Avaliação de oito protocolos na extração de DNA genômico de <i>Hypostomus commersoni</i> Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

Mezzomo, P.; Mielniczki-Pereira, A. A.; Sausen, T. L.; Marinho, J. R.; Cansian, R. L.

doi:10.1590/1519-6984.229278

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Brazilian Journal of Biology

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Original Article • Braz. J. Biol. 81 (3) • Jul-Sep 2021 • https://doi.org/10.1590/1519-6984.229278 copiar

Avaliação de oito protocolos na extração de DNA genômico de Hypostomus commersoni Valenciennes, 1836 (Loricariidae: Siluriformes)

Autoria SCIMAGO INSTITUTIONS RANKINGS

Resumo

Os princípios e as técnicas aplicadas na extração de DNA desempenham um papel crucial na obtenção de material genético purificado. O presente estudo investiga a eficiência de oito protocolos na extração de DNA de Hypostomus commersoni, um importante componente ictiofaunístico de riachos da América do Sul. A qualidade das amostras foi avaliada por espectrofotometria, eletroforese em gel e amplificação por marcadores de PCR-RAPD. A eficiência da extração de DNA foi influenciada tanto pelo método aplicado quanto pelo tecido-alvo de escolha. Maiores concentrações e rendimento de DNA foram obtidos a partir do tecido ocular, com um espectro positivo de incubação em tampão de lise por até 36 horas após a coleta da amostra, utilizando tecidos frescos e na presença de alta concentração de proteinase K (20 mg.ml^-1). Nestas condições, as amostras foram amplificadas com sucesso. Até o momento, não há registro de descrição para os parâmetros analisados neste trabalho, nem a descrição de marcadores RAPD para a espécie H. commersoni.

Palavras-chave:
extração de DNA; PCR-RAPD; tecido ocular; Proteinase K; cascudo

Variables	Efficient	Indifferent	Inefficient
Specimens conservation	Fresh tissues (approx. 27 °C)	-	Tissues in 70% and 95% ethanol at 27 ºC
Specimens conservation	Fresh tissues (approx. 27 °C)	-	Tissues at -10 ºC and -20 ºC
Maceration	Chemical lysis	Lysis with LN₂	Mechanical lysis
Maceration	Chemical lysis	Lysis with LN₂	Manual lysis
Target-Tissue	Ocular tissue	–	Caudal fin
			Dorsal fin
			Muscle
			Gills
			Blood
Time of incubation	1h (55 ºC)	–	–
Time of incubation	12h, 24h, 36h (27 ºC)	–	–
RNAse	Absence	Presence	–
Proteinase K	Presence in high concentration (20 mg.ml^-1)	–	–
Storage after extraction	-10 ºC -20 ºC	–	4 ºC
Quantification	In the day of the extraction	–	–
Quantification	After 10, 20 and 30 days of storage	–	–

Reagents
STE Buffer	0.1 M NaCl + 10 mM Tris + 1 mM EDTA (pH 8.0)
Lysis Buffer	2.5 mM Tris-HCl pH 8.0 + 0.1 mM EDTA pH 8.0 + 0.1% SDS + 8.0 mM NaCl
Proteinase K	20 mg.mL^-1
CIA	Chloroform + isoamylic alcohol (1:24 v/v)
TE Buffer	10 mM Tris pH 8.0 + 1 mM EDTA pH 8.0
TBE Buffer	500 mM Tris-HCl + 60 mM boric acid + 83 mM EDTA
Steps of extraction
1. Collect 20 mg of fresh tissue.
2. Wash in 500 µl of STE (cold) and discard.
3. Add 500 µl of lysis buffer, 2 µL of β-Mercaptoetanol and 13 µl of proteinase K, in this order, and incubate at 55 ºC for 1 hour (alternatives include the incubation for 12, 24 or 36 hours at 27 ºC).
4. Add 700 µl of CIA and homogenize by inversion.
5. Centrifuge for 10 minutes at 9,000 rpm and transfer the supernatant to a new tube.
6. Repeat steps 4 and 5 (3x).
7. Transfer the aqueous phase to a new tube containing 900 µl of absolute isopropanol (cold), homogenize by inversion.
8. Incubate for 2 hours at –20 ºC.
9. Centrifuge for 15 minutes at 9,000 rpm and discard the supernatant.
*10. Wash the resulting pellet* with ethanol analytical grade (cold).**
11. Discard all the volume and incubate at 37 ºC for 15 minutes.
12. Add 100 µL of TE buffer and incubate for 1 hour at approximately 27 ºC.
13. Storage at – 10 ºC until use.

