Abstract Algal polysaccharides exhibit a wide range of biological activities and potential applications. Many of these bioactivities correlate positively with the presence of sulfate groups on the polysaccharides. The most common method used for sulfate quantification in algal samples is the turbidimetric method using the barium chloride-gelatin reagent. However, the original procedure is difficult to adapt for routine analysis since it is laborious and time-consuming. An optimized method was established using 96-well microplates, with the advantage of reducing waste and discrimination between organic and inorganic sulfates. This proposed method produced the same accuracy as the original.

Clorofila a e carotenoides são importantes pigmentos da fotossíntese. Na literatura são encontrados vários protocolos de extração e análise desses pigmentos utilizando, principalmente, plantas vasculares. O objetivo deste estudo foi padronizar uma metodologia de extração e análise dessas substâncias em uma macroalga vermelha, Gracilaria tenuistipitata var. liui. Amostras de talos gametofíticos cultivados in vitro foram trituradas em nitrogênio líquido, extraídas em 1,5 mL de solvente, centrifugadas e os pigmentos analisados quantitativamente e qualitativamente através de espectrofotometria de UV/visível, cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) e CLAE-acoplada a espectrometria de massas (CLAE-EM). Foram testados os parâmetros massa mínima, solvente para extração e número de extrações. Dentre os solventes testados, o metanol foi o mais eficiente, sendo 50mg de material fresco a massa mínima indicada para ser submetida a somente uma extração. Não foram encontradas diferenças significativas na quantificação desses pigmentos comparando-se os dados obtidos em espectrofotometria de UV/visível com os de CLAE. No entanto, para a identificação dos diferentes carotenoides e suas quantificações são necessárias CLAE ou CLAE-EM.

Chlorophyll a and carotenoids are important pigments in photosynthesis. Several studies have been published describing extraction and analysis protocols of these pigments, mainly in vascular plant species. This study standardizes an extraction and analysis protocol of these substances in Gracilaria tenuistipitata var. liui, a red seaweed. Apical portions grown in vitro were triturated in liquid nitrogen. Extracts were prepared in 1.5 mL solvent and centrifuged. Quantitative and qualitative analyses of pigments were performed by UV/visible light spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC) and HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC-MS). The parameters assessed were: minimum biomass, best extraction solvent, and number of extraction steps. Methanol was the most efficient solvent, and 50 mg fresh biomass was the amount of sample indicated, submitted to one single extraction step. No significant differences were observed in levels of these pigments by UV-visible light spectrophotometry and HPLC. However, HPLC or HPLC-MS are required to identify the different carotenoids present in this seaweed species.

A enzima nitrato redutase (NR) catalisa a redução do nitrato a nitrito e controla a taxa de assimilação do nitrato. O ensaio in vitro da nitrato redutase foi otimizado para a linhagem selvagem (marrom, MA) e para a linhagem deficiente em ficoeritrina (verde-clara, VC) de Hypnea musciformis. As duas linhagens foram cultivadas em temperatura de 23 ± 2°C, fotoperíodo de 14 horas, irradiância de 60-90µmol fótons m-2s-1, e meio composto por água do mar esterilizada (30ups) enriquecida com a solução de von Stosch na concentração de 50% (VSES/2). As condições ótimas de ensaio para ambas as linhagens foram: 40µM de NADH; 10min de incubação do extrato bruto (EB) e 100µL de EB. A atividade ótima da NR ocorreu em 4 e 2mM de nitrato para a linhagem VC e MA, respectivamente. As linhagens VC e MA apresentaram, respectivamente, constante aparente de Michaelis-Menten (K M) para NADH de 0,2068 e 0,0837 µM, e K M para nitrato de 0,0492 e 0,0294mM. Os resultados indicam que a NR da linhagem MA tem maior afinidade pelo substrato do que a NR da linhagem VC de H. musciformis. Os experimentos para avaliar os efeitos da disponibilidade de nitrato (5 a 105µM) e nitrato e fosfato (0,5 a 25,5µM, com a relação N:P de 4:1) mostraram que a atividade da NR das linhagens VC e MA não aumentou com a adição de nitrato no meio, o que pode estar relacionado com o estado nutricional dessas algas. A atividade da NR foi maior nos tratamentos com adição de fosfato do que naqueles com adição de apenas nitrato, indicando que esse nutriente é importante para os processos metabólicos relacionados a atividade da NR.

