM de cicloheximida, 200 µM de ACC e 10% (m/v) de glicerol. Passado este período, os frascos foram fechados durante 30 minutos e a dosagem do etileno produzido foi efetuada por cromatografia em fase gasosa (07). A atividade ACC oxidase in vivo e a produção de etileno foram expressos em nl de etileno.h^-1.g^-1 de material vegetal.

2.5 – "Western blot"

O "Western blot" foi conduzido segundo metodologia descrita por DUPILLE et al. (07), compreendendo as etapas de extração, separação eletroforética e eletrotransferência das proteínas e imunodetecção com o uso dos anticorpos policlonais. Todas as condições utilizadas foram idênticas àquelas descritas por estes autores (07), excetuando-se a concentração de anticorpo anti-ACC oxidase que foi reduzida de 1:2000 (anticorpo:tampão, v/v) para 1:10000 (anticorpo:tampão, v/v).

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Produção da proteína ACC oxidase recombinante

A Figura 1 mostra, além dos perfis de proteínas extraídas de Escherichia coli k₃₈pGP_1-2 transformadas e não transformadas com o plasmídeo pT7-7A4 (A), a evolução da síntese desta proteína durante a fase de tradução (B) e sua pureza, após isolamento (C). No extrato protéico de células transformadas aparece um polipeptídeo de um peso molecular aproximado de 37 kDa (Figura A1), inexistente em células de Escherichia coli k₃₈pGP_1,2 não transformadas (A2). O peso molecular obtido corresponde aquele deduzido a partir da seqüência do clone pA4 de origem (07), ou seja, um polipeptídeo de 36 a 38 kDa. Salienta-se aqui, que a proteína visualizada foi sintetizada em apenas 15 minutos de incubação das células a 37°C (fase de tradução). Quando avalia-se a evolução da síntese durante 2 horas de cultivo, observa-se um importante incremento no acúmulo de proteínas, especialmente aquela correspondente ao clone A4 (Figura 1B).

3.2 – Teste imunoquímico da ACC oxidase em frutos climatéricos

3.2.1 – Produção de etileno e atividade ACC oxidase

A Tabela 1 apresenta a produção de etileno e a atividade ACC oxidase em frutos de maçã, cv. Jonagold, e de tomate não transformados e transgênicos, cv. Kadá, durante a maturação. Em todos eles observou-se um comportamento típico de frutos climatéricos, havendo um importante incremento na produção do fitoregulador etileno (250 vezes para maçã e 70 vezes para tomate) quando os frutos passaram do estágio pré-climatérico para o climatérico, e um decréscimo na fase final, pós-climatérica, quando os frutos já apresentavam sinais evidentes de senescência. Por sua vez, frutos de tomate provenientes de plantas transformadas com um clone "antisense" de DNA da ACC oxidase apresentaram, mesmo no estágio de maturação climatérico, baixa produção de etileno.

As variações na atividade da ACC oxidase da maçã e do tomate, correlacionaram-se diretamente com a variação da produção de etileno. A suplementação do meio de incubação com 200 µM de ACC, substrato da ACC oxidase, permitiu atingir aumentos superiores a 100 nl.h^-1.g^-1 e a 10 nl.h^-1.g^-1, respectivamente, para maçã e tomate, ambos na fase climatérica. Este comportamento indica que a atividade ACC sintetase é insuficiente para atender à ACC oxidase destes frutos, especialmente na fase climatérica. No entanto, em frutos de tomate transgênicos, nenhum aumento de atividade enzimática foi detectado, indicando ser a ACC oxidase a enzima limitante neste caso.

3.2.2 – Detecção imunoquímica da ACC oxidase

A especificidade dos anticorpos anti-ACC oxidase foi testada utilizando-se a técnica de "Western blot"(09, 17). Assim, quando os anticorpos reagiram com extratos protéicos de frutos pré-climatéricos, produtores de baixas quantidades de etileno (inferior a 1,0 nl.h^-1.g^-1), nenhuma reação foi observada (Figura 2A1 e 2B1). À medida que o processo de maturação evolui, induzido pelo aumento da produção de etileno, uma proteína de aproximadamente 37 kDa foi fortemente reconhecida pelos anticorpos anti-ACC oxidase (Figura 2A2, A3, B2 e B3). Esta proteína continuou presente em extratos protéicos de frutos em fase pós-climatérica, onde já houve um importante decréscimo na produção de etileno. Outros trabalhos (05, 07, 10, 14, 20) também verificaram que a proteína ACC oxidase mantém-se presente em frutas maduras/senescentes, apesar da produção de etileno ser praticamente nula. Estes autores sugeriram que uma deficiência de substrato e/ou uma desintegração da membrana seria a causa deste comportamento. Entretanto, VERVERIDES & JOHN (19), demonstraram que esta enzima pode ter sua atividade preservada in vitro, num sistema acelular, e que, quando extraída de materiais em fases avançadas de maturação/senescência, tem sua atividade reduzida a níveis muito baixos, não podendo ser restaurada, mesmo em presença do substrato e dos cofatores.

Quando os anticorpos policlonais anti-ACC oxidase reagiram com um extrato protéico de tomate transgênico, transformado com um clone "antisense" da ACC oxidase, nenhuma proteína foi reconhecida (Figura 2C1). A ausência de reação cruzada com outras proteínas, indica que os anticorpos utilizados são específicos para a ACC oxidase. Acrescenta-se ainda, o fato de que, quando substituiu-se os anticorpos policlonais anti-ACC oxidase por um soro proveniente dos animais pré-imunes, nenhuma reação positiva foi detectada (Figura 2C2).

4 — CONCLUSÕES

Os resultados obtidos permitem concluir que:

1) Os anticorpos policlonais anti-ACC oxidase são específicos para esta enzima.

2) A determinação da produção de etileno, da atividade da ACC oxidase e a imunodetecção desta enzima, permitem monitorar o processo de maturação de frutos climatéricos.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 — AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pelo auxílio financeiro, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelas bolsas de estudo concedidas e ao "Laboratoire Éthylène et Maturation de Fruits", Toulouse – França, pelo fornecimento do vetor de expressão.

² Estudante de Mestrado em Ciência e Tecnologia Agroindustrial da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL) – CAPES.

³ Estudante de Doutorado em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL).

⁴ Professor Adjunto do Depto. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial da UFPEL, Cx. Postal 354, CEP 96010-900 Pelotas, RS.

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Recebido para publicação em 05/06/97. Aceito para publicação em 04/12/97.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Dez 2004
• Data do Fascículo
  Dez 1997

Histórico

• Aceito
  04 Dez 1997
• Recebido
  05 Jun 1997