Protocolo otimizado e validado para detecção do bivalve invasor <i>Limnoperna fortunei</i> de amostras de DNA ambiental de plâncton

Nós otimizamos uma metodologia para detecção do mexilhão-dourado em amostras de DNA ambiental de plâncton e a validamos em amostras de um reservatório no sul do Brasil. Limnoperna fortunei é uma espécie exótica invasora bem-sucedida que promove impactos significativos nos ecossistemas de água doce. Nós ajustamos e validamos a metodologia para detectar L. fortunei em amostras de plâncton em reservatório, através de ensaios com SYBR Green. O nível teórico mínimo de detecção de qPCR observado, com base na análise de curva padrão, foi de 0,0005625 ng.µL^-1 (R² = 0,99) em um ciclo de quantificação de 14,09–29,56. Nós também apresentamos um guia prático a ser utilizado no monitoramento da invasão de L. fortunei em bacias hidrográficas. A metodologia ajustada foi eficiente na detecção de L. fortunei e, portanto, pode ser usada para monitorar ambientes já infestados ou invasões em novos ambientes em larga escala.

Palavras-chave:
invasão biológica; biomonitoramento; mexilhão-dourado; qPCR; reservatórios

Autoria

Josiane Ribolli ^**e-mail: josianeribolli@gmail.com

Laboratório de Biologia e Cultivo de Peixes de Água Doce, Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Rodovia Francisco Thomaz dos Santos, 3532, CEP 88066-260, Florianópolis, SC, BrasilUniversidade Federal de Santa CatarinaBrasilFlorianópolis, SC, BrasilLaboratório de Biologia e Cultivo de Peixes de Água Doce, Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Rodovia Francisco Thomaz dos Santos, 3532, CEP 88066-260, Florianópolis, SC, Brasil

https://orcid.org/0000-0002-5553-9973

Sophia Cassol

https://orcid.org/0000-0002-9303-8870

Samara Hermes Silva

https://orcid.org/0000-0001-8549-8191

Evoy Zaniboni Filho

https://orcid.org/0000-0001-6457-2655

Flávia Lucena Zacchi

Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica, Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Servidão Caminho do Porto, S/N, CEP 88034-257, Florianópolis, SC, BrasilUniversidade Federal de Santa CatarinaBrasilFlorianópolis, SC, BrasilLaboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática e Imunoquímica, Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Servidão Caminho do Porto, S/N, CEP 88034-257, Florianópolis, SC, Brasil

https://orcid.org/0000-0003-1808-1390

Jacó Joaquim Mattos

Núcleo de Estudos em Patologia Aquícola, Universidade Federal de Santa Catarina, Servidão Caminho do Porto, S/N, CEP 88034-257, Florianópolis, SC, BrasilUniversidade Federal de Santa CatarinaBrasilFlorianópolis, SC, BrasilNúcleo de Estudos em Patologia Aquícola, Universidade Federal de Santa Catarina, Servidão Caminho do Porto, S/N, CEP 88034-257, Florianópolis, SC, Brasil

https://orcid.org/0000-0002-8766-4285

Grasiela Fagundes Minatto Cardoso

Engie Brasil Energia, Rua Paschoal Apóstolo Pítsica, 5064, Agronômica, CEP 88025-255, Florianópolis, SC, BrasilEngie Brasil EnergiaBrasilFlorianópolis, SC, BrasilEngie Brasil Energia, Rua Paschoal Apóstolo Pítsica, 5064, Agronômica, CEP 88025-255, Florianópolis, SC, Brasil

https://orcid.org/0000-0001-7505-3252

Alex Pires de Oliveira Nuñer

Programa de Pós-graduação em Aquicultura, Departamento de Aquicultura, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Rodovia Admar Gonzaga, 1346, Itacorubi, CEP 88034-000, Florianópolis, SC, BrasilUniversidade Federal de Santa CatarinaBrasilFlorianópolis, SC, BrasilPrograma de Pós-graduação em Aquicultura, Departamento de Aquicultura, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC, Rodovia Admar Gonzaga, 1346, Itacorubi, CEP 88034-000, Florianópolis, SC, Brasil

https://orcid.org/0000-0002-4682-3307

*e-mail: josianeribolli@gmail.com

Associate Editor: Victor Satoru Saito.

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Figuras (5)

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Figure 1
Sampling sites of eDNA plankton samples collected in the Itá reservoir, Upper Uruguay River, in Southern Brazil.

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Figure 2
(A) Quantitation curves of known amounts and (B) melting curves of known amounts to 45 (red), 4.5 (orange), 0.45 (blue), 0.045 (light green) 0.0045 (purple), 0.00225 (brown), 0.001125 (dark green), 0.0005625 (pink) ng of DNA/reaction of L. fortunei DNA. Negative controls are shown in black lines.