The enzyme nitrate reductase (NR) catalyzes the reduction of nitrate to nitrite and controls the rate of nitrate assimilation. The in vitro assay of NR was optimized for the wild strain (brown, MA), and the phycoerythrin-deficient strain (light-green, VC) of Hypnea musciformis. Both strains were cultured at temperature of 23 ± 2°C, photoperiod of 14h, irradiance of 60-90 µmol photons m-2s-1, with medium composed by sterilized seawater (salinity 30 psu) with 50% von Stosch's enrichment solution (VSES/2). The optimal conditions for in vitro assay of NR were: 40µM of NADH; 10min of incubation of crude extracts (EB), and 100µL of EB to both strains. Optimal activity of NR occurred at 4 and 2mM of nitrate to the VC and MA strains, respectively. The VC and MA strains showed, respectively, Michaelis-Menten constants (K M) for NADH of 0.2068 and 0.0837µM, and K M for nitrate of 0.0492 and 0.0294mM. The results indicate that the NR of MA strain has higher affinity by the substrate than the NR of VC strain of H. musciformis. Experiments on the effects of availabilities of nitrate (5 to 105µM) and nitrate and phosphate (0.5 to 25.5µM, with a N:P relation of 4:1) showed that NR activity of VC and MA strain did not increase with the addition of nitrate to the medium, what can be related with their nutritional state. The NR activity was higher in treatments with phosphate addition than those with only nitrate addition, indicating that this nutrient is important to metabolic processes related to the NR activity.

A alga vermelha Gracilaria caudata J. Agardh tem sido utilizada no Brasil para a extração de ágar, principalmente no Nordeste do país. Na água do mar, a disponibilidade de nitrogênio é o principal fator abiótico que limita o crescimento de macroalgas. A enzima nitrato redutase (NR) é o ponto chave na regulação da assimilação do nitrogênio em organismos fotossintetizantes. Este estudo descreve o ensaio in vitro para caracterizar a atividade enzimática da NR em termos de constantes cinéticas e estabilidade, avalia sua oscilação ao longo do dia e a influência da glicose na modulação dessa enzima. Picos máximos de atividade da NR foram observados a 20 ºC e pH 8,0. A estabilidade enzimática do extrato bruto armazenado a 3 ± 1 ºC foi significativamente reduzida após 48 horas. As constantes aparentes de Michaelis-Menten (K M) para NADH e nitrato foram 22 µM e 3,95 mM, respectivamente. A atividade da NR apresentou oscilação sob fotoperíodo de 14 horas de luz e10 horas de escuro com três vezes mais atividade durante a fase de luz, apresentando seu máximo após 10 horas de luz. Sob condições ótimas de ensaio, a atividade máxima foi de 92,9 10-3 U g-1. A adição de glicose induziu a atividade da NR durante as fases de luz e de escuro, evidenciando uma via de modulação dessa enzima pela fotossíntese. Essa relação pode ser explicada pela necessidade de esqueletos de carbono, fornecidos pela fotossíntese, para incorporar os metabólitos intermediários da via de assimilação do nitrato, evitando assim a toxicidade intracelular pela acumulação de nitrito e amônio. A otimização dos protocolos de ensaio enzimático para NR é essencial para estabelecer condições apropriadas para estudos nutricionais, comparar diferentes grupos taxonômicos, e entender os mecanismos de sua regulação.

The marine red alga Gracilaria caudata J. Agardh has been used in Brazil for agar extraction, mainly in the northeast region of the country. Nitrogen availability is the most important abiotic factor in seawater that limits the growth of seaweeds. The enzyme nitrate reductase (NR) is the key regulatory point in the nitrogen assimilation in photosynthetic organisms. This study describes an in vitro assay, characterizing the enzymatic activity of NR in terms of kinetic constants and stability, its oscillation during the day and glucose effect on NR modulation. Maximal peaks of NR activity were recorded at 20 ºC and pH 8.0. The enzymatic stability in crude extracts stored at 3 ± 1 ºC decreased significantly after 48 hours. Apparent Michaelis-Menten constants (K M) for NADH and nitrate were 22 µM and 3.95 mM, respectively. Gracilaria caudata NR activity showed an oscillation under light:dark photoperiod (14:10 hours LD) with 3-fold higher activity during the light phase, peaking after 10 hours of light. Under optimal assay conditions, the maximal activity was 92.9 10-3 U g-1. The addition of glucose induced the enzymatic activity during the light and dark phase, evidencing a possible modulation of this enzyme by the photosynthesis. This relationship can be explained by the need of carbon skeletons, produced by the photosynthetic process, to incorporate the intermediary metabolites of nitrate assimilatory pathway, avoiding the toxic intracellular accumulation of nitrite and ammonium. The optimization of enzymatic assay protocols for NR is essential to establish appropriate conditions to study nutritional behaviour, compare different taxonomic groups and to understand its regulatory mechanism.