Terapia gênica para o diabetes

Resumos

A administração de insulina exógena tem sido a única forma de tratamento disponível para milhões de indivíduos portadores de diabetes mellitus do tipo 1 (insulino-dependente). Embora o transplante de pâncreas tenha sido empregado com sucesso para um número limitado de pacientes, ele ainda é considerado um procedimento invasivo com alto risco de complicações. Por outro lado, estudos preliminares onde o transplante de ilhotas pancreáticas foi realizado sem o emprego de glucocorticóides no esquema de imunossupressão demonstraram resultados extremamente promissores. Entretanto, o emprego de ilhotas pancreáticas, assim como o transplante de pâncreas, enfrenta o problema da escassez de órgãos disponíveis para transplante. Assim, um dos grandes objetivos da terapia gênica para diabetes é a geração de fontes ilimitadas de células que apresentem secreção normal de insulina em resposta ao estímulo da glicose, capazes de serem transplantadas sem a necessidade de imunossupressão sistêmica. Este artigo tem como finalidade revisar como a terapia gênica pode ser empregada na obtenção desta fonte de células, assim como discutir os últimos avanços no campo da biologia celular e molecular em relação ao crescimento e diferenciação da célula beta.

Terapia gênica; Diabetes mellitus; Célula beta

revisão

Terapia Gênica para o Diabetes

Carla Demeterco

Fred Levine

Unidade de Endocrinologia Pediátrica,

Departamento de Pediatria,

Universidade Federal do Paraná,

Curitiba, Brasil; e UCSD Cancer Center,

La Jolla, California, EUA.

Recebido em 11/11/00

Aceito em 10/01/01

RESUMO

A administração de insulina exógena tem sido a única forma de tratamento disponível para milhões de indivíduos portadores de diabetes mellitus do tipo 1 (insulino-dependente). Embora o transplante de pâncreas tenha sido empregado com sucesso para um número limitado de pacientes, ele ainda é considerado um procedimento invasivo com alto risco de complicações. Por outro lado, estudos preliminares onde o transplante de ilhotas pancreáticas foi realizado sem o emprego de glucocorticóides no esquema de imunossupressão demonstraram resultados extremamente promissores. Entretanto, o emprego de ilhotas pancreáticas, assim como o transplante de pâncreas, enfrenta o problema da escassez de órgãos disponíveis para transplante. Assim, um dos grandes objetivos da terapia gênica para diabetes é a geração de fontes ilimitadas de células que apresentem secreção normal de insulina em resposta ao estímulo da glicose, capazes de serem transplantadas sem a necessidade de imunossupressão sistêmica. Este artigo tem como finalidade revisar como a terapia gênica pode ser empregada na obtenção desta fonte de células, assim como discutir os últimos avanços no campo da biologia celular e molecular em relação ao crescimento e diferenciação da célula b.

Unitermos: Terapia gênica; Diabetes mellitus; Célula b.

ABSTRACT

Insulin injection has been the only treatment option for most of the millions of insulin-dependent diabetic individuals. Whole pancreas transplantation has been a successful approach for some patients. It is a complex operation with many potential complications. Recently, it was demonstrated that a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen led to remarkably successful islet transplantation. However, both pancreas and islet cell transplantation have to overcome the shortage of cadaveric pancreases that are available for transplantation. The ultimate goal of diabetes therapy is to generate an unlimited source of cells with glucose-responsive insulin secretion that can be transplanted without the need for systemic immunossuppression. The focus of this review is how gene therapy can be used in various approaches in order to develop such a source of cells. The recent advances in b-cell growth and development will also be discussed.

Keywords: Gene therapy; Diabetes mellitus; b-cell.