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Figure 3
A schematic figure with a practical guide to eDNA plankton sampling and qPCR analysis of Limnoperna fortunei: “A practical guide: eDNA plankton sampling and qPCR analysis of golden mussel, Limnoperna fortunei”. (1) Field sampling: Environmental DNA sampling using a plankton net (mesh opening of 53 μm), with a motor pump and a hose. Collect twice at the same sample site (filtering 200 L each) at two points (30 meters between each one) totalizing 400 L of water. Concentrate the sample in the same bottle; (2) Sample conservation in the field: Fix the collected sample with 96% ethanol in the proportion of 1:4 (sampling:ethanol). Keep the flasks with the samples in ice until getting to the laboratory. Store the sample in a freezer at -20 °C; (3) Sample filtration at the laboratory: Pre-filter the samples with a 100 μm net. Use the filtrate to filter in 0.22 μm smooth membrane filtrates, with the aid of a vacuum pump. Sterilize the materials between one filter and another (UV light); (4) DNA dilution: Extract the DNA from the membrane using a purification kit, following the manufacturer's recommendation. Quantify the total DNA extracted and standardize at 8.0 ng of DNA.µL^-1; (5) Real-time PCR: Perform the PCR reaction in a 20 µL in a final volume containing 10 µL of QuantiFast SYBR Green PCR Mix (Qiagen), 1.0 µL of Forward primer (20µM), 1.0 µL of Reverse primer (20 µM), 8.0 ng of eDNA/reaction, and 3.0 µL of RNAse free water (Qiagen) and the program as follows: 5 min at 95 °C, 35 cycles of 10 seconds at 95 °C, and 15 seconds at 60 °C.

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Figure 4
PCR Quantification cycle (Cq) vs. DNA concentration of known amounts (45, 4.5, 0.45, 0.045, 0.0045, 0.00225, 0.001125, 0.0005625 ng of DNA/reaction) of L. fortunei.

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Figure 5
Melting curves of eDNA plankton samples collected in the Itá reservoir, Upper Uruguay River, Southern Brazil. Blue lines represent positive samples, and red lines represent a negative sample for L. fortunei.

Figure 1 Sampling sites of eDNA plankton samples collected in the Itá reservoir, Upper Uruguay River, in Southern Brazil.

Figure 2 (A) Quantitation curves of known amounts and (B) melting curves of known amounts to 45 (red), 4.5 (orange), 0.45 (blue), 0.045 (light green) 0.0045 (purple), 0.00225 (brown), 0.001125 (dark green), 0.0005625 (pink) ng of DNA/reaction of L. fortunei DNA. Negative controls are shown in black lines.

Figure 3 A schematic figure with a practical guide to eDNA plankton sampling and qPCR analysis of Limnoperna fortunei: “A practical guide: eDNA plankton sampling and qPCR analysis of golden mussel, Limnoperna fortunei”. (1) Field sampling: Environmental DNA sampling using a plankton net (mesh opening of 53 μm), with a motor pump and a hose. Collect twice at the same sample site (filtering 200 L each) at two points (30 meters between each one) totalizing 400 L of water. Concentrate the sample in the same bottle; (2) Sample conservation in the field: Fix the collected sample with 96% ethanol in the proportion of 1:4 (sampling:ethanol). Keep the flasks with the samples in ice until getting to the laboratory. Store the sample in a freezer at -20 °C; (3) Sample filtration at the laboratory: Pre-filter the samples with a 100 μm net. Use the filtrate to filter in 0.22 μm smooth membrane filtrates, with the aid of a vacuum pump. Sterilize the materials between one filter and another (UV light); (4) DNA dilution: Extract the DNA from the membrane using a purification kit, following the manufacturer's recommendation. Quantify the total DNA extracted and standardize at 8.0 ng of DNA.µL^-1; (5) Real-time PCR: Perform the PCR reaction in a 20 µL in a final volume containing 10 µL of QuantiFast SYBR Green PCR Mix (Qiagen), 1.0 µL of Forward primer (20µM), 1.0 µL of Reverse primer (20 µM), 8.0 ng of eDNA/reaction, and 3.0 µL of RNAse free water (Qiagen) and the program as follows: 5 min at 95 °C, 35 cycles of 10 seconds at 95 °C, and 15 seconds at 60 °C.

Figure 4 PCR Quantification cycle (Cq) vs. DNA concentration of known amounts (45, 4.5, 0.45, 0.045, 0.0045, 0.00225, 0.001125, 0.0005625 ng of DNA/reaction) of L. fortunei.

Figure 5 Melting curves of eDNA plankton samples collected in the Itá reservoir, Upper Uruguay River, Southern Brazil. Blue lines represent positive samples, and red lines represent a negative sample for L. fortunei.

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