Method (Protocol)	CF	DF		GL	BD	OT	Methods mean (ng/µl)
	Total DNA amount (ng/µl)
	Mean ± SD
1. Doyle and Doyle (1987)DOYLE, J.J. and DOYLE, J.L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, vol. 19, pp. 11-15. http://dx.doi.org/10.12691/jfnr-2-7-6. http://dx.doi.org/10.12691/jfnr-2-7-6...	120±21.2	139±26.9	198±10.6	110±22	365±60.4	400±26.8	222
2. Medrano et al. (1990)MEDRANO, J.F., AASEN, E. and SHARROW, L., 1990. DNA extraction from nucleated red blood cells. Biotechnology, vol. 8, no. 1, pp. 43. PMid:2182076.	175±8.6	114±23.7	155±32.8	137±27.8	375±115.2	520±62.8	246
3. Whitmore et al. (1992)WHITMORE, D.H., THAI, T.H. and CRAFT, M., 1992. Gene Amplification Permits Minimally Invasive Analysis of Fish Mitochondrial DNA. Transactions of the American Fisheries Society, vol. 12, no. 2, pp. 170-177. http://dx.doi.org/10.1577/1548-8659(1992)121<0170:GAPMIA>2.3.CO;2. http://dx.doi.org/10.1577/1548-8659(1992...	116±18.0	74±19	173±35.3	125±6.5	335±70.3	455±48.8	216
4. Aljanabi and Martinez (1997)ALJANABI, S.M. and MARTINEZ, I., 1997. Universal and rapid salt-extraction of high-quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Research, vol. 25, no. 22, pp. 4692-4693. http://dx.doi.org/10.1093/nar/25.22.4692. PMid:9358185. http://dx.doi.org/10.1093/nar/25.22.4692...	181±17.3	90±12.3	120±33.2	110±12.6	455±60.1	465±50.9	237
5. Faleiro et al. (2003)FALEIRO, F.G., FALEIRO, A.S.G., CORDEIRO, M.C.R. and KARIA, C.T., 2003. Metodologia para operacionalizar a extração de DNA de espécies nativas do cerrado. Planaltina. Embrapa Cerrados, vol. 1, pp. 1-6.	168±39.9	150±24.5	205±28.1	155±10.6	425±20.4	505±63.9	268
6. Barrero et al. (2008)BARRERO, N.M.L., POVH, J.A., RIBEIRO, R.P., GOMES, P.C., JACOMETO, C.B. and LOPES, T.S., 2008. Comparison of DNA extraction protocols of fish fin and larvae samples: modified salt (NaCl) extraction. Ciencia e Investigación Agraria, vol. 35, pp. 65-74.	157±29.0	97±9.6	207±32.6	175±18.7	460±51.9	555±47.3	275
7. Coppini (2009)COPPINI, V.J., 2009. Variabilidade genética em Oligoryzomys nigripes através de marcadores RAPD e cariotipagem, tendo o rio Uruguai como barreira geográfica. Erechim: Programa de Pós-Graduação em Ecologia, Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões, Dissertação de Mestrado. [[Q7: Q7]]	186±6.6	160±44.4	170±19.1	135±1.6	330±17.1	516±22.2	250
8. Improved protocol (2020)	209±15.7	220±33.5	216±0.8	210±4.1	463±9.7	712±18.8	438
Tissues Mean	164	131	180	145	404	516	-