O TRATAMENTO DO DIABETES MELLITUS (DM) tem como objetivo a manutenção da normoglicemia frente às variações da ingesta alimentar. De acordo com resultados do Diabetes Control and Complication Trial (DCCT), o controle rigoroso dos níveis glicêmicos está associado à diminuição da incidência das complicações tardias. Entretanto, o regime rigoroso de administração de insulina leva a um aumento dos episódios de hipoglicemia (1). Devido a uma série de dificuldades técnicas, ainda não se dispõe de um sensor artificial capaz de infundir insulina em resposta às variações dos níveis glicêmicos (2-4). O transplante de células b parece ser a melhor solução para a restauração do controle fisiológico da glicemia. Há mais de trinta anos o transplante de ilhotas pancreáticas tem sido alvo de estudos (5). Entretanto, apenas na década de noventa puderam-se observar relatos de sucesso neste campo (6). O Islet Transplant Registry relatou que apenas 6% dos pacientes que receberam transplante de ilhotas entre os anos de 1990 e 1995 não necessitaram insulina exógena por um período de um ano (7). Isto se deve, em parte, aos efeitos tóxicos do esquema imunossupressor, especialmente dos esteróides, sobre a função das células b. Recentemente, o uso de um esquema de imunossupressão sem glucocorticóides determinou a obtenção de resultados extremamente promissores no transplante de ilhotas. Este estudo representa uma conquista na área de transplante de ilhotas pancreáticas pois todos os pacientes portadores de diabetes tipo 1 transplantados mantiveram normoglicemia sem o uso de insulina exógena durante pelo menos um ano pós-transplante (8). Neste momento vários centros de transplante de ilhotas ao redor do mundo estão empregando o mesmo protocolo, o que permitirá a obtenção de resultados de um grupo maior de pacientes. Entretanto, o número de doadores de pâncreas para o transplante de ilhotas está aquém do necessário para a cura de milhões de indivíduos portadores de diabetes insulino-dependente. Além disso, a autoimunidade e a rejeição pós-transplante ainda devem ser superadas. É fundamental, portanto, que se desenvolva uma fonte ilimitada de células capazes de secretar insulina em resposta à glicose e passíveis de serem transplantadas sem a necessidade de imunossupressão sistêmica.

TRANSPLANTE DE CÉLULAS COMO TERAPIA PARA O DIABETES

A cada ano nos Estados Unidos são registrados cerca de 30.000 novos casos de DM tipo 1 (9). Além disso, como um número considerável de indivíduos com diabetes tipo 2 poderiam ser candidatos ao transplante de células b. Entretanto, apenas cerca de 5.000 casos de morte cerebral considerados como potenciais doadores de tecido pancreático acontecem a cada ano (10). Diversas fontes de células podem ser apontadas como candidatas potenciais ao transplante celular na terapia do DM. O emprego do xenotransplante tem sido considerado, especialmente no que se refere às células b suínas. Embora a utilização deste tipo de células não apresente obstáculos quanto à disponibilidade de tecido, problemas como a rejeição imunológica e o risco de infecção pelo retrovírus porcino endógeno (PERV) ainda precisam ser resolvidos. Células humanas têm sido objeto de inúmeros estudos, sejam elas de origem pancreática ou extra-pancreática. O emprego de células humanas para este fim depende da capacidade de se expandir, in vitro, a limitada quantidade de tecido pancreático disponível. A expansão in vitro de células b primárias, ou seja, provenientes do tecido pancreático normal e sem manipulação genética, assim como de linhagens celulares obtidas a partir da célula b, representa um dos maiores desafios ao sucesso do transplante celular para DM. Isto se deve ao fato de que existe uma relação inversa entre a proliferação e diferenciação da célula b. As células tronco, assim como os precursores da célula b, e as células provenientes de linhagens celulares possuem uma alta capacidade de proliferação, enquanto que células b adultas raramente apresentam divisão celular. A utilização de células humanas de origem não pancreática tem sido considerada, mas, apesar de oferecer flexibilidade quanto à escolha do tipo de célula a ser empregada, enfrenta o desafio de ter que reproduzir o complexo aparato celular para secreção de insulina próprio da célula b. A estratégia de reposição de células para o tratamento do DM depende, portanto, da existência de uma fonte de células b diferenciadas e funcionais com a capacidade de se proliferar indefinidamente.

USO DE CÉLULAS b PANCREÁTICAS PARA TRANSPLANTE

Xenotransplante de células b pancreáticas

O xenotransplante, transplante de órgãos, tecidos ou células entre diferentes espécies, é uma das opções para o suprimento de células b. As células suínas têm sido consideradas como as mais apropriadas para este fim por possuírem características semelhantes às células b humanas, como, por exemplo, a secreção de insulina em resposta a níveis glicêmicos similares (11-14). O recente relato de clonagem de porcos vem a favorecer o uso de tecido suíno para transplantes (15). Entretanto, devido à sua baixa sobrevida em cultura in vitro, é extremamente difícil obter ilhotas suínas viáveis para o transplante (16,17). Além disso, o uso de ilhotas suínas tem maior risco de rejeição tardia ao xenotransplante (18-21) e de infecção pelo retrovírus porcino endógeno (PERV) (22). A criação de animais isentos do retrovírus demonstrou-se extremamente difícil devido à presença de múltiplas cópias do vírus integradas em seu genoma (23).

Expansão de células b e de seus precursores a partir de tecido primário

Embora as células b possuam como característica uma limitada capacidade de replicação, certos fatores de crescimento associados ao uso de matrizes extracelulares têm servido como estímulo à proliferação de células b adultas e de seus precursores. Entre estes, destaca-se o fator de crescimento de hepatócitos (hepatocyte growth factor/scattered factor ou HGF/SF) (24,25). Entretanto, o estímulo da proliferação da célula b é acompanhado pela perda do seu potencial de diferenciação, com conseqüente diminuição ou ausência da expressão de insulina (25,26). Outro obstáculo refere-se à limitada capacidade de expansão apresentada pelas células b. Depois de apenas 15 a 20 duplicações in vitro há uma interrupção no crescimento, a qual demostrou-se ser devida à senescência celular (25,27). A expansão de células primárias resulta no gradativo encurtamento de seus telômeros, com conseqüente aumento da expressão de um dos inibidores do ciclo celular, p16 INK4a (28). As células precursoras da célula b, por outro lado, não apresentam o limitado potencial replicativo encontrado nas células adultas, sendo consideradas como uma possível alternativa. Entretanto, os fatores envolvidos na proliferação e desenvolvimento dos precursores da célula b, assim como seus mecanismos de ação, ainda não foram totalmente identificados (25,29-32).

Células pancreáticas ductais representam uma outra fonte de tecido para transplante. A neogênese de células endócrinas a partir de ductos pancreáticos in vitro com o uso de matrizes especiais e de fatores de crescimento tem sido sugerida como forma de propagar ilhotas pancreáticas humanas, a fim de se aumentar a massa de tecido endócrino obtido de pâncreas de cadáveres (33). Células ductais provenientes do pâncreas humano foram direcionadas a se diferenciarem em células endócrinas quando expostas a diferentes fatores de crescimento e à cultura em Matrigel (34). Embora este estudo tenha demonstrado resultados promissores, o número de células obtidas, com capacidade de secretar insulina, ainda está aquém do necessário para fins de transplante.

Outra alternativa seria a do emprego de células tronco embrionárias ou embryonic stem cells. Estas células têm como vantagem a capacidade de se diferenciarem in vitro em diferentes linhagens celulares (35,36). O transplante intra-esplênico de células secretoras de insulina obtidas a partir de um clone proveniente de células tronco embrionárias normalizou a glicemia de camundongos com diabetes quimicamente induzida (37). Entretanto, cerca de 40% dos animais retornaram a apresentar hiperglicemia após 12 semanas do transplante. Infelizmente, nos 60% dos animais que permaneceram normoglicêmicos, o baço não foi removido ao final do experimento a fim de se afastar a possibilidade de regeneração pancreática. Não foi também esclarecido como a resposta imunológica foi controlada, já que nenhum esquema imunossupressor ou encapsulamento celular foi utilizado.

Ramiya e cols. relataram a obtenção de células secretoras de insulina a partir da cultura in vitro de células ductais provenientes do pâncreas de camundongos NOD (non-obese diabetic). O transplante destas células na região subcapsular renal de camundongos NOD levou à reversão do DM insulino-dependente (38). Devido ao fato do transplante não ter sido removido ao final do experimento, não foi possível afastar a possibilidade de que a normoglicemia tenha sido devida à regeneração de células autólogas. Por outro lado, é interessante mencionar que, embora as células tenham sido obtidas de camundongos NOD pré-diabéticos, os animais que receberam o transplante não desenvolveram DM. Isto significa que, teoricamente, células obtidas de um paciente recém diagnosticado com diabetes e submetidas à expansão em cultura in vitro poderiam ser transplantadas para o mesmo indivíduo sem o problema de rejeição.