Method (Protocol)	CF	DF	MC	GL	BD	OT
	Absorbance ratio (OD 280/260 nm)						Methods Mean
	Mean ± SD						Methods Mean
1, Doyle and Doyle (1987)DOYLE, J.J. and DOYLE, J.L., 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, vol. 19, pp. 11-15. http://dx.doi.org/10.12691/jfnr-2-7-6. http://dx.doi.org/10.12691/jfnr-2-7-6...	1.5 ±0.016	0.8 ±0.08	1.4 ±0.08	1 ±0	1.9 ±0.08	1.8 ±0.12	1.4
2, Medrano et al. (1990)MEDRANO, J.F., AASEN, E. and SHARROW, L., 1990. DNA extraction from nucleated red blood cells. Biotechnology, vol. 8, no. 1, pp. 43. PMid:2182076.	1.8 ±0.08	0.6 ±0.08	1.6 ±0.08	1 ±0.08	1.4 ±0.08	1.6 ±0.08	1.3
3, Whitmore et al. (1992)WHITMORE, D.H., THAI, T.H. and CRAFT, M., 1992. Gene Amplification Permits Minimally Invasive Analysis of Fish Mitochondrial DNA. Transactions of the American Fisheries Society, vol. 12, no. 2, pp. 170-177. http://dx.doi.org/10.1577/1548-8659(1992)121<0170:GAPMIA>2.3.CO;2. http://dx.doi.org/10.1577/1548-8659(1992...	1 ±0.14	0.7 ±0.08	1.6 ±0.08	1.2 ±0	1.6 ±0.08	1.8 ±0.08	1.3
4, Aljanabi and Martinez (1997)ALJANABI, S.M. and MARTINEZ, I., 1997. Universal and rapid salt-extraction of high-quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Research, vol. 25, no. 22, pp. 4692-4693. http://dx.doi.org/10.1093/nar/25.22.4692. PMid:9358185. http://dx.doi.org/10.1093/nar/25.22.4692...	1.1 ±0.16	0.8 ±0.08	1 ±0.08	1 ±0	1.7 ±0.08	1.6 ±0.08	1.2
5, Faleiro et al. (2003)FALEIRO, F.G., FALEIRO, A.S.G., CORDEIRO, M.C.R. and KARIA, C.T., 2003. Metodologia para operacionalizar a extração de DNA de espécies nativas do cerrado. Planaltina. Embrapa Cerrados, vol. 1, pp. 1-6.	1.1 ±0.08	0.9 ±0.08	1.6 ±0.08	1.1 ±0.14	1.6 ±0	1.9 ±0.08	1.4
6, Barrero et al. (2008)BARRERO, N.M.L., POVH, J.A., RIBEIRO, R.P., GOMES, P.C., JACOMETO, C.B. and LOPES, T.S., 2008. Comparison of DNA extraction protocols of fish fin and larvae samples: modified salt (NaCl) extraction. Ciencia e Investigación Agraria, vol. 35, pp. 65-74.	1.1 ±0.08	0.9 ±0.08	1.3 ±0.08	1.2 ±0	1.8 ±0.08	1.7 ±0.08	1.3
7, Coppini (2009)COPPINI, V.J., 2009. Variabilidade genética em Oligoryzomys nigripes através de marcadores RAPD e cariotipagem, tendo o rio Uruguai como barreira geográfica. Erechim: Programa de Pós-Graduação em Ecologia, Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões, Dissertação de Mestrado.	1.5 ±0.08	1.1 ±0.12	0.8 ±0.08	1.1 ±0.08	1.6 ±0	1.8 ±0.08	1.3
8, Improved protocol (2019)	2 ±0	1.5 ±0.08	1.7 ±0.08	1.5 ±0.08	1.9 ±0.08	2 ±0.08	1.8
Tissues Mean	1.4	0.9	1.3	1.1	1.7	1.8	-

Primer	Sequence 5’ - 3’	Score of Amplified DNA bands
Primer	Sequence 5’ - 3’	40 ng/µl	20 ng/µl	10 ng/µl
OPW-01	CTCAGTGTCC	6	6	6
OPW-02	ACCCCGCCAA	6	8	8
OPW-03	GTCCGGAGTG	4	8	7
OPW-04	CAGAAGCGGA	7	9	7
OPW-05	GGCGGATAAG	4	4	-
OPW-06	AGGCCCGATG	7	8	-
OPW-07	CTGGACGTCA	7	8	-
OPW-08	GACTGCCTCT	5	5	-
OPW-09	GTGACCGAGT	6	6	-

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