DESENVOLVIMENTO PANCREÁTICO

O limitado potencial de replicação da célula b adulta despertou um grande interesse no estudo de seus precursores como fonte de tecido para transplante. Entretanto, embora as células precursoras possuam uma maior capacidade proliferativa, não apresentam as mesmas características funcionais da célula endócrina adulta. O desenvolvimento da célula pancreática endócrina depende de uma complexa interação entre sinais provenientes de fatores solúveis e matrizes extracelulares e de interações intercelulares que, por sua vez, irão regular os fatores de transcrição. O emprego de precursores da célula b para fins de transplante necessita, portanto, do completo entendimento de todos os fatores envolvidos no processo da diferenciação celular.

Do ponto de vista embriológico, o pâncreas é proveniente da porção duodenal superior do intestino embrionário, por meio de uma protusão do epitélio diretamente posterior ao estômago. Sua formação depende da interação de sinais intercelulares provenientes das células do endoderma e do mesoderma intestinais (39-41). Os genes responsáveis pela expressão de moléculas necessárias para o desenvolvimento da célula b são alvos potenciais para terapia gênica, pois estão envolvidos na promoção do desenvolvimento de precursores da célula b in vitro e in vivo.

Fatores de Crescimento e de Diferenciação

Com o intuito de se obter fontes de células produtoras de insulina para transplante, muita atenção tem sido direcionada para o entendimento dos sinais extracelulares que controlam o desenvolvimento da célula endócrina.

Entre os fatores de crescimento estudados, vários relatos têm apontado a importância da ativina no desenvolvimento pancreático. Camundongos transgênicos portadores de mutações no receptor da ativina apresentam hipoplasia das ilhotas pancreáticas (42). A folistatina, proteína carreadora da ativina, possui os mesmos efeitos repressivos do mesênquima na diferenciação das células pancreáticas endócrinas em ratos (43). A ativina interfere na diferenciação endócrina quando associada a outros fatores de crescimento. Mashima e cols. demonstraram que betacelulina, o fator de crescimento isolado de um tumor de células b em camundongos, foi capaz de converter células exócrinas AR42J em células secretoras de insulina, quando empregado juntamente com a ativina A (44). O mesmo resultado foi obtido com a associação do fator de crescimento dos hepatócitos (HGF-SF) e ativina A (45). A betacelulina pertence à família dos epidermal growth factors (EGF) e sua expressão foi demonstrada no pâncreas humano (46). A ausência de receptores para os EGF em camundongos resultou em anomalias na formação das ilhotas pancreáticas (47). É interessante mencionar que, em células humanas pancreáticas indiferenciadas, observaram-se efeitos distintos provenientes do uso da ativina A ou da betacelulina. A ativina A induziu diferenciação endócrina, enquanto que a betacelulina promoveu proliferação (29).

O fator de crescimento dos hepatócitos (HGF/SF) é uma proteína derivada do mesênquima que exerce efeitos nas células epiteliais quando acoplado ao seu receptor de membrana c-met. Altos níveis da expressão de ambos HGF/SF e de seu receptor c-met são encontrados durante o desenvolvimento pancreático nos seres humanos. Durante a puberdade e a vida adulta encontram-se ainda a expressão destas proteínas, porém em níveis bem mais baixos (48-50). O HGF/SF possui um efeito mitogênico em células epiteliais no pâncreas fetal humano, e o seu receptor c-met foi encontrado em células positivas para insulina (50). O aumento da expressão de HGF/SF em camundongos transgênicos estimulou a proliferação de células b e o número de ilhotas pancreáticas, com conseqüente hipoglicemia (51).

Outros fatores que possuem um papel importante no crescimento e na diferenciação endócrina incluem a prolactina e o glucagon-like peptide 1 (GLP-1). A prolactina foi descrita como potente ativador do crescimento de ilhotas in vitro (52). O GLP-1, por sua vez, induziu células exócrinas AR42J a se diferenciarem em células positivas para insulina, polipeptídeo pancreático e glucagon (53), assim como o seu análogo, exendin 4, estimulou a replicação e neogênese de células b em ratos diabéticos (54). Além disso, a ativação do receptor de GLP-1 exerceu um efeito sinérgico com o fator de transcrição PDX-1 e com o contato intercelular na ativação do gene da insulina numa linhagem de células b humanas (55).

Matrizes Extracelulares e Fatores de Adesão Celular

A diferenciação de tecidos durante o processo de desenvolvimento depende da expressão de moléculas reguladoras de interações intercelulares e interações entre a matriz extracelular e células (56,57). Moléculas de adesão celular pertencentes à superfamília de imunoglobulinas CAM e à família de calcium dependent cadherins exercem um papel importante no desenvolvimento pancreático (58,59). Demonstrou-se ainda que a expressão de conexina 43 promoveu a expressão do gene da insulina em uma linhagem celular derivada de insulinoma em ratos (60). A expansão in vitro de células pancreáticas endócrinas humanas tem sido favorecida com o uso de matrizes extracelulares, embora os sinais envolvidos neste mecanismo ainda não tenham sido identificados (24). Da mesma forma, o contato intercelular induz diferenciação em células pancreáticas primárias (26) assim como numa linhagem celular pancreática humana quando associado com a expressão do fator de transcrição PDX-1 (61).

Fatores de Transcrição

A indução da diferenciação em precursores da célula b ou em células extra-pancreáticas por meio da expressão de fatores de transcrição necessários para o desenvolvimento da célula b representa uma das possibilidades do emprego da terapia gênica em DM. Embora inúmeros avanços tenham ocorrido no estudo dos fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento pancreático, muitas lacunas ainda necessitam ser preenchidas (62-67).

O fator de transcrição PDX-1, também conhecido como IDX-1, IUF-1, STF-1 ou IPF-1, é encontrado no epitélio de onde se originam as evaginações pancreáticas durante o desenvolvimento embrionário (68). Camundongos homozigotos para mutações no gene PDX-1 apresentam agenesia completa do pâncreas, o que também foi encontrado em seres humanos (62,69). Além da ativação do gene da insulina, PDX-1 tem a capacidade de ativar outros genes fundamentais para as células das ilhotas de Langerhans tais como: GLUT 2, glicoquinase, polipeptídeo amilóide das ilhotas (IAPP) e somatostatina (70,71). Seres humanos heterozigóticos para mutações no gene PDX-1 apresentam MODY 4 (maturity-onset diabetes of the young) (72). Recentemente, a transferência hepática in vivo do gene PDX-1 em roedores resultou na obtenção de um pequeno número de células positivas para insulina (73).

A presença de MODY tem sido relacionada às alterações na expressão dos diferentes fatores de transcrição. MODY 1 e MODY 3 estão associados respectivamente a mutações nos genes hepatocyte nuclear factor-4a (HNF-4a) e HNF-1a; MODY 5 a mutações no gene HNF-1b; e MODY 2 a mutações no gene da glicoquinase (74-76).

Outros fatores de transcrição têm sido apontados como importantes para o desenvolvimento pancreático. Entre estes destaca-se o ISL1, cuja ausência em camundongos resulta na ablação do mesênquima dorsal pancreático, na falha de diferenciação das células exócrinas no pâncreas dorsal e na perda completa da diferenciação das ilhotas (63). Membros da família dos genes PAX, como PAX 6 e PAX 4, possuem também um papel na ontogênese pancreática. Deleções do gene PAX 6 em camundongos resultaram no número reduzido de todas as células do pâncreas endócrino, assim como na conseqüente diminuição da produção hormonal (66,77). Por outro lado, camundongos knockout para o gene PAX 4 apresentam completa ausência de células b e d associada a hiperplasia de células a (65).

Alguns dos membros da família de fatores de transcrição NK2 homeobox têm sido descritos como de grande importância para o desenvolvimento da célula b. A remoção do gene Nkx 2.2 em camundongos resulta na ablação de células b e num número reduzido de células secretoras de glucagon e de polipeptídeo pancreático (67). A expressão do gene Nkx 6.1 é encontrada apenas em células b e sua ativação foi demonstrada quando células derivadas de um tumor de ilhotas assumiram o fenótipo de células produtoras de insulina (64,78). Estudos em ratos demonstraram que Nkx6.1 é importante para o desenvolvimento pancreático, assim como para a função da célula b adulta (79). Recentemente, estudos em camundongos portadores de mutações em ambos Nkx6.1 e Nkx2.2 demonstraram que Nkx6.1 exerce sua ação no desenvolvimento da célula b downstream ao Nkx2.2 (80). NeuroD/Beta2 é um conhecido fator de transcrição do tipo basic helix-loop-helix (bHLH) encontrado em células pancreáticas endócrinas (81,82). Camundongos deficientes em NeuroD/Beta2 possuem um número reduzido de células endócrinas, especialmente células b (83). O papel dos fatores de transcrição bHLH no desenvolvimento endócrino a partir do endoderma sugere que a diferenciação destas células utilize mecanismos similares aos dos neurônios, como por exemplo o sistema de sinalização Notch (84). Estudos demonstraram que este sistema participa no desenvolvimento das células pancreáticas endócrinas, e que a ausência de um de seus ligantes, denominado Delta-like gene (85), ou de seu mediador intracelular Rpb-jk (86), resulta no aumento do número de células endócrinas pancreáticas (84). O mesmo fenótipo foi encontrado em camundongos onde um dos repressores de sinalização do Notch, Neurogenin 3, teve sua expressão aumentada (87,88). O sistema Notch possui um efeito antagônico nas proteínas bHLH que é devido, em parte, a um repressor da transcrição destas proteínas, denominado Hes-1 (89). Camundongos deficientes em Hes-1 apresentam hipoplasia pancreática severa devido à depleção de precursores pancreáticos epiteliais, causada pela diferenciação acelerada de células com expressão de glucagon. Hes-1, portanto, funciona como um regulador negativo da diferenciação endócrina a partir do endoderma (90).

LINHAGENS CELULARES PROVENIENTES DO PÂNCREAS ENDÓCRINO

O uso de linhagens celulares apresenta vantagens quando comparado ao uso de ilhotas ou células primárias. Linhagens celulares representam uma fonte de células com características estáveis e reproduzíveis. Oferecem ainda a possibilidade de serem modificadas in vitro por meio de transferência de genes, podendo ter suas propriedades optimizadas, além de não necessitarem do emprego de matrizes extracelulares ou de fatores de crescimento necessários para a expansão de células b primárias in vitro. O desenvolvimento de linhagens celulares a partir de células b tem sido extremamente importante no que se refere à ciência básica, pois representam excelentes ferramentas para a elucidação de mecanismos envolvidos na secreção de insulina em resposta ao estímulo da glicose, na transcrição do gene da insulina e no isolamento de genes específicos para o pâncreas (91-93).

O desenvolvimento de linhagens celulares a partir de tecido pancreático de roedores tem apresentado um progresso significativo ao longo dos anos (91,92,94-96). As fontes de onde estas linhagens celulares foram obtidas incluem: insulinomas de origem espontânea (97), insulinomas induzidos por carcinógenos (98), insulinomas induzidos por vírus oncogênicos (99,100), insulinomas induzidos pela combinação de carcinógenos e vírus oncogênicos (100) e insulinomas derivados de camundongos transgênicos, os quais expressam oncogenes dominantes, em especial o antígeno SV40 T sob o controle do promoter da insulina (101-103). As linhagens celulares mais amplamente estudadas referem-se àquelas derivadas de insulinomas induzidos por radiação obtidos de ratos albinos NEDH (New England Deaconess Hospital) (98), destacando-se: RIN (104), MSL (105), INS (94), e CRI (106).

Embora linhagens celulares derivadas de roedores representem um excelente sistema de estudo para várias finalidades, existem certas limitações com respeito ao seu emprego para fins de pesquisa básica ou clínica. Várias diferenças biológicas têm sido apontadas entre células b provenientes de roedores e de seres humanos. Roedores possuem duas cópias do gene da insulina enquanto que seres humanos possuem apenas uma cópia, além de existirem diferenças no padrão de regulação genética em relação ao promoter do gene da insulina (107). O gene GLUT 2, fundamental para o transporte de glicose nas células b de roedores, não parece possuir o mesmo grau de importância no ser humano (108,109). Demonstrou-se que existem diferenças na resposta às citoquinas inflamatórias entre ambas espécies (110), assim como a certos fatores de crescimento (24,31,111,112). Estas diferenças biológicas têm influenciado o estudo do desenvolvimento de linhagens de células b humanas.

Devido à grande dificuldade na obtenção de linhagens celulares provenientes de insulinomas espontâneos humanos (113-116), a maioria das linhagens de células b humanas têm sido desenvolvidas por meio da expressão de oncogenes (114,115,117,118). O uso de oncogenes proporciona vantagens no manejo de linhagens celulares, entre elas a possibilidade de escolha da célula primária de onde se deriva a linhagem. Além deste fato, o emprego de oncogenes conhecidos com efeitos definidos facilita o controle de seus efeitos no crescimento e diferenciação. Entre os oncogenes utilizados para a geração de linhagens celulares a partir de células b humanas ou a partir de seus precursores destacam-se o antígeno SV40T e o H-ras val12 (118-120). Embora a introdução destes permita a proliferação das células além de sua sobrevida esperada (121), após algum tempo em cultura estas células sofrem um processo denominado de "crise". Este é reconhecido como uma forma de senescência celular tardia (27), no qual observa-se uma parada no crescimento ou morte celular. A estratégia encontrada para se superar este problema baseia-se na restauração da atividade da telomerase por meio da introdução do gene da telomerase humana, especificamente a porção da transcriptase reversa (hTRT). Esta técnica, juntamente com a introdução dos oncogenes, possibilitou a imortalização celular (27).

Enquanto o uso de oncogenes associado à presença da telomerase permite a replicação indefinida das células, o mesmo exerce um profundo efeito repressor sobre sua capacidade de diferenciação. Entretanto, demonstramos que uma linhagem celular humana, TRM-6, derivada de ilhotas do pâncreas fetal, diferenciou-se numa linhagem de células d por meio da expressão do fator de transcrição PDX-1 juntamente com a promoção do contato intercelular (61). Da mesma forma, observamos a indução da secreção de insulina em resposta ao estímulo da glicose in vitro e in vivo numa linhagem celular derivada de células b purificadas a partir de ilhotas pancreáticas adultas humanas, denominada blox5 (55). Esta é a primeira descrição na literatura de uma linhagem celular de células b humanas funcionais e representa um marco na busca de fontes de células para a terapia do DM por meio de transplante celular.

A possibilidade do transplante de células transformadas e ou imortalizadas traz, porém, o risco de tumorogênese. Linhagens celulares derivadas tanto de roedores (91,122) como de seres humanos (114,115,117, 118) têm apresentado diferenciação, além de certa instabilidade fenotípica. Isto se deve ao fato de que estas células podem ter sua capacidade de diferenciação interrompida enquanto utilizam as funções necessárias para sua replicação. Além deste fato, mudanças fenotípicas podem ocorrer associadas à inerente instabilidade genética de células transformadas. A fim de se contornar este problema, têm sido desenvolvidas técnicas visando bloquear a expressão dos oncogenes logo após a obtenção de um número suficiente de células in vitro. Para isto, tem-se empregado o uso de promoters especiais para regulação da expressão da proteína do gene SVT40 (123). O promoter utilizado baseia-se no bacterial tetracycline (tet) operon (124). Outros promoters (117,118, 123,125,126) e sistemas, como por exemplo o cre-lox recombinase (27,127,128), o qual media a deleção completa dos oncogenes introduzidos, representam outras alternativas para a regulação da expressão de oncogenes. Estudos mostraram a deleção completa do gene SV40T de uma linhagem celular de hepatócitos humanos, com o emprego do sistema cre-lox, previamente ao transplante em ratos (129). Outra técnica consiste no uso de genes "suicidas" como, por exemplo, o gene herpesvírus tirosino quinase (TK), o qual torna as células susceptíveis ao ganciclovir (130).

ENGENHARIA GENÉTICA DE CÉLULAS EXTRA-PANCREÁTICAS

O interesse no estudo de células extra-pancreáticas como fonte de tecido para transplante em diabetes deve-se ao número insuficiente de doadores de pâncreas e ao risco de recorrências de resposta autoimune contra as células b transplantadas (131-134). Vários obstáculos devem ser contornados a fim de se obter células de origem não pancreática com capacidade de sintetizar e secretar insulina de modo fisiológico. Um dos maiores problemas refere-se ao processo de síntese da proinsulina, seu armazenamento em grânulos e sua secreção em resposta à glicose. O uso de promoters específicos tem permitido a expressão da preproinsulina em células extra-pancreáticas (135-137). Entretanto, células não originárias da linhagem neuroendócrina, como por exemplo fibroblastos ou miócitos, não possuem as endopeptidases necessárias para a clivagem da proinsulina em insulina. A fim de resolver este problema, o ponto de clivagem da proinsulina foi modificado, o que possibilitou sua clivagem por outra endoprotease, furina, a qual é encontrada na maioria das células (138,139).

A necessidade de se reproduzir, por meio de manipulação genética, todo o complexo aparato necessário para a secreção de insulina em resposta ao estímulo da glicose, levou ao estudo de células que possuem originalmente algumas das características das células b, tais como as células hipofisárias, adrenais e hepáticas. Células neuroendócrinas como as encontradas na hipófise ou na glândula adrenal possuem o aparato necessário para a secreção de hormônios polipeptídeos em resposta a estímulos externos. A maioria dos estudos em células neuroendócrinas tem sido realizada em células derivadas de um tumor de células pituitárias corticotróficas de camundongo, denominada de AtT20 (135,140). Estas células apresentam endoproteases PC2, PC3 (141) assim como glicoquinase (142), porém são deficientes em GLUT2. A expressão de GLUT 2 em células AtT20 promoveu a secreção de insulina em resposta à glicose, mas em níveis aquém do esperado do ponto de vista fisiológico (143,144). A expressão in vivo de GLUT2 e glicoquinase em células pituitárias de camundongos NOD resultou no controle da hiperglicemia nestes animais, entretanto sem resposta fisiológica da secreção de insulina à glicose (145).

Os hepatócitos, por outro lado, apresentam a capacidade de responder às variações dos níveis da glicemia pois possuem a expressão de GLUT 2 e glicoquinase. Entretanto, estas células não dispõem do aparato necessário para a secreção regulada de insulina, o que resulta na liberação contínua de proinsulina (132,136). A introdução in vivo do fator de transcrição PDX-1 em células hepáticas de roedores com DM induzido quimicamente, resultou na ativação endógena de ambos os genes da insulina, assim como das endoproteases PC1 e PC3. Embora se tenha observado o controle da hiperglicemia nestes animais, as células responsáveis por esta resposta não foram bem caracterizadas, não se podendo afirmar, portanto, que tenham sido hepatócitos (73).

PERSPECTIVAS

Nos últimos vinte anos observou-se um crescente interesse no estudo do transplante celular para o tratamento do DM. O sucesso desta forma de terapia representaria a cura do DM com o fim de injeções, da monitorização da glicemia e do controle da dieta na tentativa de se manter a homeostase metabólica e de se reduzir a ocorrência das complicações tardias. Um grande esforço tem sido dedicado no desenvolvimento do transplante de ilhotas pancreáticas. Recentemente, observamos resultados extremamente encorajadores obtidos pelo grupo da University of Alberta, no Canadá (8). Entretanto, a escassez de tecido primário ainda representa um importante obstáculo que deve ser superado, tornando-se um dos maiores alvos para a terapia gênica nesta área. A dificuldade em se reproduzir as complexas funções da célula b torna o desenvolvimento de células secretoras de insulina a partir de células extra-pancreáticas uma tarefa extremamente árdua. Embora importantes avanços tenham ocorrido quanto à expansão in vitro de células primárias, o limitado entendimento da biologia da célula b ainda impede sua utilização em larga escala. A obtenção de células a partir de células tronco constitui uma alternativa extremamente interessante, mas ainda enfrenta os mesmos obstáculos quanto ao insuficiente conhecimento do desenvolvimento da célula b. Embora a geração de linhagens celulares represente uma alternativa promissora, os problemas técnicos associados ao risco proveniente do emprego de oncogenes ainda devem ser superados. Enfim, a chave para a obtenção de uma terapia de reposição celular efetiva para DM dependerá, portanto, do melhor entendimento dos processos de crescimento e diferenciação da célula b.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi financiado pelo NIDDK (DK 55065 and DK 55283), pela Juvenile Diabetes Foundation (197035) e pela Stern Foundation (Fred Levine), e pela Universidade Federal do Paraná (Carla Demeterco).

Esta revisão foi baseada no artigo "Gene Therapy for Diabetes", escrito pelos mesmos autores, atualmente em processo de revisão pela revista Frontiers in Bioscience.

Endereço para correspondência:

Carla Demeterco

10901 N. Torrey Pines Rd.

Building Seven, First Floor

UCSD Cancer Center

92.093-0912, La Jolla, CA, USA

FAX: [phone]

e.mail: [e-mail]

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  29 Jun 2001
• Data do Fascículo
  Fev 2001

Histórico

• Aceito
  10 Jan 2001
• Recebido
  11 Nov 2000